全 文 ：药物分析杂志 h Ci nJh P a m rA na lZ以科
,
24 ( 6 )
黄连花皂昔类成分 H P L C 一 E L S D 法分析 ’
田景奎 徐丽珍 邹忠梅 张宏武 穆红梅 杨世林
( 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所 北京 1。以为 4 )
摘要 目的 :建立黄连花皂昔类成分 H PL C 分析方法 。 方法 :应用 H P L C 一 E岱 D 对黄连花分离得到的 9 种皂昔进行分析测定 ,
以 z or bax SB 一 C I , ( 4 . 6 m m x 150 m m , 5 卜m ) 为分析色谱柱 , 以乙睛 一 水 (含 0 . 2% 醋酸 ) 为流动相梯度洗脱 , 流速 1 m L ·
m in
一 ’ , 蒸发光散射检测器 , 雾化气体流速 3 . 35 L · m in 一 ’ , 漂移管温度 117 ℃ 。 结果 : 9 种皂昔能较好地分离 , 通过对黄连花全
草进行分析 ,表明 irP m ul an in 和黄连花皂昔 (L d va u血 os id e L )含量较高。 结论 : H PCL 一 ELS D 适合没有紫外吸收或紫外吸收弱
的皂昔类成分的分析 。
关键词 黄连花 黄连花皂昔 H P CL 一 E IS D
A n a l y s is o f ht e S a P o in ns I
s o l a t e d fr o m
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a c h勿 而 v u icr a L .
竹 AN Ji n g 一 k u i , X U I J i 一 z h e n , ZO U Z h o n g 一 m e i , Z H人N G
b y H P L C 一 E L S D
H o n g 一 w u , M U H o n g 一 m e i an d YA N G S h i 一 li n
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“ et of Me d ic an l lP an
t D , loP me 瓜
,
eP ik gn nU 必 n Me d ica l oC l啼。 & ch i~ cA a de 卿 of 从 e汉ic al cs ic~ , Be 乒gn 10( 刃9 4
A b s t r a e t O 讨ce it ve : oT e s tah l i s h a m e th o d of r q u a n ti t a ti v e a n a l y s i s of th e s aP on i n s in ysL im灌记 h ia da o iur a L
,
M e th o d s
: H PL C
一 E玲D w a s u s e d fo r an al y z i n g 9 s a p o n i n s i s o l at e d fI’O m ysL im a e丙i a d o u irc a L . , w i th ht e Z o ht ax
S B 一 C , : e o l u m n , 5 林m ( 4
.
6 m m x 15 0 m m )
, a n d a e e t o n i tir l e 一 w a t e r (
e o n ta i n e d 0
.
2% H A e ) 『a d i e n t e l u t io n , fl o w
ar te 一 0 m L · m i n 一 ` . R e s u l st : 9 5即 o n i n s w e er i s o la t e d . hT or u gh a n a l y z i n g w h o l e h e ht o f ysL i n以火ia d二u icr a L
. ,
e o n te n t s of p r im u l a n i n a n d d a v u ir e o s id e L w e er h ihg
e r t h a n o th e sr
.
C o n c lus i o n : H PL C
一 E SL D e a n b e a p p l i e d to
a n a
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z e e o n s t iut e n t s w it h n o UV a b s o rp t io n
.
K e y w o r ds ysL
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mac
h记 d o u icr a , s即 o n i n s , H P I JC 一 ELS D
黄连花 ( srL ialn ch ia d a 彩u irC a L
.
) 系报春花科珍
珠菜属植物 , 民间用 以治疗高血压 二’ , , 已经报道其
所含皂昔具有较强的抗肿瘤活性 t ’ 二。 皂昔极性大 ,
结构近似 ,分离困难 ;多数皂昔只有末端紫外吸收或
无紫外吸收 ,检测时受到限制 。 关于皂昔的定性定
量分析 ,除对人参皂昔研究较多外 ,其他相关报道较
少 〔’ j 。 本文报道应用蒸发光散射检测器 ( E sL D )对
黄连花所含皂昔类成分进行 H P LC 分析 。
1 仪器与试药
W at e sr 6X() 高效液相色谱仪 , E SL D 检测器 , iM l -
l e n i u m 32 数据处理软件系统 。
乙睛 ( C H 3 C N )为色谱纯 (美国 F i s h e r 公司 ) ; 甲
醇 ( M e O H )为色谱纯 (天津康科德公司 ) ;双蒸水 ,其
他试剂均为分析纯 。
9 种皂昔对照品均由作者 自黄连花中分离得
到 , 9 种皂昔经光谱鉴定 、 H P LC 面积归一化法分析
为单一化合物 ,纯度均在 98 % 以上 。 分别为黄连花
皂昔 M ( d va u ir co is de M , 化合物 1 ) 、 黄连花皂昔 L
( d a v u it e o s i d e L
,化合物 2 ) 、黄连花皂昔 H ( d a v u ir e o -
s id e H
,化合物 3 ) 、黄连花皂昔 K ( d a v u ir e o s id e K ,化
合物 4 ) 、 p ir m u lan i n A (化合物 5 ) 、 p ir m u l a n i n (化合
物 6 ) 、 d e gl u e o e y e lam i n ( 化合物 7 ) 、 黄连花皂昔 C
( d a v u ir e o s id e C
,化合物 8 ) 、黄连花皂昔 D ( d a v u ir e o -
s id e D
,化合物 9 ) (图 1 ) , 其中 1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 9 均为新
化合物 ;黄连花采自吉林省安图县 ,原植物由本所郭
宝林博士鉴定为 xsL ima hc ia d。 “ icr a . 跳 d eb . 的干燥
全草 。
2 方法与结果
2
.
1 色谱条件 色谱柱为 oZ br ax BS 一 C l : , 5 林m , .4 6
~
x 巧。 ~ ( A isl en t 公司 ) ;流动相为乙睛 一水 〔含
0
.
2% 醋酸 )梯度洗脱 , , 洗脱方式为 6( 连续梯度 ,见
表 1 ) ,流动相流速 l mL · m i n 一 ’ ,检测器参数 :雾化气
体流速 3 . 35 L · 而 n 一 ’ ,漂移管温度 1 17 ℃ 。
* 国家自然科学基金项目 ( 39 87 0 85 )和国家 “ 九五 ” 攻关课题 (96 一 901 一 06 一 3 7)
DOI : 10. 16155 /j . 0254 -1793. 2004. 06. 004
药物分析杂志C 址 nJP h rt a nA nl s Z以 M
,
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化 砒沟若 戴赢 -程 ’
d va ur i e o
s i d e M * ( 1 )
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da v u r i e o s i d e K* (4)
图 1 9种皂昔对照品结构图 (带 * 为新化合物 )
F ig l
表 1 乙肠 一水梯度洗脱表
肠 e 。 utr c t u找拍 of g sa 卯址 sn ( ~ c o m卯 u n d s w i th * )
2 0 d
,测定结果不变 ,表明 9 种皂昔在甲醇溶液中均
T曲 I A伙加耐州曲 一 w侧比r g ar 山 e n t
时间( 6毗 ) /面n 乙睛(欧切苗颐le ) 水( , 川耽 )
0 17 8 3
5840542印95印70乃
80 17 83
稳定 。 9 种皂昔对照品在混合对照品溶液中的浓度
见表 2 。
裹 2 混合对照品中各皂昔的皿 t (W》及浓度 《C 》
T曲 Z T、 e 切 e i日以 《W )皿 d c o . 沈 . t“ 旧0 . ( C )
of aS OP n “ IS 加 翻卯刘面 m h 加 r e
化合物 (加口钾即 d ) 聆哪 c/ 此 · mL 一 ,
1 0
.
92 5 1
.
1
2 1
.
34 74
.
4
3 1
.肠 58 . 9
4 0
.
92 5 1
.
1
n6004.574又以0398L欣
2
.
2 皂昔混合对照品溶液的制备 精密称取各皂
昔对照品约 l gm (表 2 ) ,分别用 90 % 甲醇定容于 2
mL 量瓶中 , 密闭 , 放置待用 。 用微量注射器 ( 10
林L ) ,分别精密吸取上述 9 种对照品溶液各 10 p L ,
置于 1 m L 的量瓶中 ,用 90 % 甲醇定容 ,摇匀 。 精密
吸取混合对照品溶液 20 卜L ,注人液相色谱仪 ,按上
述色谱条件测定 (见图 2 ) 。 混合对照 品溶液放置
9 1
.
17 65
.
6
药物分析杂志 Ci hnJ P h ~ An a lZ 仪科
,
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l
昔对照品溶液 20 卜L , 在选定的色谱条件下进行分
离 ,重复进样 5 次 ,计算 R s D ,各皂昔 R s D < 5 . 0% 。
2
.
5
.
2 稳定性实验 精密吸取同一新制备的供试
品溶液 20 林L ,每隔 6 h 进样 1次 ,共进样 7 次 ,测定
化合物 2 和化合物 6 平均峰面积积分值 , R SD 分别
为 0 . 9% 和 1 . 3% , 表明该提取液稳定性良好 。
2
.
5
.
3 线性关系考察 分别精密吸取 “ 2 . 2 ” 项下
混合对照品溶液 10 , 20 , 30 , 40 , 50 , 10 卜L ,加 90 %
甲醇定容成 1 m L ,分别进样 20 林L ,按上述色谱条件
测定峰面积 ,结果以进样量为横坐标 ( X ) , 以峰面积
值为纵坐标 (均进行线性回归 , 9 种皂昔的回归方程
见表 3 。
表 3 , 种皂昔的回归方程
T ab 3 D a场 of 侧目 ib阳 t io n cu r v e s o f , 阳 p o画 sn
s o t /一 主n
图 2 混合对照品 ( A ) 、黄连花样品 ( B ) 、
样品局部放大 ( C )色谱图
Fi g 2 Ch n
几 n a卜!睽 a ll l s Of r e fe , n c e s u玩 *即 e e s ( A ) ,
s a n l l〕 l e ( B ) an d e d a l群 p斌 Of s am p l e ( C )
1
. 黄连花皂昔 M ( d a v u五co s id e M , z )
2
. 黄连花皂昔 L ( d a v-u 找e o s id e L , 2 )
3
. 黄连花皂昔 H ( d a vu ir e o s id e H , 3 )
4
. 黄连花皂昔 K ( d va u ir e o s id e K , 4 ) 5 . p ir m ul 即i n A ( 5 )
6
.
p6 mu lan i
n ( 6 ) 7
.
d e少 e o e y c lan “ n ( 7 )
8
. 黄连花皂昔 c ( d va u ir e o s id e C , s )
9
. 黄连花皂昔 D ( d a v l l ir c o s id e n , 9 )
2
.
3 黄连花供试品溶液的制备 取干燥黄连花全
草 ,粉碎过 40 目筛 ,备用 。 精密称取该粉末约 5 9 ,
放人 10 m L 圆底烧瓶中 ,加人 90 % 甲醇 40 m L 回
流提取 2 次 ,每次 l h , 合并滤液 , 回收溶剂 ,得干浸
膏 0 . 95 9 , 出膏率 19 . 0% ,粗浸膏以少量 90 % 甲醇
溶解 ( 5 m L ) , 经 S e p h ad e x LH Zo 柱层析 ( 2 0 m m x
7 0 m m
,
hP ~ ac
i a 公司 ) , T L c 监测 , 将总皂昔与其
他成分分离 ,总皂昔 以 90 % 甲醇溶解 ,定容于 5 m L
的量瓶中 (相当于生药 1 9 · m L 一 ’ ) ,应用时经 0 . 45
卜m 滤膜过滤 。
2
.
4 色谱峰的归属 实验中 ,通过单个皂昔对照品
溶液 10 林 L ,添加混合对照品溶液 10 林L 进行分析 ,
进行各皂昔峰定位 。
2
.
5 方法学考察
2
.
5
.
1 精密度实验 精密吸取 “ 2 . 2 ” 项下混合皂
化合物 回归方程
(~
户〕山】d ) (找 ,『 e g s卫叩 创和肋朋 )
I y 二 9
.
62 3 x 10
一 ZX + 2
.
2朋 x 10 一 1 1. (拟刃
Z Y 二 8
. 田 5 x 10 一 ZX + 2 . 9 8 x l 0 一 1 0 . 哭颐 )
3 Y 二 9
.
09 1 火 10 一 ZX + 2闷闷石 x 10 一 1 0 . 卿为
4 Y 二 8
.
675 x 10
一
X2
+ 2
,
64 3 x 10
一 ’ 0
.
(沙%
S Y
二
8
.
527
x 10
一 ZX + 2
.
7 11 x lo
一 是 0
. 卯9 8
6 Y
二
8
.
25 2 x 10
一 ZX + 2 860 x 10
一 1 0
. 卯9 8
7 Y二 7
.
4 16 x 10
一 ZX + 3 326 x l o
一 1 0
.
1刃望〕
S Y 二 9
.
3 16 x 10
一
X2
+ 2
.
33 7 x 10
一 ’ a 更刃8
g Y 二 8
.
034 x 10
一扮 + 2 . 97 7 x 10 一 ’ 0 . 奥玲6
2
.
5
.
4 加样回收实验 精密称取干燥黄连花粉末
约 5 9 ,放人 10 m L 圆底烧瓶中 ,分别精密加人化合
物 2 为 Z mg 和化合物 6 为 3 m g ,按 “ 2 . 3 ” 项下处理
并测 定 , 加 样 回收率 ( n = 5 ) 分别 为 % . 8% 和
10 2
.
5%
,
R SD 分别为 4 . 0% 和 2 . 5% 。
2
.
6 黄连花样品的测定 采用外标法 ,色谱条件同
“
2
,
1 ” 项 , 注人供试品溶液 40 林L ,进行含量测定 。
根据表 3 中相应回归方程计算出样品含量 ,结果样
品中化合物 1 , 2 , 6 , 7 , 8 , 9 含量分别为 0 . 0 25 % ,
0
.
1 2 8 1%
,
0
.
3 3 5 0 %
,
0
.
0 1 3 1%
,
0
.
0 7X() %
,
0
.
0 540 %
。 色谱图见图 2 一 C 。
3 讨论
3
.
1 样品提取方法的选择 根据所分离得到皂昔
的溶解性 ,选择 9 0% 的甲醇为提取溶剂 ;实验中比
较了不同时间热回流提取和超声波提取 ,结果表明
超声提取皂昔含量较低 ;为了去除杂质干扰 ,又不使
皂昔损失 , 选用 eS 户ad ex L2H 0 柱层析 , S eP h ad ex
L H2 0 的原理是分子筛作用 ,还有反向分配层析的作
·
8 0 5
· 药物分析杂志Ch in Jh P~A n以2 (X 辫
,
24 ( 6)
用 ,对总皂昔的纯化效果较好 。 选用最佳条件 : 90 %
的甲醇热回流提取 2 次 ,每次 l h , 经 se 户ad ex L H2 0
柱层析 ,得总皂昔 。
3
.
2 色谱条件的选择 考察了 Zob ax S B 一 C l : ( 4 . 6
m
x 15 0
mtn )和 Su p e lc ol 一 C
l:
( 4
.
6 un
x 15 0
m )
2 种品牌的色谱柱 ,结果表明 Z o bax SB 一 C 】: 的分离
效果较好 ;先后应用甲醇 一 水和乙腊 一水为流动相
进行分离 ,两者各色谱峰均有较大程度的重叠和拖
尾现象 , 分离效果不理想 , 在上述两体系加人醋酸
后 ,峰形及分离效果均有改善 ,但乙睛 一水体系更好
一些 。 经考察 0 , 1% , 0 . 巧% , 0 . 2% , 0 . 3% , 0 . 5% 5
个酸浓度的乙睛 一 水体系 , 在同一条件下 (梯度洗
脱 )进行比较 , 以酸浓度 0 . 2% 为最佳分离条件 , 各
峰得到理想分离 ,故确定为最优化分离条件 。 通过
加人 0 . 2% 醋酸 ,抑制梭基解离 , 分离度得到明显改
善 ,但若酸度太大 ,使吸收峰拖后 , 各化合物峰容易
扩散 ,也使分离度降低 ,所以选择 0 . 2% 醋酸 。
3
.
3 E SL D 检测器参数的设定 通过与 UV 检测器
对照 ,表明对于皂昔的检测 E比D 明显优于 UV 检
测器 。 应用 E比D 检测器 , 气流量和漂移管温度的
调节对检测性能影响非常大 〔4〕 , 经反复实验 , 确定
E比 D 检测器的参数为雾化气体 流速 3 . 35 L ·
m i n
一 ’ ,漂移管温度 1 17 ℃ 。
3
.
4 小结 黄连花样品的 H PL C 图谱显示 ,化合物 6
和化合物 2 在原药材中含量较高 , 这与分离得到的
皂昔的量是一致的 ,其他微量皂昔多混在一起 ,难于
分离 ,但仍能通过与大多数对照品的 t R进行比较 ,进
而进行定性归属 ,但无法进行定量 。
参考文献
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3 2 ( 10 )
: 95 8
(本文于 2X() 3 年 9 月 28 日收到 )
阿奇霉素中相关物质的分离和鉴定
姜建国` 张西茹 , 杨 梁 , 吴如金 ,
( 1
. 河北省药品检验所 石家庄 05 0 11 ; 2 . 中国药科大学 南京 21 侧刃 9 )
摘要 目的 :分离和鉴定阿奇霉素中的相关物质。 方法 : 运用色谱学和波谱学方法分离鉴定阿奇霉素中的相关物质。 结果 :
从阿奇霉素中分离得到 4个相关物质 , 鉴定了其中 2 个主要相关物质的结构分别为 9 一 脱氧 一 9。 ` 一氮杂 一 g a ` 一 甲基 一 g a ` -
红霉素 A 和 9 一脱氧 一 g a 一 氮杂 一 g a 一 甲基 一 3 ` 一 氮缺甲基 一 9。 一红霉素 A 。 结论 : 4 个相关物质均为首次从阿奇霉素粗品
中分离得到的新化合物 ,但其中 2 个有待进一步鉴定 。
关扭词 阿奇霉素 相关物质 分离 鉴定
of eR l
a t e d Sub
s at n c es of A iz ht r o 刃。yc in
JI AN G J ian
一即。 ’ , z H A NG x i 一 ur ’ ,狱N G u an g Z an d w u R u 一 ji n
( 1
.
eH阮`乃训`肥泣。止加谊心 of D门舌 C。川 m泌声入咖诚 ua 咭 05 0 1 1 ; 2 . hc ian 于场a 用~ 玛 ic 以 以成拙几勿 ,如呼昭 2 10( 丈旧
A b动ar c t o 坷伙Uve : T o s e p ar a t e an d id e n t街 elr aet d im p u ir t i e s o f az iht or m y e i n . M e t h侧如 : C h r o n laot gr a P h i e an d
s p e e tr’O s e叩 i e m e th o d s w e er u s e d ot i so la et a n d id e n t i斤 ht e er l at e d s u b s ant e e s i n az iht or m ” in . R eS 川 st : oF u r elr a t e d
im P而 it e s w h i e h w er i s o l at e d加 m az i th or m y e in aer n e w p r od u e st an d wot of ht e m w as id e n t iif e d P r e l im i n iar ly as g