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烟草与白花曼陀罗属间远缘杂种后代化学成分的研究



全 文 :天然产物研究与开发 NatProdResDev2008, 20:778-781, 792
文章编号:1001-6880(2008)05-0778-05
 
 
 收稿日期:2007-12-06   接受日期:2008-02-18
 基金项目:国家烟草专卖局重点科技项目(110199901005);山西
省科技产业化环境建设项目(2006071033);山西大学
引进博士科研启动基金项目(2005)
*通讯作者 Tel:86-351-7111407;E-mail:kqwei88@sohu.com
烟草与白花曼陀罗属间远缘杂种后代化学成分的研究
魏克强 1* ,宋 欣 2, 4 ,杨俊仙 3, 4 ,魏治中 4
1山西大学生命科学与技术学院 ,太原 030006;2河北保定师范专科学校涿州分校 ,涿州 072750;
3山西大学经济与工商管理学院 , 太原 030006;4山西农业大学农学院 , 太谷 030801
摘 要:为缓解吸烟与健康的矛盾 , 通过常规育种的方法将普通烟草品种 78-04与药用植物白花曼陀罗(Datura
metelL.)进行属间远缘杂交育种 ,对选育出的新型烟草品系长柄曼陀罗烟(Mantuoluotobacco)的内在化学成分
和药用成分进行分析。酯酶同工酶和 RAPD分析证实 , 长柄曼陀罗烟中转入了亲本药用植物的遗传物质。烟叶
内在化学成分及药用成分分析显示 ,长柄曼陀罗烟具有低糖 、中高烟碱 , 含有东莨菪碱和阿托品等药用成分的
特点。普通烟草与白花曼陀罗属间远缘杂交能创造变异 、产生烟草新类型 , 对降低卷烟产品的危害性具有一定
作用。
关键词:烟草;白花曼陀罗;长柄曼陀罗烟;同工酶;RAPD;药用成分
中图分类号:R284.1;Q946.91;S572 文献标识码:A
ChemicalComponentsintheIntergenericHybridbetweenTobacco
andMedicinalPlantDaturametelL.
WEIKe-qiang1* , SONGXin2, 4 , YANGJun-xian3, 4 , WEIZhi-zhong4
1SchoolofLifeScienceandTechnology, ShanxiUniversity, Taiyuan030006 , China;
2ZhuozhouBranchSchoolofBaodingTeachersCollege, Zhuozhou072750 , China;
3SchoolofEconomicsandBusinessAdministration, ShanxiUniversity, Taiyuan030006 , China;
4CollegeofAgriculture, ShanxiAgriculturalUniversity, Taigu030801 , China
Abstract:Inordertoreleasethecontradictionbetweensmokingandsmoker shealth, thedistanthybridizationbetween
tobaccoandmedicalplantswasexpectedtoincubateanew-typetobaccothatincludedmedicinalingredients.Aninterge-
nerichybridizationdesignatedasMantuoluotobaccowasmadebetween78-04 (avarietyofNicotianatobacumL.)and
medicinalplantDaturametelL.withtraditionalbreedingmethod.AnalysisofesteraseisozymeandRAPDinparentsand
theirfilialgenerationprovedthathereditysubstanceinmedicalplantDaturametelL.wasintroducedintoMantuoluoto-
bacco.ResultsoftheanalysisofchemicalcomponentsshowedthatMantuoluotobaccohadlow-sugar, middleorhighnic-
otinecontentandnewmedicinalingredients, suchasscoplamineandatropine.Thisstudyindicatedthathybridizationbe-
tweentobaccoandDaturametelL.couldinducevariationandgenerateanew-typetobacco, whichispotentialtoreduce
harmfulnessoftraditionalcigarette.
Keywords:tobacco;DaturametelL.;Mantuoluotobacco;isoenzyme;RAPD;medicinalingredient
  为缓解吸烟与健康的矛盾 ,从育种的角度提高
烟叶的品质 ,卷制出低毒少害的成品是有效的途径
之一。目前我国烟草种质的遗传多样性水平较低 、
遗传基础相对狭窄 , 限制了烟叶品质的进一步提
高 [ 1] 。通过远缘杂交引进外源基因以改良品种 、形
成新物种和新类型已成为烟草育种的发展趋势。我
国拥有丰富的药用植物资源和历史悠久的中草药
“燃 、熏 、吸疗法 ”的理论和实践 ,如能实现药用植物
与烟草基因间的渐渗 、交流以及重组 ,培育出含有药
用植物有效成分的新型烟草 ,对增添烟草新的种质
资源和降低卷烟产品的危害性具有重要的意义。
茄科曼陀罗属药用植物主要有白花曼陀罗
(DaturametelL.)、毛曼陀罗(DaturainnoxiaMil)
和曼陀罗(DaturastramoniumL.)等 。毛曼陀罗通
称北洋金花 ,白花曼陀罗习称南洋金花 ,并以南洋金
DOI :10.16333/j.1001-6880.2008.05.018
花品质较佳 。研究表明 ,白花曼陀罗的有效成分是
东莨菪碱(Scoplamine)、阿托品(Atropine)等莨菪烷
型生物碱 , 具有平喘 、镇咳 、麻醉 、解痉 、止痛等功
效 [ 2] 。至今烟草与曼陀罗属植物间的杂交 ,主要有
通过原生质体融合的方法获得烟草(Nicotianataba-
cumL.CvXanthinc)与毛曼陀罗的体细胞杂种 [ 3] ;
或采用花粉管通道法将毛曼陀罗的总 DNA导入烟
草栽培品种 Basma得到属间杂交品系 TD801 [ 4] 。魏
治中等利用无性嫁接和有性杂交相结合的方法将普
通烟草品种龙烟 2号与毛曼陀罗进行远缘杂交 ,选
育出具有较高利用价值的新型烟草[ 5] ;以普通烟草
品种 78-04为母本 ,白花曼陀罗为父本 ,按此方法进
行常规杂交育种培育出了新型烟草品系长柄曼陀罗
烟(Mantuoluotobacco)[ 6] 。本研究应用同工酶和随
机扩增多态 DNA(RAPD)技术对长柄曼陀罗烟进行
了鉴定 ,主要分析比较了其与亲本的内在化学成分 ,
旨在为研制保健型卷烟以缓解吸烟与健康的矛盾提
供理论依据 。
1 实验器材
1.1 材料
父本为白花曼陀罗(DaturametelL.),茄科(So-
lanacea)曼陀罗属 (DaturaLinn.)植物 ,种子由中
国医学科学院药用植物研究所提供;母本为普通烟
草(NicotianatobacumL.),茄科(Solanacea)烟草属
(Nicotiana),选取的品种 78-04为山西农业大学培
育的烤烟品系 ,按文献 [ 5, 6]的方法进行属间远缘杂
交育种 ,选育出双亲杂种后代稳定品系长柄曼陀罗
烟 [ 6] ,种子均由山西农业大学药烟育种研究室提
供 。
TaqDNA聚合酶 、 10碱基 RAPD随机引物 、
dNTPs、DNA分子量标记 ,均购自上海生工公司 。氢
溴酸东莨菪碱 、硫酸阿托品对照品购自中国药品生
物制品检定所。
1.2 仪器
DYY-Ⅲ型垂直平板电泳仪器(北京六一);D-
37520高速冷冻离心机 (德国 Sigma);UV-260紫外
可见分光光度计 (日本岛津);DDY-2S型凯氏定氮
仪(上海华岩仪器设备有限公司);PTC-200PCR仪
(美国 MJ-Research);ImageMasterVDS凝胶成像系
统(英国 PharmaciaBiotech);Agilent6890气相色谱
仪(美国 Agilent)。
2 实验方法
2.1 酯酶同工酶分析方法
参考庾正平等垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳
(PAGE)方法 [ 7] 。待 78-04、白花曼陀罗及长柄曼陀
罗烟长到 6 ~ 10片幼叶时 ,分别取幼叶 0.5 g,加入
0.5 mLTris-柠檬酸缓冲液(pH8.9),冰浴中研磨成
匀浆 ,离心 ,取上清液 ,加入 0.5 mL10% (V/V)甘
油 ,冰箱保存备用 。凝胶缓冲液为 Tris-柠檬酸系统
(pH8.9),分离胶浓度 10%,浓缩胶浓度 4%,电极
缓冲液为 Tirs-Gly系统(pH8.7),电泳时每孔加样
50μL, 260V电泳 4h。电泳完毕 ,酯酶同工酶用坚
牢蓝醋酸 -α-萘酯法染色 。
2.2 RAPD分析方法
取烟草苗期幼嫩叶片和曼陀罗新鲜叶片 ,分别
参考文献[ 8, 9]的 CTAB法提取植物总 DNA,以紫外
分光光度计检测其浓度 , 4 ℃冰箱保存备用。扩增
反应在 PTC-200PCR仪上进行 ,反应体系为 25 μL,
其中 10xPCRbufer(含 20 mmol/LMgCl2)2.5μL,
2.5 mmol/LdNTPs2.0 μL, 10 mmol/L引物 1 μL,
Taq酶(2U/μL)0.5 μL,模板 DNA1.0 μL, ddH2O
18 μL。反应程序为:94℃预变性 4 min;94 ℃变性
1min, 37℃退火 1min, 72℃延伸 2min, 40个循环;
循环结束后 , 72℃延伸 5 min。取 10 μL扩增产物 ,
用 1.4 %的琼脂糖凝胶 (含 0.5 μg/L溴化乙锭)
100 V恒压电泳 2 ~ 3 h,电泳缓冲液为 0.5×TBE,
ImageMasterVDS凝胶成像系统观察拍照 。
2.3 烟叶常规化学成分测定
依据 GB2635-92烤烟的分级方法 ,待烟草成熟
采收烘烤后 ,分别取 78-04和长柄曼陀罗烟中部叶
C3F0.5 kg,参考文献 [ 10]的方法分析烟叶常规化学
成分:总糖采用蒽酮比色法 ,还原糖采用苦味酸比色
法 ,烟碱采用紫外分光光度法 ,总氮采用凯氏定氮
法 ,并计算出蛋白质含量 、施木克值 、糖碱比和氮碱
比值 。
2.4 阿托品及东莨菪碱含量测定
待测样品的预处理同参考文献 [ 11]的方法。气
相色谱检测依据 JY/T021-1996 ,色谱条件:HP-5MS
柱 (30 m×0.25 mm ×0.25μm);进样口温度:290
℃;柱温初始温度 100 ℃,以 40 ℃/ min升至 280
℃;检测器温度:300 ℃;载气:He, 1.8 mL/ min;燃
烧气:H2 , 3 mL/ min;助燃气:空气 , 60 mL/ min;进
样量:1.0 μL;分流进样 ,分流比 10∶1。采用保留时
779Vol.20       魏克强等:烟草与白花曼陀罗属间远缘杂种后代化学成分的研究  
间对比法定性 ,外标法定量 。
3 结果与分析
3.1 同工酶谱测定结果
新生叶片酯酶同工酶电泳图谱显示共有 10条
带 ,其中长柄曼陀罗烟与父本白花曼陀罗有 1条共
同带 ,而母本 78-04没有(箭头所示);与母本有 1条
共同带 ,而父本白花曼陀罗没有;长柄曼陀罗烟还有
2条新带(图 1)。结果表明 ,父本白花曼陀罗的遗
传物质进入杂种后代中 ,长柄曼陀罗烟是 78-04与
白花曼陀罗的远缘杂种后代。
图 1 长柄曼陀罗烟及其双亲酯酶同工酶电泳图谱
Fig.1 EsteraseisozymezymogramofMantuoluotobac-
co(2), DaturametelL.(1)and78-04(3)
3.2 RAPD鉴定结果
分别以长柄曼陀罗烟及其亲本 78-04、白花曼陀
罗的 DNA为模板 ,对 130条 RAPD随机引物进行扩
增 、筛选 ,筛选出的引物必须是父本能够扩增出明显
的特征带 ,而母本缺少对应的 DNA带 。经多次重
复 ,引物 S66(5′-GAACGGACTC-3′)能稳定 、清晰地
扩增出子代与父本共有而母本却不具有的大小约
2322bp的特异条带(图 2箭头所示),证明长柄曼
陀罗烟含有父本的遗传物质。
3.3 常规化学成分测定结果
分析结果表明 ,长柄曼陀罗烟的主要内在化学
图 2 引物 S66扩增结果电泳图谱
Fig.2 RAPDpaternamplifiedwiththeprimerS66
M.Maker(λ-DNA/HindⅢ);1.白花曼陀罗;2.长柄曼陀
罗烟;3.78-04
成分与其亲本 78-04之间存在一定差异(见表 1)。
与 78-04比较 ,长柄曼陀罗烟的总糖 、还原糖 、总氮
和蛋白质的含量分别降低了 19.24%、 22.04%、
6.34和 9.25%,烟碱的含量提高了 2.24倍 ,并且 ,
施木克值 、总糖与烟碱和总氮与烟碱的比值分别降
低了 12.07%、 75%和 71.05%。对我国 1998 ~
2004年烟草种质资源的统计表明 ,烤烟中化学成分
的平均含量分别为:总糖 23.08%,还原糖 19.63%,
总氮 2.00%,烟碱 1.99%,蛋白质 10.32%,施木克
值 2.45,总糖 /烟碱 14.21,总氮 /烟碱 1.15[ 12] 。一
般而言 ,烟叶中糖与烟碱的含量是影响烤烟质量的
重要因素 。糖含量高会破坏烟叶内在成分的平衡与
协调 ,影响卷烟的吃味强度和燃烧性 ,糖含量低有降
低烟气中焦油含量的趋势 ,但糖含量是否适宜还应
结合总氮 、烟碱 、蛋白质等成分的含量及其比例来综
合评价;而烟碱含量高低与卷烟燃吸时的劲头呈正
相关 。新型烟草是烟草中新的种质资源 ,具有烟草
和药用植物的特征 ,分析显示长柄曼陀罗烟具有低
糖 、中高烟碱的特点 。对于如何应用烟草传统的化
学成分指标来评价新型烟草的品质目前尚无标准 ,
我们正在深入研究中。
表 1 长柄曼陀罗烟的主要内在化学成分测定结果
Table1 AnalyticalresultofchemicalcomponentsinMantuoluotobacco
样品
Sample
总糖
Totalsugar
(%)
还原糖
Reducingsugar
(%)
总氮
Totalnitrogen
(%)
蛋白质
Protein
(%)
烟碱
Nicotine
(%)
施木克值
Totalsugar
/ protein
总糖 /烟碱
Totalsugar
/nicotine
总氮 /烟碱
Totalnitrogen
/nicotine
长柄曼陀罗烟
Mantuoluotobacco 9.99 9.69 3.25 19.42 4.92 0.51 2.03 0.66
78-04 12.37 12.43 3.47 21.40 1.52 0.58 8.12 2.28
3.4 东莨菪碱及阿托品的定量分析结果
对长柄曼陀罗烟及其亲本叶片中东莨菪碱及阿
托品含量的测定结果表明(表 2),长柄曼陀罗烟主
要呈现以下 2个特点:(1)利用普通烟草与白花曼
陀罗进行属间远缘杂交 ,药用植物的有效成分转入
了杂种后代 ,长柄曼陀罗烟含有东莨菪碱及阿托品
780 天然产物研究与开发                      Vol.20
成分。 (2)长柄曼陀罗烟中药用成分的含量低于亲
本白花曼陀罗 ,东莨菪碱及阿托品的含量分别降低
了 60%和 65.41%。长柄曼陀罗烟含有独特的药用
成分 ,这是普通烟草所不具备的特征 。
表 2 长柄曼陀罗烟及其亲本叶片中阿托品及东莨菪碱含
量测定结果
Table2 Determinationofscopolamineandatropineinleavesof
Mantuoluotobacco
成分 (μg/g)
Constituent 78-04
长柄曼陀罗烟
Mantuoluotobacco
白花曼陀罗
DaturametelL.
东莨菪碱 Scopolamien - 55 137.5
阿托品 Atropine - 32 92.5
  注:“-”表示未检出。 Note:“-”:unidentified.
4 讨论
远缘杂交的最终目的是导入外源基因并能正确
表达 。酯酶同工酶谱与随机扩增多态性 DNA
(RAPD)分析表明 ,杂种后代基因组中含有父本白
花曼陀罗的遗传物质 。化学成分检测显示 ,通过白
花曼陀罗与烟草品种 78-04基因间的渐渗 、交流以
及重组 ,长柄曼陀罗烟呈现出含有东莨菪碱 、阿托品
等药用成分 ,低糖 、中高烟碱的特点 ,这与毛曼陀罗
和烟草品种 Basma或龙烟 2号属间杂交获得的新品
系基本相似 [ 4, 5] 。由于常规有性杂交育种难以克服
远缘植物间的杂交不亲合性 ,多采用基因操作的方
法转移异源的有益基因。采取先嫁接再有性杂交的
方法 ,对不同的杂交组合如(78-05 +龙烟 2号)X
毛曼陀罗 、(N.sylvestis+78-04)X白花曼陀罗等均
可显著提高烟草与曼陀罗属植物间杂交的成功
率 [ 5, 6] ,这就提供了一条低成本导入外源基因的新
方法。
卷烟的抽吸是一个高温乏氧不完全燃吸的过
程 ,卷烟烟气的焦油中含有稠环芳烃 、亚硝胺类等对
人体健康有害的物质 ,低焦油卷烟成为安全型卷烟
的代名词。目前 ,我国烟草行业在发展中式卷烟的
过程中 , “降焦减害 ”是主要的科技任务 ,其中保健
类卷烟属于中式混合型。但随着焦油量的大幅度降
低 ,烟叶原有的香气品质势必受到影响 ,降焦与保香
技术已成为制约低焦油卷烟发展的关键。通常在保
健型卷烟的生产中 ,中草药成分的添加工艺基本上
是采用三种方式:提取中草药成分在润叶时随料加
入 ,提取中草药的挥发油类物质随香加入或以药物
本身的自然形态搀兑在被加工的烟叶中 [ 13] 。研究
表明 ,毛曼陀罗与龙烟 2号属间杂种单料烟燃烧后 ,
烟气中仍含有微量的东莨菪碱与阿托品成分 ,但其
毒理学实验结果与亲本龙烟 2号没有显著差异 [ 5] 。
可见 ,烟叶中烟草传统的化学成分与新产生的药用
成分处于同一植物体中 ,这从原料本身就增加了有
利于人体健康的医药成分 ,可以节省大量中草药 ,是
一条降低卷烟产品危害性的新途径。
烟叶是满足人们吸食需要的特殊商品 ,其感官
特征是烟叶品质优劣最直接 、最权威和最客观的反
映。经国家烟草质量监督检测中心对利用长柄曼陀
罗烟卷制成品的烟气检测表明 ,焦油含量稳定在 10
~ 12 mg/支 ,属于低焦油卷烟类型;并且可能由于燃
烧后叶片内的烟草化学成分与转入的药用成分两种
类型的物质会发生相互作用 ,新型烟草表现出香味
独特 ,余味纯净 ,劲头适中 ,各种成分比较协调 ,可用
性比较理想的特性 [ 6] 。初步的实验表明 ,药用植物
的挥发性有效成分 ,经燃吸后随着烟气进入呼吸管
道 ,可能直接与病变部位接触 ,发挥了镇咳祛痰 、补
益肾肺的功能 ,长柄曼陀罗烟受到患有咳嗽 、气管炎
等疾病的吸烟消费者的欢迎 [ 6] ,为研制保健型卷烟
以缓解吸烟与健康的矛盾奠定了物质基础。
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781Vol.20       魏克强等:烟草与白花曼陀罗属间远缘杂种后代化学成分的研究  
roleinhemagglutinatingactivityofPMLamongthese
residues.Inthepresenceofurea(8 M), therearea-
bout8 Trpresiduesweremodifiedunderdenaturing
condition.ThepeptidechainsofthePMLmoleculeex-
tendedthoroughlyinthesolutioncontaining8 Murea,
NBScouldmodifyaltheTrpresidues.
Inrecentyears, itwasfoundsomelectinsexhibitmany
interestingfunctions, suchasantitumororantivirus.It
simportanttostudythemechanismofthesefunctions.
Now, studyonPML sbiologicalactivitiesisgoingon,
andthispapermayprovidesomeclues.
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