全 文 ：白花曼陀罗悬浮培养细胞转化对羟基苯甲醛生成天麻素
龚加顺1, 2* , 马维鹏 2 , 普俊学 2 , 徐树冠 2 , 郑双庆 2 , 肖春杰 3
(1. 云南农业大学 食品科学技术学院 , 云南 昆明 650201;2. 昆明制药集团股份有限公司 药物研究所 , 云南 昆明 650100;
3. 云南大学 生命科学学院 , 云南 昆明 650091)
摘要:目的　研究天麻素在植物细胞的转化合成。方法　利用白花曼陀罗细胞悬浮培养转化外源对羟基苯甲
醛合成天麻素 , 并应用多种色谱技术进行分离纯化 , 根据转化产物的理化性质和光谱数据分析鉴定结构。结果　利
用白花曼陀罗细胞成功地将对羟基苯甲醛转化为天麻素( II),并得到由对羟基苯甲醛生成天麻素的转化中间体对羟
基苯甲醇( I)。另外 ,从细胞培养物中分离得到 β-D-吡喃阿洛酮糖( III)和 5-正丁氧基-β-D-吡喃阿洛酮糖( IV)两种
化合物。结论　白花曼陀罗细胞悬浮培养能转化对羟基苯甲醛合成天麻素。
关键词:白花曼陀罗;对羟基苯甲醛;对羟基苯甲醇;天麻素;生物转化
中图分类号:R915. 3　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513 -4870(2006)10 - 0963 -04
收稿日期:2005-11-03.
基金项目:昆明制药集团博士后基金和云南省自然科学基金资
助项目(2004C0034M).
*通讯作者　Tel:86 - 871 - 5228661, Fax:86 - 871 - 5227842,
E-m ai l:gong199@163. com
The production of gastrodin through b iotransformation of
p-hydroxybenzaldehyde by cell suspension culture ofDatura stramon ium
GONG Jia-shun1, 2* , MA W e i-peng2 , PU Jun-xue2 , XU Shu-guan2 ,
ZHENG Shuang-qing2 , X IAO Chun-jie3
(1. Facu lty of Food Science and Technology, Yunnan Agricu lturalUn iversity, Kunm ing 650201 , China;
2. Institute ofMa teriaM edica, Kunm ing Pharmaceutical Corp. , Kunm ing 650100 , China;
3. School of L ife Sciences, Yunnan University, Kunm ing 650091 , China)
Abstract:Ami 　To investiga te the production o f p-hydroxymethy lphenol-β-D-g lucoside (gastrodin)
th rough bio transfo rmation by plant cell suspension cultures. M ethods　U sing ce ll suspension cultures o f
Datura stramonium to convert the exogenous p-hydroxybenzaldehyde into gastrodin w as conducted and the
converted compounds w ere separa ted w ith a combination of multi-chrom atog raphy. Their chem ica l
struc tures w ere de term ined on the basis of spectra l analy sis and chem ica l ev idence. Results　The
conversion procedu re of p-hydroxybenzaldehyde in to gastrodin by Datura stramon ium cell suspension
cu ltures w as established. The synthesized gastrod in (II) was iso lated from the fermental liquor and
iden tified by spectral ana lysis. A t the same time, the p-hydroxybenzy l alcoho l (I) converted th rough
biotransform ation o f p-hydroxybenza ldehyde by cell suspension cultures o fDatura stramonium was also
iso lated and identified. Two compounds we re a lso isola ted from the ce ll cultu res and they w ere identified as
β-D-fu ranoallu lose (III) and n-buty loxy styry l-β-D-py ranoa llulose (IV). Conclusion　Da tura stramonium
grow n in suspension cultures can convert exogenous p-hydroxybenzaldehyde into the co rresponding
gastrod in.
Key words:Datura stramon ium;p-hydroxybenza ldehyde;p-hydroxybenzy l a lcoho l; gastrodin;
biotransform ation
　　天麻素 (对羟基甲基苯-β-D-吡喃葡糖苷 )为天
麻的主要活性成分 ,有镇静 、抗炎 、抗惊厥 、镇痛 、增
强机体免疫 、扩张血管 、抗缺血缺氧 、降低血浆黏度
和清除自由基等多种功能 [ 1 ～ 3] 。 20世纪 70年代末
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DOI牶牨牥牣牨牰牬牫牳牤j牣牥牭牨牫牠牬牳牱牥牣牪牥牥牰牣牨牥牣牥牨牥
期由昆明植物所周俊院士发现并人工合成[ 4, 5] ,最
近戴晓畅等[ 6]也报道了化学合成天麻素的工艺技
术 。但由于化学合成天麻素工艺难度较大 ,同时环
境污染特别严重 ,因此 ,寻求新的合成方法具有重要
的意义 。
生物转化技术应用于药物合成已经成为近年来
极为活跃的研究领域之一[ 7] 。植物生物转化是利
用植物细胞的酶系统 ,使加入到反应系统中的有机
底物结构发生改变的生理生化过程 。研究表明 ,离
体培养植物细胞具有酯化 、氧化 、糖基化 、甲基化和
乙酰化等多种生物转化能力 ,其实质是一种酶的催
化反应[ 8] 。早在 1976年 , Mamoru等[ 9]就利用细胞
悬浮培养液对酚类物质进行糖苷化反应 。至今 ,已
有许多类似方面的研究报道 [ 10 ～ 14] 。在天麻素生物
转化方面 ,戴均贵等 [ 15, 16]利用长春花 、桔梗悬浮培
养细胞将天麻素转化为对羟基苯甲醇 。
本文将外源对羟基苯甲醛加入生长较好的 、已
在 LS液体培养基中继代培养了 6 ～ 7次 (15 d /次 )
的无性系细胞中 ,避光培养 ,控制摇床转速为 120
r m in-1 ,培养温度 (23 ±1)℃。在 2 000 mL三角
瓶中 ,加入 1 800mL LS培养基和 1.5 g外源对羟基
苯甲醛 ,其糖基化率最高可达 85.0%,而在 25 L气
升式发酵罐中加入 17 L改良的 LS培养基和 12 g外
源对羟基苯甲醛 ,其最高糖基化率目前达到 45.0%
以上。
发酵液萃取后 ,通过各种色谱方法分离得到两
个转化产物 (I)和 (II),经质谱 、1H NMR和 13C NMR
等鉴定为对羟基苯甲醇和天麻素。在分离纯化过程
中 ,还分离得到了另外两种化合物:β-D-吡喃阿洛酮
糖 (III)和 5-正丁氧基-β-D-吡喃阿洛酮糖 (IV)。
转化产物 (I)　C7H8O 2 , 1H NMR(400 MHz,
CD3OD) δ:4.46(2H , s), 6.75 (2H , dd , J =2.8,
9.2), 7.16(2H , d, J =13.24);13 C NMR(100 MH z,
CD3OD) δ:65.1, 157.8, 116.0, 129.8, 133.4;E IMS
m /z(%):124(9), 107(100), 95(12), 77(27)。与冯
孝章等[ 17]测定的结果一致 。
转化产物 (II)　C13H18O 7 , 1H NMR(400 MH z,
CD 3OD) δ:7.26(d, J =8.6, H-3, H-5), 7.06(d, J =
8.6, H-2, H-6), 4.89(d, J =9.7, H-1′), 4.52(2H ,
s), 3.89(dd, J =1.9, 12.0, H-6′), 3.69(dd, J =
4.9, 12.0, H-6′), 3.29 ～ 3.45(4H , H-2′～H-5′)或
(m , 4H );13 C NMR(100 MH z, CD3OD) δ:136.6
(C1), 129.4(C2, 6), 117.7(C3, 5), 158.4(C4),
64.8(C7), 102.4(C-1′), 74.9(C-2′), 78.1(C-3′),
71.3(C-4′), 77.9(C-5′), 62.5(C-6′)。从核磁共振
数据可知 ,糖环上 1位质子的化学位移值 (δ4.89)
小于 δ5.31, H-1′的偶合常数为 9.7,糖环上 1位 13C
的化学位移(δ102.4)大于 δ101 ,而且 C3与 C5两
峰合并 ,化学位移均为 δ117.7(C3, 5),故所合成的
糖苷为 β型 ,与文献 [ 18]相符。 FAB-MSm /z:285[M
-H ] - , 377[M +G ly -H ] - , 469[M +2G ly -H ] - ,
561[M +3G ly -H ] - , [ α] 23D - 76.9(c 0.40,水 ),说
明糖基构型为 D型。
转化结果表明 ,利用白花曼陀罗植物细胞悬浮
培养转化外源对羟基苯甲醛能够合成天麻素 ,可能
的合成途径如图 1。
化合物 (III)　C6H9O6 , 1H NMR(CD3OD, 400
MHz) δ:4.91(1H , dd , J =3.7, H-3), 4.82, 4.41
(2H , d , J =12.2, H-1), 4.69 ～ 4.73(2H , m , H-4 and
H-5), 4.33, 4.21(1H , dd, J =2.9, 11.8, H-6);
13
C NMR(100 MH z, CD3OD) δ:61.7( t, C-1), 106.1
(s, C-2), 82.8(d , C-3), 79.4(d, C-4), 84.5 (d,
C-5), 62.8( t, C-6);E IM Sm /z(%):180(1.3), 149
(8.4), 119(2)与文献 [ 19]报道一致。
化合物(IV)　C10H15O6 , 1H NMR(CD3OD , 400
MHz) δ:4.90, 4.20(2H , d, J =10.6, H-1), 4.54,
4.07(2H , dd, J =2.8, 10.2, H-6), 4.37(2H , m , H-4,
5), 4.20(H , dd, J =1.4, 12.8, H-3), 3.65 ～ 3.74
(2H , m , H-1′), 1.51 ～ 1.56(2H , m , H-2′), 1.33(2H ,
m , H-3′), 0.78 ～ 0.82(3H , t, H-4′);13C NMR(100
MHz, CD3OD) δ:65.1( t, C-1), 101.3(s, C-2),
72.2(d, C-3), 71.4(d, C-4), 70.7(d, C-5), 60.7( t,
F igure 1　P lausib le pathw ays of gastrodin production th rough biotransform ation o f exogenous p-
hydroxybenza ldehyde byDa tura stramonium ce ll suspension cultu res
964 药学学报 Ac ta Pharm aceutica S inica 2006, 41(10):963 -966
C-6), 64.2( t, C-1′), 32.7( t, C-2′), 19.9( t, C-3′),
14.2(q, C-4′);FAB-MS m /z:235[M - H ] - , 327
[M +G ly - H ] - , 419[M +2G ly -H ] - , 511[M +
3G ly -H ] -与文献 [ 19]报道一致 。
实验部分
白花曼陀罗无性系细胞　将白花曼陀罗嫩茎在
MS培养基 [ 20] [附加 30 g L -1蔗糖 , 0.2 mg L -1
2, 4-二氯苯氧基乙酸 (2, 4-D), 0.2 mg L -1 6-糖基
氨基嘌呤(KT)]上诱导产生愈伤组织 ,并将产生的
愈伤组织接种于 LS固体培养基 [ 21] (附加 30 g L -1
蔗糖 , 0.2 mg L- 1 2, 4-D),用蜡膜将培养皿封住 ,
在暗中 (黑布遮盖下)培养 15 d后 ,少数细胞开始分
裂形成 3 ～ 4个细胞的细胞集落 ,选择分裂快的细胞
集落 ,作进一步固体培养增殖无性系。之后将无性
系细胞置于 LS液体培养基 (附加 30 g L -1蔗糖 , 2
mg L -1 2 , 4-D)上不断继代培养 ,直至形成稳定的
悬浮培养细胞。
仪器 　VG-Au tospec-3000质谱仪 , B ruker AM-
400型核磁共振仪 , B ruker AM-100型核磁共振仪;
JASCO-20旋光仪 。 HPLC (A gilen t 1100 Series),
W ater制备柱(Prep RP18, 10 μm , 19 mm ×150 mm)。
HPLC分析柱为 W ate r产品 (型号为 RP18 , 10 μm ,
7.8mm ×150 mm)。
试剂 　对羟基苯甲醛 、对羟基苯甲醇购自
S igma公司 ,化学合成天麻素标准品由昆明制药集
团提供 ,其他试剂均为分析纯。
1　细胞悬浮培养转化
在 1 800 mL LS液体培养基 (去琼脂 ,附加 0.1
mg L -1水杨酸 , 60.0 g L - 1蔗糖 )中加入 200 g继
代培养的悬浮细胞 ,培养 3 d后 ,加入经无菌过滤的
乙醇水溶液溶解的外源对羟基苯甲醛 1.5 g(质量浓
度为 0.83 mg mL -1的培养液 ),培养温度 (23 ±
1)℃,摇床转速 120 r m in-1 ,避光培养 15 d。转化
液 (发酵原液 )经 HPLC分析 ,外源对羟基苯甲醛糖
基化率为 85%,天麻素含量为 1.58mg mL -1 ,对羟
基苯甲醇含量为 0.08 mg mL -1 ,对羟基苯甲醛含
量为 0.04 mg mL -1。在 25 L气升式生物反应器
中的转化反应条件为:3 000 g新鲜的悬浮培养细
胞接入 17.0 L液体 LS培养基 (附加 0.2 mg L -1
2, 4-D, 3.0 mg L - 1 6-BA , 0.1 mg L- 1水杨酸和
60.0 g L -1蔗糖 )中 ,预培养 5 d后 ,加入无菌的对
羟基苯甲醛 12.0 g,在温度 (23 ±1)℃下保温培养
15 d。转化液 (发酵原液)经 HPLC分析 ,外源对羟
基苯甲醛糖基化率为 45%,天麻素含量为 0.736
g L -1 ,对羟基苯甲醇 0.285 g L - 1 ,对羟基苯甲醛
含量为 0.106 g L - 1。
2　天麻素 、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的鉴定
采用薄层色谱法。将天麻素与对羟基苯甲醇分
别点于同一硅胶 G薄层板 (购自青岛海洋化工 ),
用氯仿-甲醇 (7∶3)展开 , 以 70%稀硫酸溶液喷雾 ,
85 ℃烘烤后在相应位置上依次呈现紫红 、红色斑
点。
3　天麻素 、对羟基苯甲醇和对羟基苯甲醛的含量测
定
采用高效液相色谱法 ,以十八烷基硅烷键合硅
胶为填充剂;以乙腈-水 (1∶9)为流动相;检测波长
220 nm。理论塔板数按天麻素峰计算不低于 3 000。
取对照品适量 ,加流动相稀释制成每 1mL中含 1mg
的对照品溶液;再取标准样溶液与细胞发酵液 (发
酵液经滤纸和 0.22μm滤膜过滤即可 )各 5 μL,分
别注入液相色谱仪 ,记录色谱图至保留时间 20m in,
再通过转换计算得到样品中天麻素的含量。天麻素
计算回归方程:Y =2E +09X +135 029(Y:天麻素的
峰面积 , X:天麻素的毫克数 , R2 =0.996);对羟基
苯甲醇计算回归方程:Y =3E +09X - 348 353(Y:
对羟基苯甲醇的峰面积 , X:对羟基苯甲醇的毫克
数 , R 2 =0.998);对羟基苯甲醛计算回归方程:Y =
5E+09X -989 287(Y:对羟基苯甲醛的峰面积 , X:
对羟基苯甲醛的毫克数 , R2 =0.994)。对羟基苯甲
醛转化率的计算:对羟基苯甲醛转化率 (%)=m /n ,
式中:m为所得天麻素的摩尔数 (mo l);n为添加对
羟基苯甲醛的摩尔数(mo l)。
4　生物转化合成天麻素的分离
发酵液 500 mL(加水冲洗细胞和细胞萃取液与
发酵原液的混合液 ,含天麻素 358 mg)先用三氯甲
烷(发酵液-CHC l3 1∶1)萃取 5次去除残余的对羟基
苯甲醇和对羟基苯甲醛 ,再用正丁醇 (发酵液-正丁
醇 1∶1)萃取 6次 , 合并萃取液 , 在 60 ℃下真空减
压浓缩成膏状物 (含天麻素 308 mg), 然后进行硅
胶(GF-254)柱色谱 (Ф 5×50 cm)分离 ,先用洗脱液
为 20%的乙酸乙酯-苯洗脱可能残留的对羟基苯甲
醇和对羟基苯甲醛以及其他杂质 ,再用 10%甲醇-
乙酸乙酯洗脱 ,收集含天麻素部分 ,在 60 ℃下真空
减压浓缩得天麻素粗品 (266 mg)。该粗品先经 RP-
18柱以甲醇-水梯度洗脱 (分别为 10%甲醇 、20%甲
醇 、 40%甲醇 、 60%甲醇和 100%甲醇),收集 10%
甲醇洗脱部分 ,浓缩后过 Sephadex LH-20柱 ,先用
965 龚加顺等:白花曼陀罗悬浮培养细胞转化对羟基苯甲醛生成天麻素
CHC l3-CH3OH 1∶1洗脱 ,再用 CH3OH-H2O 1∶1洗
脱 ,收集洗脱液 ,浓缩得到 224 mg精制天麻素 ,将
224mg样品溶解在 10 mL蒸馏水中 ,用制备 HPLC
分离 ,每次进样 2 mL,共进样 5次 ,得到 HPLC分离
纯品 (198 mg),再于甲醇-三氯甲烷中重结晶 ,用于
1
H NMR, 13C NMR, MS及比旋光度测定 。
5　转化中间产物对羟基苯甲醇的分离
发酵液经乙醚萃取 ,浓缩 ,残渣用乙醇溶解 ,拌
入硅胶粉研磨烘干 ,装入色谱柱 (Ф 5×50 cm),先
用苯洗脱 ,再用乙酸乙酯-苯梯度洗脱 , 20%乙酸乙
酯-苯洗脱部分得淡黄色结晶 ,再用热苯重结晶即得
对羟基苯甲醇。
致谢:昆明植物研究所的何红平博士参与了转化产物
的分离 、结构鉴定与分析工作。
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