全 文 ：木蹄层孔菌乙醇提取物体内抗肿瘤活性
及其对荷瘤鼠免疫功能的影响＊
刘　量 1, 2 ,郑维发2 ,周守标 3
(1.扬州大学医学院药学系 ,江苏 扬州 225000;2.江苏省药用植物生物技术重点实验室 , 江苏 徐州 221116;
3.安徽师范大学生命科学学院 , 安徽 芜湖 241000)
摘要:目的　研究木蹄层孔菌乙醇提取物(EEF)的体内抗肿瘤活性及其对荷瘤鼠免疫功能的影响。方法　
建立 ICR鼠 S180肉瘤模型 , EEF3个剂量组灌胃给药 , 10天后计算抑瘤率 、脾指数 、胸腺指数及 EEF对荷瘤鼠淋巴
细胞转化能力 、脾细胞抗体生成能力和 NK细胞活性的影响。结果　100、250、 500 mg· kg-1· d-1 3个剂量组的
抑瘤率分别为 38.5%、41.6%、59.5%,均能提高荷瘤鼠的脾指数 , 增强荷瘤鼠的淋巴细胞转化能力 ,脾细胞抗体
生成能力 , NK细胞活性。结论　EEF有明显的体内抗肿瘤活性。
关键词:木蹄层孔菌;抗肿瘤活性;免疫功能
中图分类号:R979.1　　文献标识码:A　　文章编号:1000-2065(2007)08-0497-03
Theanti-tumoreffectofethanolextractofFomesfomentariusanditsinfluence
onimmunologicalfunctionintumor-bearingmice
LIULiang1 , 2 , ZHENGWei-fa2 , ZHOUShou-biao3
(1.SchoolofPharmacy, MedicalColegeofYangzhouUniversity, Yangzhou, Jiangsu225000, China;
2.ProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyonMedicalPlants, Xuzhou, Jiangsu221116;
3.InstituteofLifeScienceofAnhuiNormalUniversity, Wuhu, Anhiu241000)
Abstract:Objective　Tostudytheanti-tumorefectofethanolextractofFomesfomentarius(EEF)invivoand
itsinfluenceonimmunologicalfunction.Methods　ICRmicecarryingS180 sarcomaweregiventhreediferentdosesof
EEF.Tendayslater, thetumor-inhibitoryrate, spleenindex, thymusindex, theabilityofspleniclymphocytetransfor-
mation, theformationofantibodyinspleniccelsandtheactivityofNKcellswereobserved.Results　Theinhibitory
ratesinthegroupstreatedwithEEF100, 250and500 mg· kg-1· d-1 were38.5%, 41.6% and59.5%, respective-
ly.Themedicinecouldalsoobviouslyenhancethespleenindex, promotethespleniclymphocytetransformation, theanti-
bodyformationinspleniccelsandtheactivityofNKcells.Conclusion　ExtractofFomesfomentariushasobviousanti
-tumorabilityinvivo.
Keywords:Fomesfomentarius;anti-tumoractivity;immunologicalfunction
　　木蹄层孔菌(Fomesfomentarius)是多孔菌科的
一种大型药用真菌 。子实体马蹄型 ,为民间抗癌药
物 ,味微苦 ,性平 ,消积化瘀 。子实体水煎服 ,可用于
治疗食管癌 、胃癌 、子宫癌 、小儿积食 [ 1] 。对该药的
药理活性过去仅限于对其水提物的报道 ,尚未见深
入研究的报道。本实验用木蹄层孔菌乙醇提取物
(ethanolextractofFomesfomentarius, EEF)作用于体
内的肿瘤细胞 ,旨在探讨 EEF的体内抑瘤活性及其
对荷瘤鼠免疫功能的影响 。中草药的天然产物中存
在着广泛的生物活性物质 ,如何从中草药中寻找毒
副作用小 ,作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药
物[ 2] ,发挥我国传统中药的优势将为肿瘤的治疗另
辟蹊径 ,木蹄层孔菌作为传统的民间抗癌药物在肿
瘤治疗方面有广阔的前景 ,值得深入研究。本实验
旨在为这一传统药物的开发提供理论依据。
1　材料和方法
1.1　实验材料
1.1.1　药品和试剂　木蹄层孔菌(购自大连王力
商行)碾碎用无水乙醇煮沸浸提 2 ～ 3次 ,过 200目
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＊ 基金项目:江苏省药用植物生物技术重点实验室重点项目(ZXL0512)
滤网 ,所得浸膏冷冻干燥 ,得棕色粉末 。临用前将粉
末先溶于少量乙醇 ,再加吐温 -80助溶 ,后用蒸馏
水稀释到所需浓度;用于体外实验药物用 1% DM-
SO+完全 RPMI-1640培养基稀释 。
新生小牛血清购自美国 Hyclone公司 ,胰蛋白
酶购自上海华美公司 ,噻唑兰 (MTT)、二甲基亚枫
(DMSO)、 DNaseⅠ 、 RNase、刀豆蛋白 A(ConA)为
Sigma公司产品 ,环磷酰胺 (江苏连云港恒瑞制药
厂)。
1.1.2　实验动物及肿瘤细胞株　清洁级 ICR鼠 ,
雌雄各半 , 18 ～ 22g;S180腹腔积液瘤种鼠(购自中国
医学科学院协和医科大学药物研究所), Hela细胞
株购自军事医学科学院病毒研究所。
1.1.3　主要设备　CO2培养箱(SHELBA)、酶联免
疫检测仪(Bio-RAD公司)、离心机(上海飞鸽离心
机厂)、分析天平(Sartorius)、722可见分光光度计
(上海精密科学仪器有限公司), FACSCalibur型流
式细胞仪(BectonDickinson)。
1.2　实验方法
1.2.1　体内抗肿瘤实验及对免疫器官的影响　参
照文献 [ 3] ,无菌抽取接种 7 ～ 8天的 S180荷瘤鼠腹
腔积液 ,用灭菌生理盐水稀释成 1.0×107个 /ml肿
瘤细胞悬液 ,以每鼠 0.2 ml接种于健康 ICR鼠右后
肢皮下腹沟处 , 24h后随机分为 EEF大剂量组(500
mg·kg-1· d-1)、中剂量组(250 mg· kg-1· d-1)、
小剂量组(100mg· kg-1·d-1)、环磷酰胺阳性对照
组(30mg·kg-1·d-1)、模型组及正常对照组 ,每组
10只 。于每日同一时间灌胃给药 ,连续 10天 ,末次
给药后 24h,摘眼球放血处死小鼠 ,剥离瘤块 ,摘取
脾脏 、胸腺 ,电子天平称重 ,计算抑瘤率 、脾指数和胸
腺指数 。肿瘤生长抑制率 =(1-实验组平均瘤重 /
模型组平均瘤重)×100%[ 4] 。
1.2.2　荷瘤鼠淋巴细胞转化实验　参照文献 [ 5] ,
ICR鼠接种 、分组和给药同 1.2.1,末次给药后 24h,
无菌取出脾脏 ,制成 5.0×106 /ml脾细胞悬液 ,每孔
1 ml于 24孔板中 ,分 2孔 ,一孔加 ConA(终浓度 5
μg/ml),另一孔不加 。置于 5%CO2 、37℃培养 72h,
结束培养前 4 h每孔轻轻吸取上清液 0.7 ml,补加
0.7ml不含 FCS的 RMPI-1640,同时加 5g/LMTT
50 μl,继续培养 4h,取出培养孔 ,每孔加入 1 ml酸
性异丙醇 ,吹打均匀 ,静置 20 min,使紫色结晶完全
溶解 ,溶解液移入离心管 , 1 500 r/min离心 5 min,
取上清 200 ml于 96孔酶标板中 , 570 nm比色测光
密度(D)值 。淋巴细胞的增殖能力用加 ConA的光
密度减去不加 ConA的光密度表示 。
1.2.3　荷瘤鼠脾细胞抗体生成实验　ICR鼠接种 ,
分组 ,给药同 1.2.1, 灌胃 5天后腹腔注射 0.2 ml
20%绵羊红细胞 (约 2 ×109 /ml), 5天后无菌取脾
脏 ,用 PBS配成 3.5×106 /ml脾细胞悬液 ,于干净试
管中依次加入 1 ×107 /ml绵羊红细胞 、1∶10稀释的
豚鼠血清 、脾细胞悬液各 1 ml, 37℃水浴 1 h, 2 000
r/min离心 5 min,取上清于 413 nm处测定光密度
值[ 5] 。
1.2.4　荷瘤鼠 NK细胞活性实验　ICR鼠接种 ,分
组 ,给药同 1.2.1 ,末次给药后 24 h,无菌取脾脏 ,制
成脾细胞悬液 ,用 Hela细胞作为靶细胞 ,用 RPMI
1640完全培养基分别将效应细胞 、靶细胞调至 1.0
×107 /ml、2.0×105 /ml。加入 96孔板中 ,使效应细
胞∶靶细胞 =50∶1,另设效应细胞和靶细胞对照。
每孔 100 μl,每份标本设 3个平行孔 。置于 37℃,
5%CO2条件下杀伤 4 h,加入 MTT(5 g/L)15 μl,继
续孵育 3 h,每孔加 100 μl酸化异丙醇 ,吹打均匀 ,
使紫色结晶完全溶解。于酶标仪 570 nm处测光密
度。 NK细胞活性按下式公式计算:NK细胞活性百
分比 =[靶细胞 D值 -(实验组 D值 -效应细胞 D
值)] /靶细胞 D值 ×100%[ 6] 。
1.3　统计学处理　采用 SPSS10.0统计软件进行 F
检验 ,检验水准:α=0.05。
2　结　果
2.1　EEF的抑瘤作用及对荷瘤小鼠免疫器官的影
响　EEF在 100 ～ 500mg· kg-1·d-1范围内均有一
定的抑瘤效应 ,且 500mg· kg-1·d-1剂量组的抑瘤
率达 59.5%,超过经典的抗癌药物环磷酰胺。与环
磷酰胺在抑制肿瘤生长的同时降低荷瘤鼠的脾系数
和胸腺系数不同 ,该药能明显增加荷瘤鼠的脾系数
和胸腺系数(表 1)。
2.2　EEF对荷瘤鼠淋巴细胞转化能力及对脾细胞
抗体生成能力的影响　与模型组相比 , EEF中 、大剂
量均能明显提高荷瘤鼠脾细胞抗体生成能力(P<
0.01, P<0.05),与荷瘤对照组相比差异显著;3个
剂量组均能明显提高荷瘤鼠的淋巴细胞转化能力 ,
影响极显著(P<0.01);而环磷酰胺组对脾细胞抗
体生成能力和淋巴细胞转化无显著影响(表 2)。
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表 1　EEF的抑瘤活性及对胸腺指数和脾指数的影响(n=10, x±s)
组　别 剂　量(mg·kg-1·d-1)胸腺指数(mg/g)　 脾脏指数(mg/g)　 抑制率(%)
正常组 — 3.79±0.58＊＊ 8.15±0.84＊ —
模型组 — 2.17±0.63 7.05±0.48 —
Cy组 20 1.19±0.44＊＊ 6.56±0.73 57.1
EEF组 100 2.41±0.35 8.87±0.63＊ 38.5
250 2.76±0.31＊ 8.90±0.64＊ 41.6
500 3.33±0.21＊＊ 9.14±0.67＊ 59.5
　　　　　　　　　与模型组比较:＊P<0.05, ＊＊P<0.01
表 2　EEF对淋巴细胞转化 、脾细胞抗体生成能力的影响(n=10, x±s)
组　别 剂量(mg· kg-1· d-1)脾细胞抗体能力(D413)　 淋巴细胞转化能力(D570)　
正常组 ─ 0.165±0.025＊＊ 0.434±0.013＊＊
模型组 ─ 0.089±0.010■■ 0.235±0.019■■
Cy组 20 0.091±0.033■■■■ 0.247±0.015■■
EEF组 100 0.130±0.029 0.338±0.021＊＊■■
250 0.144±0.032＊ 0.360±0.025＊＊■■
500 0.193±0.039＊＊ 0.408±0.020＊＊
　　　　　　　　　与模型组比较:＊P<0.05, ＊＊P<0.01;与正常组比较:■P<0.01
2.3　EEF对荷瘤鼠 NK细胞活性的影响　与模型
组相比 , 3个剂量组均能提高给药鼠的 NK细胞活
性 ,差异达极显著水平(P<0.01),而环磷酰胺对荷
瘤鼠 NK细胞活性的影响无统计学意义(表 3)。
表 3　EEF对 NK细胞活性的影响(n=10, x±s)
组　别 剂量(mg· kg-1· d-1) NK细胞活性(D570)
正常组 — 　18.25±2.67＊＊
模型组 — 　 9.86±2.87
Cy组 20 　12.73±1.82
EEF组 100 　22.56±3.96＊＊
250 　31.78±2.34＊＊
500 　36.27±4.01＊＊
　　与模型组相比:＊P<0.05, ＊＊P<0.01
3　讨　论
中药增强机体免疫功能是其抗肿瘤的主要机制
之一[ 7] 。现代免疫学认为 ,人体的免疫系统具有免
疫监视功能 ,能监督机体内环境出现的突变细胞及
早期肿瘤 ,并予以清除 。因此 ,肿瘤与机体免疫系统
的状态密切相关 [ 8] 。本实验采用木蹄层孔菌灌胃
给药进行体内抗肿瘤试验 ,结果显示 EEF在 100 ～
500mg· kg-1·d-1剂量下均能明显抑制肿瘤生长 ,
其中 500 mg· kg-1· d-1给药组的抑瘤率超过了经
典的抗癌药物环磷酰胺 ,且 3个剂量组均能明显提
高荷瘤鼠的胸腺系数和脾脏系数。免疫学实验结果
显示 EEF能全面增强荷瘤鼠的非特异性免疫 、细胞
免疫和体液免疫功能 ,提示 EEF可能是通过增强宿
主免疫功能起抑制肿瘤生长的。与传统的化疗药物
在杀伤肿瘤细胞的同时又不同程度的损伤机体的免
疫功能相比 ,是较为理想的。
木蹄层孔菌乙醇提取物为一复杂的混合物 ,其
体内抗肿瘤活性是多种组分的综合作用还是某一种
或几种组分的作用 ,还有待于对其成分进行分析 ,开
展进一步的研究。
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收稿日期:2007-06-11　修回日期:2007-08-05
本文编辑:程春开
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