全 文 ：2016 年 2 月 陕西理工学院学报(自然科学版) Feb． 2016
第 32 卷第 1 期 Journal of Shaanxi University of Technology (Natural Science Edition)
Vol． 32 No． 1
［文章编号］1673 － 2944(2016)01 － 0070 － 06
开口箭种质资源的 SSＲ遗传多样性分析
王小童， 陈 征， 周天华
(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000)
［摘 要］ 为了分析开口箭的遗传多样性和遗传分化，应用 7 对微卫星引物对 15 个产地 72
份开口箭样本以及 4 个弯蕊开口箭样本进行了遗传多样性和遗传分化分析，并对这些样本进
行 UPGMA聚类分析和主相关性分析。结果表明:开口箭 15 个居群的遗传多样性指数 h 的变
化范围为 0． 082 1 ～ 0． 303 5、Nei’s遗传杂合度 HE的变化范围 0． 139 8 ～ 0． 170 2，弯蕊开口箭 4
个居群的遗传多样性指数 h的变化范围为 0． 162 9 ～ 0． 369 1、Nei’s 遗传杂合度 HE的变化范
围为 0． 112 4 ～ 0． 128 1。7 对 SSＲ引物表现出了较高的多态性，可以区分 19 个居群的开口箭
属植物样本;开口箭和弯蕊开口箭在物种水平上的遗传多样性高，遗传分化显著，聚类分析和
主相关性结果表明地理位置相近的种群亲缘关系较为相近。
［关 键 词］ 开口箭; 简单序列重复; 遗传多样性; 种质资源鉴定
［中图分类号］ Q948 ［文献标识码］ A
收稿日期:2015-09-01 修回日期:2015-11-30
基金项目:陕西省科技统筹创新工程计划项目(2015KTTSSF01-02);陕西省教育厅重点实验室科研计划项目(14JS017，
12JS026)
作者简介:王小童(1991—)，男，陕西省汉中市人，陕西理工学院硕士研究生，主要研究方向为植物种质资源鉴定;［通信
作者］周天华(1976—)，男，陕西省汉中市人，陕西理工学院讲师，博士，主要研究方向为植物分子生态学。
开口箭属(Tupistra Ker-Gawl．)植物属于百合科，在我国约有 12 种，均为多年生草本，主要产于长江
以南各省区。本属植物的根状茎及全株入药，别名竹根七(陕西)、牛尾七、岩七，具有清热解毒，散淤止
痛等功效［1］。其中以开口箭(T． chinensis，产于江西、福建、安徽、台湾、浙江、河南、陕西(秦岭以南)、四
川、云南、湖北、湖南、广西、广东等地［2］)和弯蕊开口箭(T． wattii)较常见而被广泛采挖和栽培，在少数
民族的民族药中应用较多。
目前，已有多种 DNA分子标记被用于遗传多样性分析、多种物种的分子连锁图构建、品种鉴定、分子
标记辅助育种等方面的研究［3-9］，其中 SSＲ(Simple Sequence Ｒepeat，简单序列重复)分子标记应用较广泛。
SSＲ是一类由 1 ～ 6 个碱基组成的基序串联重复而成的 DNA 序列，又称微卫星 DNA(Microsatellite
DNA)。SSＲ分子标记多态性丰富，重复性好，标记多呈共显性，并且在基因组中分散分布，现已证明其
存在于绝大多数真核生物基因组中［10］，因此微卫星分子标记技术已广泛应用于遗传图谱构建、品种指
纹图谱绘制、品种纯度检测及目标性状分子标记筛选等领域［11］。已有的对开口箭属植物的研究主要集
中在根茎和叶的组织学、花粉形态学、植物核型、化学成分以及药理作用等方面［12-13］，但迄今尚没有利
用微卫星分子标记技术对开口箭进行遗传背景分析和种质资源鉴定的报道。
由于开口箭属植物均可入药，但不同品种的有效成分普遍存在差异，甚至同一品种由于地理隔离等
方面的影响，其药效成分亦存在差异，传统的中医鉴定方法很难将其区别开来。因此，有必要开发出适
合开口箭属植物种质鉴定的分子生物学方法。本研究采用 SSＲ 标记技术，对主产于湖北、陕西两省的
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两种开口箭属植物的 19 个自然居群进行分析，旨在为开口箭属种质资源的评价筛选和分子鉴定提供技
术以及理论支撑。
1 材料与方法
1． 1 材 料
本试验在湖北、陕西两省收集了开口箭及弯蕊开口箭属植物的新鲜叶片为实验材料，取回实验室
后，洗净用硅胶干燥保存，共计 19 个种群，72 个样本，材料名称及采样地点详见表 1 和图 1。
表 1 两种开口箭属植物采样地
居群名称 采样地 纬度 经度
开口箭(T． chinensis)
镇巴(ZB) 陕西省镇巴县 N107°53 E32°33
留坝(LB) 陕西省留坝县 N106°95 E33°65
佛坪(FP) 陕西省佛坪县 N108°00 E33°55
官渡(GD) 湖北省官渡镇 N110°05 E31°60
竹山(ZS) 湖北省竹山县 N110°13 E32°20
青水(QS) 陕西省镇巴县青水乡 N107°45 E32°39
红坪(HP) 湖北省神农架林区红坪 N110°25 E31°41
庙坪(MP) 湖北省竹溪县庙坪 N109°38 E33°17
宋洛乡(SLX) 湖北省神农架林区宋洛 N110°36 E31°39
徐家庄(XJZ) 湖北省竹山县徐家坪 N110°25 E31°41
大岩屋(DYW) 湖北省神农架林区大岩屋 N109°38 E33°47
寒峰山(HFS) 陕西省略阳县寒峰山 N105°56 E33°16
敦敦石(DDS) 陕西省留坝县敦敦石 N106°95 E33°61
干河子(GHZ) 陕西省留坝县干河子 N106°95 E33°62
广家店(GJD) 陕西省南郑县西河 N106°52 E32°56
弯蕊开口箭(T． wattii)
张良庙(ZLM) 陕西省留坝县张良庙 N106°95 E33°62
闸口石(ZKS) 陕西省留坝县闸口石 N106°44 E33°40
华阳(HY) 陕西省略阳县华阳 N107°33 E33°33
华龙山(HLS) 陕西省略阳县华龙山 N105°49 E32°47
图 1 开口箭属植物采样居群分布
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第 1 期 王小童，陈征，周天华 开口箭种质资源的 SSＲ遗传多样性分析
1． 2 方 法
1． 2． 1 开口箭总 DNA的提取
采用 2 × CTAB 法［14］提取开口箭叶的总基因组 DNA，并用核酸检测仪(Eppendorf Biophotometer
plus)检测样品纯度。
1． 2． 2 扩增反应体系的建立
本研究 SSＲ位点及其引物序列是基于开口箭设计开发的，将另文发表。从 15 对引物中选出 7 对多
态性高的引物用于 DNA样品的扩增。
PCＲ总反应体系为 10 μL。DNA模板 1 μL，2 × Mix 5 μL，正反引物各 1 μL，ddH2O 2 μL。PCＲ 反
应在 PCＲ扩增仪(Biorad S1000TM)上按以下程序运行:首先 94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，退火温
度(每组引物的退火温度详见表 2)下持续 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环;最后 72 ℃延伸 7 min，4 ℃
保存。
表 2 SSＲ引物信息表
引物名称
引物序列
正向引物 反向引物
重复单元
复等位
基因数(A)
产物预期
长度
退火温度
/℃
KKJSSＲP7 CAAATAGGTGTACGGTATCTCC CATTCAAAGCGGTCTGCGAAC (CTT)5 3 133 59
KKJSSＲP10 CCAGCTGAACCCAGTTCGATT TCATATCTTGGCTTACATGC (TC)9 4 241 58
KKJSSＲP13 CTGTCTACGCCGAACCCTCGT ACATTAGCTACAACGAATGCTAC (TC)17 4 176 60
KKJSSＲP15 CTCCAAAGAGATGATCTTGAGC TGTCACATCAACTATTCACCCCT (CTT)6 3 250 58
KKJSSＲP16 CTAGGGATCCCAAAACCCTAT CATTCTATGGAGCCTTGAGC (GA)23 4 240 59
KKJSSＲP18 AGGCAATAATGATTAATTAGCTG CGGGGTGTTACAATACCATC (AAT)11 4 234 57
KKJSSＲP22 CGTCCCATTCCACATATCACC AATCGTGACCCATGCACAACT (ATG)7 4 201 59
1． 2． 3 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
完成 PCＲ循环 48 h内，取 2 μL PCＲ产物在恒电压 160 V 条件下，进行 10%非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳，时间为 14 h。用 NaOH银染方法对电泳后的聚丙烯酰胺凝胶进行染色显影。各种溶剂的配方
和体积为:银染液，1 g AgNO3，去离子水 500 mL;显影液，15 g NaOH，2 mL甲醛，去离子水 500 mL。银染
程序为:①去离子水漂洗 30 s;②银染 30 min;③去离子水漂洗 30 s;④在显影液中轻摇至显带。显影完
成之后，用凝胶成像系统(BIO-ＲAD Gel DOCTM XＲ +)采集图像并进行数据统计分析。
1． 2． 4 数据统计与分析
运用 Image Lab 软件对凝胶成像进行条带和泳道数据的分析。使用 POPGENE Version 1． 32［15］软
件，分析各引物的复等位基因数(A)、各种群的复等位基因数(NA)、遗传杂合度(HE)、Nei’s遗传多样性
指数(h)、遗传分化系数(GST)和基因流(NM)。采用 MEGA5． 0 软件基于各居群的遗传距离进行 UPG-
MA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)聚类分析。使用 GenAlEx 6． 3 软件［16］进行居群
主相关性分析(Principal Coordinates Analysis，PCA)，用以检测居群间的相互关系。此外还应用 GenAlEx
6． 3 软件计算了两种开口箭属植物各种群地理距离和遗传距离的相关性(Mantel Test)。
2 实验结果与分析
2． 1 开口箭和弯蕊开口箭的遗传多样性分析
对参试材料进行 PAGE电泳，如图 2 所示，中间纵排数字所标为标准 Marker 的分子量，顶端横排数
字所标为 1 ～ 40 个样本编号，发现开口箭和弯蕊开口箭共计 19 个居群的 72 份样本中，采用 7 对引物共
检测到 203 个多态性位点。其中，在物种水平上，开口箭居群的多态性位点为 160 个，平均值为 11 个。
弯蕊开口箭的多态性位点为 43 个，平均值为 11 个。
开口箭和弯蕊开口箭的遗传多样性参数详见表 3。开口箭 15 个居群的遗传多样性指数 h 的变化
范围 0． 082 1 ～ 0． 303 5、Nei’s遗传杂合度 HE 的变化范围 0． 139 8 ～ 0． 170 2，弯蕊开口箭 4 个居群的遗
传多样性指数(h)的变化范围 0． 162 9 ～ 0． 369 1、Nei’s 遗传杂合度(HE)的变化范围为 0． 112 4 ～
0． 128 1。
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陕西理工学院学报(自然科学版) 第 32 卷
图 2 KKJ18 号 SSＲ引物扩增效果
表 3 两种开口箭属植物的遗传多样性分析
居群名称 样本数
复等位
基因数(NA)
基因多样性
指数(h)
期望杂合度
(HE)
开口箭(T． chinensis)
镇巴(ZB) 4 12 0． 252 1 0． 164 5
留坝(LB) 4 10 0． 224 4 0． 167 2
佛坪(FP) 4 10 0． 179 1 0． 165 2
官渡(GD) 4 12 0． 116 1 0． 143 8
竹山(ZS) 4 11 0． 152 1 0． 147 5
青水(QS) 4 9 0． 303 5 0． 162 2
红坪(HP) 4 10 0． 221 8 0． 139 8
庙坪(MP) 4 10 0． 301 2 0． 145 6
宋洛乡(SLX) 4 12 0． 240 2 0． 147 3
徐家庄(XJZ) 4 12 0． 131 6 0． 151 2
大岩屋(DYW) 4 12 0． 082 1 0． 145 5
寒峰山(HFS) 4 10 0． 220 2 0． 168 9
敦敦石(DDS) 4 9 0． 216 7 0． 165 6
干河子(GHZ) 4 11 0． 224 4 0． 170 2
广家店(GJD) 2 10 0． 330 2 0． 164 8
物种水平 160 0． 240 8
平均 11 0． 136 5
弯蕊开口箭(T． wattii)
张良庙(ZLM) 4 9 0． 162 9 0． 112 5
闸口石(ZKS) 2 12 0． 369 1 0． 123 2
华阳(HY) 4 12 0． 274 7 0． 128 1
华龙山(HLS) 2 10 0． 228 7 0． 112 4
物种水平 43 0． 202 6
平均 11 0． 112 8
POPGENE分析结果显示开口箭居群间的遗传分化指数(GST)为 0． 404 6，说明有 40． 46%的遗传变
异来自于居群间，59． 54%的变异来自居群内，基因流(NM)为 0． 625 3(﹤ 1)，说明开口箭居群的基因交
流较低;弯蕊开口箭居群间的 GST值为 0． 362 5，说明居群内的变异大于居群间的变异，NM 为 0． 724 6(﹤
1)，说明弯蕊开口箭居群也有较低的基因交流。
通过 Mantel测试显示，开口箭居群之间的遗传距离与其相应的地理距离呈显著的正相关关系(r =
0． 723，p ＜ 0． 01);弯蕊开口箭居群之间的遗传距离与其相应的地理距离呈显著的正相关关系(r =
0． 771，p ＜ 0． 01)。
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第 1 期 王小童，陈征，周天华 开口箭种质资源的 SSＲ遗传多样性分析
2． 2 基于 SSＲ标记的聚类分析
用 MEGA5． 0 软件进行聚类分析，构建 UPGMA(Unweighted pair group method using arithmetic aver-
age)聚类树，如图 3 所示。由图中聚类分析显示开口箭和弯蕊开口箭在遗传上有明显的差异，15 个开
口箭居群聚为一大支，而 4 个弯蕊开口箭聚为一大支。开口箭的 15 个居群又聚为两组:湖北 7 个居群
(GD、XJZ、HP、DYW、SLX、MP、ZS)聚为一小支，陕西 8 个居群(ZB、FP、LB、GHZ、DDS、HFS、QS、GJD)聚
为另一小支。使用 GenAlEx 6． 3 软件进行居群主相关性分析(图 4)，其结果与 UPGMA聚类分析的结果
完全一致，开口箭居群能与弯蕊开口箭完全分开，15 个开口箭种群分为两组。
图 3 基于 Nei’s无偏差遗传距离的 UPMGA聚类树
图 4 开口箭和弯蕊开口箭各个居群的主相关性分析图(PCA)
3 讨 论
采用 SSＲ分子标记分析时发现:开口箭在物种水平上的 PPL为 78． 8%，HE 为 0． 240 8，弯蕊开口箭
在物种水平上的 PPL 为 21． 2%，HE 为 0． 202 6，说明开口箭在物种水平上的遗传多样性非常丰富。开
口箭在物种水平上具有较高的遗传多样性，可能与开口箭的生活史和自身繁育系统有关。开口箭属植
物大多分布在海拔 1 200 ～ 1 800 m的竹林湿地或小溪旁，生境较特殊，以至该属植物的个体寿命较长，
长势较缓慢。并且该属植物属于兼性克隆植物，具有有性生殖又伴有无性生殖。以上这些特征都为开
口箭的遗传变异的积累提供了条件。有研究表明，在地理分布上受限的植物具有较低的遗传多样性，相
反，分布范围越广的物种具有越高的遗传多样性［17-19］。开口箭属植物属于起源比较晚的物种类别，分
布区域较大，该属植物在湖北、湖南、陕西、安徽、河南、四川、云南等地的山区均有分布，这些地区属于温
带气候，适合该物种的生长。因此，虽然由于人为活动以及自然变迁的影响导致开口箭的自然分布呈现
斑块状，但是该属植物频繁的基因交流使其具有丰富的遗传变异，并通过无性繁殖保存下来。
物种的遗传多样性在该物种居群内和居群间的分布称为该物种的遗传分化。Buso 等［20］提出 GST
大于 0． 25 反映出该物种在居群间的遗传分化较为显著。本研究中开口箭的遗传分化指数 GST =
0． 404 6，弯蕊开口箭的遗传分化指数 GST = 0． 362 5。由以上数据看两种开口箭属植物的遗传分化都较
为显著，而且开口箭的遗传分化程度更高。一般来说，地理分布、生活史、繁育系统、种子扩散机制以及
·47·
陕西理工学院学报(自然科学版) 第 32 卷
分类地位等是影响遗传结构的重要因素［21］。根据分析，开口箭遗传分化显著可能与以下几个方面的因
素有关。
(1)地理隔离是显著遗传分化的原因。该物种的 Mantel 测试显示，开口箭居群之间的遗传距离与
其相应的地理距离呈显著的正相关关系(r = 0． 723，p ＜ 0． 01);弯蕊开口箭居群之间的遗传距离与其相
应的地理距离呈显著的正相关关系(r = 0． 771，p ＜ 0． 01)。表明不同山脉形成的生境不同，以及秦岭、巴
山不同山脉的走向等地理因素影响，使得开口箭各居群间出现显著的地理隔离现象。
(2)克隆生长是产生显著遗传分化的一个重要因素。Pluess 及 Erickson 等［22-23］指出物种的克隆繁
殖会影响有性繁殖的资源供给，最终会导致该物种居群内及种群间的遗传分化。通过对开口箭属植物
采样发现，开口箭是可以通过地下茎进行无性繁殖。
(3)繁育系统是影响开口箭居群间遗传分化的因素之一。Hamrick 和 Godt［24］的研究结果表明自交
植物的遗传分化系数 GST均值为 0． 510，异交植物的 GST均值为 0． 099，说明自交植物的遗传分化程度远
大于异交植物。本研究所得开口箭的 GST为 0． 404 6，表明开口箭有自交为主的繁育系统，这是使得开口
箭居群间遗传分化较大的重要原因。
本研究在分子水平上为研究开口箭居群的遗传多样性及种群之间的亲缘关系、植物的种质资源及
其在种质资源鉴定方面提供了可靠的方法。
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(下转第 88 页)
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第 1 期 王小童，陈征，周天华 开口箭种质资源的 SSＲ遗传多样性分析
Application of analytic hierarchy process to the evaluation system
for innovative training model
DUAN Xing-xing， WU Ya-dong
(School of Computer and Technology，Southwest University of Science and Technology，
Mianyang 621010，China)
Abstract: University laboratory is a key platform to cultivate innovative talents in China． The study
makes an assessment of talents training mode of university laboratory through analytic hierarchy process． Com-
bining the assessment with opinions from relevant experts，the paper builds a laboratory evaluation system on
talent cultivation． Then based on the empirical analysis of the laboratory training data in a university，the ef-
fectiveness of the established analytic hierarchy process is verified． The evaluation system can help universities
to do laboratory self-diagnosis，and improve the laboratory training model，so that it can better meet the needs
of society for innovative talents．
Key words: evaluation index system; analytic hierarchy process; university laboratory; innovative
teaching modes
(上接第 75 页)
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［责任编辑:李 莉］
Germplasm resources identification of Tupistra chinensis
WANG Xiao-tong， CHEN Zheng， ZHOU Tian-hua
(School of Biological Science ＆ Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China)
Abstract: To reveal the genetic diversity and differentiation of T． chinensis varieties． 7 SSＲ primer pairs
were screened out from 16 to investigate the genetic diversity and identify the 72 varieties of T． chinensis from
15 producing areasand 4 varieties of T． wattii，Cluster analysis and principal coordinate analysis were used to
reveal the relationship of the varieties． The genetic diversity index range from 0． 082 1 ～ 0． 303 5 and the ex-
pected heterozygosity index range from 0． 139 8 ～ 0． 170 2 of the 15 T． chinensis populations，the genetic diver-
sity index range from 0． 162 9 ～ 0． 369 1 and the expected heterozygosity index range from 0． 112 4 ～ 0． 128 1
of the 4 T． wattii populations． 7 SSＲ primer pairs can distinguish the 72 varieties from each other clearly，high
genetic diversity and strong genetic differentiation were detected at species level for both T． chinensis and
T． wattii，varieties from adjacent area performed a more tighten relationship．
Key words: T． chinensis; SSＲ; genetic diversity; germplasm resources identification
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陕西理工学院学报(自然科学版) 第 32 卷