全 文 ：菌物学报
jwxt@im.ac.cn 15 July 2013, 32(4): 690-697
Http://journals.im.ac.cn Mycosystema ISSN1672-6472 CN11-5180/Q © 2013 IMCAS, all rights reserved.
基金项目：国家自然科学基金（No. 30830117）；国际科技合作项目（No. 2011DFA31260）；高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（No.
20091106110003）
*Corresponding author. E-mail: sxguo2006@yahoo.com.cn
收稿日期: 2012-05-09, 接受日期: 2012-06-04
药用真菌猪苓溶血素基因克隆和序列分析
宋超 郭顺星*
北京协和医学院 中国医学科学院 药用植物研究所 北京 100193
摘 要：利用 3′-RACE-PCR方法首次从药用真菌猪苓中克隆得到与真菌形态发育相关的溶血素基因。结果表明，猪
苓溶血素基因的全长 cDNA为 744bp，其中编码区占 447bp，共编码 148个氨基酸，推测其分子量约为 15.79kDa，理
论等电点为 4.89。推定的猪苓溶血素蛋白具有与杨树菇溶血素类蛋白家族相同的结构域和功能位点，两者同源性为
60%。系统进化树结果显示猪苓溶血素隶属于担子菌类群。实时荧光定量 PCR分析结果表明在菌核形成初期猪苓
溶血素基因表达量较高，且显著高于菌丝体中猪苓溶血素基因的转录水平，说明溶血素基因参与了猪苓菌核的形态
发育。
关键词：猪苓，溶血素，3′-RACE，实时荧光定量 PCR，菌核
Molecular cloning and characterization of a hemolysin gene
from medicinal fungus Polyporus umbellatus
SONG Chao GUO Shun-Xing*
Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100193, China
Abstract: The hemolysin gene relative to fungal metamorphosis was firstly cloned from medicinal fungus Polyporus
umbellatus by 3 ′ rapid amplification of cDNA end PCR (RACE). A 744bp full-length cDNA of hemolysin gene contained
447bp ORF, which was predicted to encode a 334-amino acid protein of 15.79kDa with an isoelectronic point (pI) of 4.89.
The deduced umbellolysin protein contained the structure domain and functional sites of aegerolysin, showing 60% identical
to aegerolysin, and clustered with basidiomycete group in the phylogenetic analysis. Quantitative real-time PCR analysis
revealed that umbellolysin transcripts were abundant in the beginning of sclerotial formation (20–30 days), the transcripts
levels of P. umbellatus umbellolysin gene were particularly higher in sclerotia than mycelia, suggesting that the gene was
involved in sclerotial development in P. umbellatus.
Key words: Polyporus umbellatus, hemolysin, 3′-RACE, quantitative real-time PCR, sclerotium
DOI:10.13346/j.mycosystema.2013.04.003
宋超和郭顺星 /药用真菌猪苓溶血素基因克隆和序列分析
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溶血素（hemolysin）是一类毒性蛋白，能
直接作用于宿主细胞的细胞膜，造成其结构和
功能的紊乱以致细胞死亡，目前为止，已经在
细菌、真菌、藻类和植物中发现了溶血素的存
在（Sakaguchi et al. 1975；Barloy et al. 1998）。
2002年，Berne et al.（2002，2007）定义了新的
杨树菇溶血素蛋白家族（aegerolysin，PF06355），
包括一些分离和测序得到的蛋白序列和基因组
转录本，或由表达序列标签（expressed sequences
tag，EST）预测得到的蛋白序列。Ebina et al.
（1994）从曲霉 Aspergillus fumigatus 中分离得
到了该家族中第一个蛋白，曲霉溶血素
（Asp-hemolysin）。这一蛋白被认为参与了曲霉
的致病过程（Rementeria et al. 2005）。随着真菌
基因组的大规模测序，相继发现了一些与曲霉
溶血素相似的蛋白序列。Fernandez-Espinar &
Labarere（1997）从杨树菇 Agrocybe aegerita 中
克隆得到了在子实体原基中特异表达基因
Aa-Pri1，该基因编码的蛋白与曲霉溶血素蛋白
有 43%的同源性。Sakurai et al.（2004）从杏鲍
菇Pleurotus eryngii中分离得到了杏鲍菇溶血素
（eryngolysin）；Ngai & Ng（2006）从糙皮侧耳
Pleurotus ostreotus 中分离得到了糙皮侧耳溶血
素（ostreolysin）；Han et al.（2010）在裂褶菌
Schizophyllum commune 中也分离得到了溶血素
蛋白。这些新分离得到的溶血素都与杨树菇溶
血素具有同源性。 2005 年，Schachter et al.
（2005）发现侧耳中的溶血素蛋白 eryngolysin
和 ostreolysin对 L1210小鼠白血病细胞具有毒
性作用，并能够抑制小鼠脾细胞的有丝分裂，
而 PEG10000可抑制该类蛋白的活性，但对抗
增殖和抗促有丝分裂的活性没有影响。上述这
些蛋白均被归类为杨树菇溶血素蛋白家族，该
家族蛋白分子量一般为 15–17kDa，呈酸性，在
膜活性和形态发育方面具有重要的生物学特性
（Sepcić et al. 2003）。溶血素的作用机理与其膜
活性密切相关，在研究糙皮侧耳溶血素诱导的
裂解作用中发现，首先，溶血素 A与膜上的鞘
磷脂结合，之后溶血素 B再结合上去形成环状
结构，进而在红细胞膜上形成特殊小孔，通过
胶体渗透机制诱导溶血作用发生（Tomita et al.
2004）。菌核是真菌适应逆境的休眠结构，由交
织的营养菌丝聚集而形成，常见于担子菌和子
囊菌中。猪苓是我国的重要食药用真菌（戴玉
成和杨祝良 2008；戴玉成等 2010），其菌核由
皮层细胞和髓部组织构成，因其具有药用价值
（Dai et al. 2009）而被广泛关注，但目前的研
究多集中于药理活性的测定和化学活性物质的
分离纯化等方面（Sun & Yasukana 2008；Zhou &
Guo 2009；Zhao et al. 2009，2011），缺乏对菌
核发育分子机理的研究。为此，我们通过
3′-RACE-PCR方法从猪苓中克隆得到了溶血素
基因的同源基因（umbellolysin），并通过实时荧
光定量 PCR技术分析了菌核形成过程中猪苓溶
血素基因的表达量，为研究猪苓菌丝形成菌核
的分子机制奠定了理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
猪苓菌种由北京协和医学院药用植物研究
所真菌室提供。
1.2 猪苓菌核培养及总 RNA 提取
猪苓菌丝形成菌核的培养见 Liu & Guo
（2009）的方法。培养 20–30d后猪苓菌核形成，
第 30–40d是菌核的快速生长期，直至 50–60d
时菌核停止生长。分别取初期菌核、发育菌核、
成熟菌核（SP、SG、SL）和生长时期未形成菌
核的菌丝（HP、HG、HL）作为材料进行以下
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实验。
总 RNA 的提取采用改进的 CTAB 法
（Iandolino et al. 2004）。
1.3 3′-RACE-PCR 和序列分析
通过 3′-RACE-PCR 方法获得猪苓溶血素
（umbellolysin）全长 cDNA。根据已知溶血素
蛋白氨基酸序列的保守区域设计合成引物
umbellolysin-GSP2：5′-CAGACTCAAACCACC
TGTCCACATCCC-3 ′。 3 ′ -RACE 实验使用
SMART™ RACE cDNA Amplification 试剂盒
（Clontech）。PCR反应产物经 1.8%琼脂糖凝胶
电泳分离后得到目的条带，经切胶纯化后连接
于 pGEM-T载体（Promega）上，连接体系为：
5μL RT-PCR产物，2μL pGEM-T vector，1.5μL
10×连接缓冲液，0.5μL T4 DNA连接酶，4℃连
接 12h。将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞
Escherichia coli JM109（TaKaRa），阳性克隆由
北京金唯智生物科技有限公司进行测序。
使用以下程序对获得的 cDNA序列进行分
析 ： VecScreen （ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
VecScreen/VecScreen.html），CAP3，ORF Finder
（ http://www.ncbi.nlh.nih.gov/gorf/gorf.html），
BLAST同源比对（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
blast/）和 ExPASy 蛋白序列分析（http://www.
expasy.ch/tools/）。对推定的猪苓溶血素蛋白分
别用DNAstar 6.0和MEGA 4.0进行多序列聚类
比对，构建系统进化树。
1.4 实时荧光定量 PCR 分析
样本 SP、HP、SG、HG、SL和 HL各取
2μg总 RNA进行反转录（Promega）。采用实时
荧光定量 PCR方法检测不同样本中猪苓溶血素
基因的表达量变化，以猪苓 18S rRNA基因作为
内参基因。根据已知序列设计猪苓溶血素实时
荧 光 定 量 PCR 引 物 ： umbellolysin-FP ：
5 ′ -CGCCCTT GGATCTTTCGC-3 ′ ；
umbellolysin-RP ： 5 ′ -GGGA
GCAGACTCAAACCACCT-3′。18S rRNA基因引
物：18S-FP：5′-CCTTGTGCTGGCGATGCT-3′；
18S-RP：5 ′-GCTGCCTTCCTTGGATGTG-3 ′。
实时荧光定量 PCR 反应操作按照 SYBR®
Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKaRa）方法进行。
使用 ABI 7500定量 PCR仪。定量 PCR反应体
系为：12.5μL 2×SYBR® Premix Ex TaqTMMaster
Mix，0.5μL引物（10μmol/L），0.5μL ROX染
料，2μL cDNA模板，9μL灭菌水。循环参数
设定为：预变性 95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 34s，
共 40 个循环，同时做熔解曲线。Ct（cycle
threshold）值由 ABI PRISM 7500软件生成，采
用∆∆CT法计算相对表达量。
2 结果与分析
2.1 猪苓溶血素基因的克隆
以 umbellolysin-GSP2 为 引 物 ， 利 用
3′-RACE-PCR技术，并去掉载体和接头后得到
一个长为 401bp 的片段，与猪苓 EST 序列
（JU062378）聚类拼接后获得了猪苓溶血素基
因 cDNA，全长 744bp，GenBank 登录号为
JQ970326。根据基因全长 cDNA推定的氨基酸
序列（图 1）。猪苓溶血素基因的 ORF区长为
447bp，共编码 148个氨基酸，推测分子量约为
15.790kDa，理论等电点为 4.89。InterProScan
软件分析猪苓溶血素蛋白，显示其具有溶血素
类蛋白（hemolysin 和 aegerolysin）的结构域和
功能位点（图 2）。
运用 DNAstar 6.0软件中的MegAlign程序
对猪苓溶血素蛋白和杨树菇溶血素类蛋白进行
多序列比对，结果表明猪苓溶血素蛋白与杨树
菇类溶血素蛋白具有较高的同源性（图 3）。猪
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苓溶血素蛋白（umbellolysin）与杨树菇溶血素
图 1 猪苓溶血素基因全长 cDNA 和根据编码区推定的氨基酸序列 方框内分别为起始和终止序列.
Fig. 1 The full length cDNA of umbellolysin gene and its amino acid sequences deduced according to the coding region. Triple nucleotide
bases boxed are the start and stop codons, respectively.
图 2 InterProScan 软件对猪苓溶血素保守区的分析
Fig. 2 Analyses of conserved domains of umbellolysin by Interproscan software.
蛋白（ aegerolysin）、糙皮侧耳溶血素蛋白
（ostreolysin和 pleurotuolysin）、杏鲍菇溶血素
蛋白（eryngeolysin）的同源性均为 61%，而与
曲霉溶血素蛋白（Asp-hemolysin）的同源性为
42%。利用MEGA 4.0软件构建了包括猪苓溶血
素蛋白（umbellolysin）在内共 11个溶血素类蛋
白的系统进化树（图 4）。可以看到，包括猪苓
在内的所有担子菌均聚类在同一类群，其姐妹
群 为 曲 霉 。 铜 绿 假 单 胞 菌 Pseudomonas
aeruginosa 和双酶梭菌 Clostridium bifermentans
聚类在另一分支。费希新萨托菌 Neosartorya
fischeri 和粗糙脉孢菌 Neurospora crassa 并没有
与曲霉聚类在同一子囊菌类群，而是各自在不
同 的 分 支 。 苏 云 金 芽 孢 杆 菌 Bacillus
thuringiensis 也没有与其他细菌聚类在同一细
菌类群，而是最先分支。
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图 3 猪苓溶血素氨基酸序列的聚类分析 黑框代表相同的氨基酸
Fig. 3 Cluster analysis of the predicted amino acid sequences of umbellolysin gene. The black boxes indicate the identical residues.
图 4 11 个溶血素类蛋白的系统进化树
Fig. 4 The neighbor-joining phylogenetic tree of 11 hemolysin proteins.
2.2 菌核形成过程中猪苓溶血素基因的差异表达
为了验证猪苓溶血素基因在菌核生长过程
中的表达模式，分别提取培养 20–30d、30–40d
和 50–60d的菌核和菌丝体的总 RNA，利用实
时荧光定量 PCR方法测定不同培养时间内菌核
和菌丝 mRNA的表达量。以初期菌核样本 SP
为对照组，检测了猪苓溶血素基因在菌核组织
中不同生长时期的转录水平（图 5A）。结果表
明，在菌核形成初期猪苓溶血素基因的表达量
最高，并随着菌核的生长而逐渐降低，发育菌
核 SG和成熟菌核 SL溶血素基因的表达量分别
为初期菌核 SP的 0.697和 0.163倍。分别以不
同培养时间的菌丝体样本 HP、HG、HL为对照
组，检测了猪苓溶血素基因在相同培养条件和
时间下菌核和菌丝体中的差异表达。结果表明，
猪苓溶血素基因在菌核组织中的表达量显著高
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于在菌丝体中的，SP的溶血素表达量是 HP的
23.518倍，SG的溶血素表达量是 HG的 7.175
倍，SL的溶血素表达量是 HL的 1.107倍（图
5B–D）。
图 5 菌核形成过程中猪苓溶血素基因的差异表达
Fig. 5 Differential expression analysis of umbellolysin gene during sclerotial growth.
3 讨论
溶血素因其细胞毒性和致病性而被广泛关
注，直到发现杨树菇类溶血素科研人员才渐渐
了解有关溶血素在形态发育中的作用。本文利
用3′-RACE-PCR方法首次从猪苓中克隆得到溶
血素全长 cDNA，InterProScan软件分析显示猪
苓溶血素的氨基酸序列具有与杨树菇类溶血素
相同的结构域和功能位点，同源性在 60%以上。
系统进化树结果显示猪苓溶血素属于担子菌类
群，且担子菌的溶血素蛋白在进化上相对保守，
为一单系群。而子囊菌的溶血素蛋白各自在不
同的分支，细菌中的溶血素蛋白也未构成单系
群。这可能与子囊菌和细菌中溶血素的多类型
相关，担子菌中仅发现两个溶血素亚型（Berne
et al. 2009）。这些结果均表明克隆得到的全长
cDNA是猪苓中新的溶血素全长基因。
本研究利用实时荧光定量 PCR技术检测了
不同培养时期猪苓的菌核和菌丝体溶血素基因
的表达水平，发现在猪苓菌丝形成菌核初期溶
血素基因的表达水平最高，是相同培养条件下
菌丝组织中表达量的 23倍。随着菌核的生长发
育成熟，菌核中溶血素基因的表达量也迅速降
低，成熟菌核中溶血素基因的表达量与菌丝中
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的表达量基本一致。结果表明猪苓溶血素在菌
核形成初期的菌核组织中特异表达，认为猪苓
溶血素与菌核形成有关。Berne et al.（2007）采
用细胞免疫化学技术对糙皮侧耳溶血素蛋白和
杨树菇溶血素蛋白在菌丝体和子实体中的表达
情况进行详细监测，发现这两类溶血素蛋白出
现在快速生长的原基、担子和担孢子中，认为
这类溶血素蛋白作用于原基形成和产孢过程。
Barloy et al. （ 1998 ） 在 细 菌 Clostridium
bifermentans 中也观察到了同样的结果，细菌中
的杨树菇类溶血素蛋白在产孢过程中表达。在
菌丝体中加入外源的侧耳溶血素蛋白可以显著
增加糙皮侧耳子实体产量。综上我们认为猪苓
溶血素同样参与了菌核的形态发育，其在初始
菌核中的特异表达说明猪苓溶血素作用于菌丝
形成菌核时期。Beren et al.（2002）杨树菇溶血
素蛋白基因 Aa-Pri1的 mRNA表达水平与原基
发育水平相一致，认为该蛋白可能参与了原基
菌丝凝结过程。Vidic et al.（2005）发现溶血素
蛋白仅在子实体边缘组织和菌褶中被观察到，
说明其可能参与了菌丝的分化和担子、担孢子
的形成。菌核是菌丝相互交织、聚集形成的致
密团块状结构。菌核形成初期是菌丝交织、凝
结的过程，猪苓溶血素可能作用于菌丝细胞膜
表面，诱导菌丝间相互识别和交织，从而形成
菌丝团，开始菌核的发育。
[REFERENCES]
Barloy F, Lecadet MM, Delecluse A, 1998. Cloning and
sequencing of three new putative toxin genes from
Clostridium bifermentans CH18. Gene, 211: 293-299
Berne S, Krizaj I, Pohleven F, Turk T, Macek P, Sepcić K, 2002.
Pleurotus and Agrocybe hemolysins, new proteins
hypothetically involved in fungal fruiting. Biochimica et
Biophysica Acta, 1570: 153-159
Berne S, Lah L, Sepčić K, 2009. Aegerolysins: structure,
function, and putative biological role. Protein Science, 18:
694-706
Berne S, Pohleven J, Vidic I, Rebolj K, Pohleven F, Turk T,
Macek P, Sonnenberg A, Sepcić K, 2007. Ostreolysin
enhances fruiting initiation in the oyster mushroom
(Pleurotus ostreatus). Mycology Research, 111: 1431-1436
Dai YC, Yang ZL, 2008. A revised checklist of medicinal fungi in
China.Mycosystema, 27: 801-824 (in Chinese)
Dai YC, Yang ZL, Cui BK, Yu CJ, Zhou LW, 2009. Species
diversity and utilization of medicinal mushrooms and fungi
in China (review). International Journal of Medicinal
Mushrooms, 11: 287-302
Dai YC, Zhou LW, Yang ZL, Wen HA, Bau T, Li TH, 2010. A revised
checklist of edible fungi in China. Mycosystema, 29: 1-21 (in
Chinese)
Ebina K, Sakagami H, Yokota K, Kondo H, 1994. Cloning and
nucleotide sequence of cDNA encoding Asp-hemolysin from
Aspergillus fumigatus. Biochimica et Biophysica Acta, 1219:
148-150
Fernandez-Espinar MT, Labarere J, 1997. Cloning and
sequencing of the Aa-Pri1 gene specifically expressed during
fruiting initiation in the edible mushroom Agrocybe aegerita,
and analysis of the predicted amino-acid sequence. Current
Genetics, 32: 420-424
Han CH, Zhang GQ, Wang HX, Ng TB, 2010. Schizolysin, a
hemolysinfromthe split gillmushroom Schizophyllum
commune. FEMS Microbiology Letters, 309: 115-121
Iandolino AB, Goes da Silva F, Lim H, Choi H, Williams LE,
Cook DR, 2004. High-quality RNA, cDNA, and derived
EST libraries from grapevine (Vitis vinifera L.). Plant
Molecular Biology Reporter, 22: 269-278
Liu YY, Guo SX, 2009. Nutritional factors determining sclerotial
formation of Polyporus umbellatus. Letters in Applied
Microbiology, 49: 283-288
宋超和郭顺星 /药用真菌猪苓溶血素基因克隆和序列分析
菌物学报
697
Ngai PHK, Ng TB, 2006. A hemolysin from the mushroom
Pleurotus eryngii. Applied Microbiology and Biotechnology,
72: 1185-1191
Rementeria A, López-Molina N, Ludwig A, Vivanco AB, Bikandi
J, Pontón J, Garaizar J, 2005. Genes and molecules involved
in Aspergillus fumigatus virulence. Revista Iberoamericana
de Micología, 22: 1-23
Sakaguchi O, Shimada H, Yokota K, 1975. Purification and
characteristics of hemolytic toxin from Aspergillus
fumigatus. Japanese Journal of Medical Science & Biology,
28: 328-331
Sakurai N, Kaneko J, Kamio Y, Tomita T, 2004. Cloning,
expression, and pore-forming properties of mature and
precursor forms of pleurotolysin, a sphingomyelinspecific
two-component cytolysin from the edible mushroom
Pleurotus ostreatus. Biochimica et Biophysica Acta, 1679:
65-73
Schachter EN, Zuskin E, Goswami S, Castranova V, Arumugam
U, Whitmer M, Siegel P, Chiarelli A, Fainberg J, 2005.
Pharmacological study of oyster mushroom (Pleurotus
ostreatus) extract on isolated guinea pig trachea smooth
muscle. Lung, 183: 63-71
Sepcić K, Berne S, Potrich C, Turk T, Macek P, Menestrina G,
2003. Interaction of ostreolysin, a cytolytic protein from the
edible mushroom Pleurotus ostreatus, with lipid membranes
and modulation by lysophospholipids. European Journal of
Biochemistry, 270: 1199-1210
Sun Y, Yasukawa K, 2008. New anti-inflammatory ergostane-type
ecdysteroids from the sclerotium of Polyporus umbellatus.
Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 18: 3417-3420
Tomita T, Noguchi K, Mimuro H, Ukaji F, Ito K,
Sugawara-Tomita N, Hashimoto Y, 2004. Pleurotolysin, a
novel sphingomyelin-specific two-component cytolysin from
the edible mushroom Pleurotus ostreatus, assembles into a
transmembrane pore complex. Journal of Biological
Chemistry, 279: 26975-26982
Vidic I, Berne S, Drobne D, Macek P, Frangez R, Turk T, Strus J,
Sepcic K, 2005. Temporal and spatial expression of
ostreolysin during development of the oyster mushroom
(Pleurotus ostreatus). Mycological Research, 109: 377-382
Zhao YY, Xie RM, Chao X, Zhang Y, Lin RC, Sun WJ, 2009.
Bioactivity-directed isolation, identification of diuretic
compounds from Polyporus umbellatus. Jounal of
Ethnopharmacology, 126: 184-187
Zhao YY, Zhang L, Mao JR, Cheng XH, Lin RC, Zhang Y, Sun
WJ, 2011. Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one isolated from
Polyporus umbellatus prevents early renal injury in
aristolochic acid-induced nephropathy rats. Journal of
Pharmacy and Pharmacology, 63: 1581-1586
Zhou W, Guo S, 2009. Components of the sclerotia of Polyporus
umbellatus. Chemistry of Natural Compounds, 45: 24-125
[附中文参考文献]
戴玉成，杨祝良，2008. 中国药用真菌名录及部分名称的修订.
菌物学报，27: 801-824
戴玉成，周丽伟，杨祝良，文华安，图力古尔，李泰辉，2010.
中国食用菌名录. 菌物学报，29: 1-21