全 文 ：0 引言
金黄色葡萄球菌是医院和社区获得性感染的常见
病原菌[1]，同时也是引起奶牛和山羊乳房炎最重要的
病原菌。目前，全世界有三分之一的奶牛患有奶牛乳
腺炎，每年因乳腺炎造成的损失高达350亿美元[2]。金
葡菌的致病性很大程度上取决于其所分泌的外毒素，
如α-溶血素、凝固酶、毒性休克毒素综合征毒素-I和肠
毒素等[3]。
α-溶血素是一种具有细胞溶解、溶血和皮肤坏死
活性的成孔毒素。许多哺乳动物细胞包括红细胞、单
核细胞、淋巴细胞和内皮细胞都对α-溶血素敏感[4]。α-
溶血素主要在对数生长后期和平台期表达，以33.2 kD
的可溶性的单体形式分泌[5]。通过结合到敏感细胞的
细胞膜上，α-溶血素单体寡聚化形成一个 232.4 kD的
膜插入的七聚体[4]。据McElroy等报道，在兔的金葡菌
肺炎模型中，α-溶血素能够破坏肺脏的气血屏障[6]。此
基金项目：重庆市科技创新能力建设“甘草查尔酮A对金葡菌的作用研究”(CSTC,2009CB1010)。
第一作者简介：吴金梅，1970年出生，女，，河南新县人在读博士，研究方向：兽医药理与毒理学。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号吉
林大学农学部畜牧兽医学院，Tel：0431-87836161，E-mail：meizi1868@126.com。
通讯作者：邓旭明，1964年出生，男，湖南邵阳人，博士，研究方向：兽医药理与毒理学。通信地址：130062吉林省长春市西安大路5333号吉林大学农
学部畜牧兽医学院，Tel：0431-87836161，E-mail：dengxm@jlu.edu.cn。
收稿日期：2011-06-01，修回日期：2011-08-23。
异土木香内酯降低金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达
吴金梅 1,2，邱家章 1，邓旭明 1
（1吉林大学畜牧兽医学院，长春 130062；2郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450002）
摘 要：为了考察异土木香内酯对金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并研究其对金葡菌α-溶血素表达的影响，
应用肉汤微量稀释法测定异土木香内酯对金葡菌标准株的最低抑菌浓度，采用溶血试验、Western-blot
分析和荧光定量PCR分析测定异土木香内酯对金葡菌α-溶血素表达的影响。结果表明，异土木香内酯
在2048 μg/mL仍然不能抑制金葡菌的生长，然而低浓度（1~8 μg/mL）的异土木香内酯能够剂量依赖性
地降低金葡菌α-溶血素的表达。该研究提示异土木香内酯可作为以毒力因子为靶标的抗感染药物开发
的先导结构。
关键词：金黄色葡萄球菌；α-溶血素；异土木香内酯
中图分类号：S859.7 文献标志码：A 论文编号：2011-1628
Isoalantolactone Reduces α-toxin Production by Staphylococcus aureus
Wu Jinmei1,2, Qiu Jiazhang1, Deng Xuming1
(1College of Animal Science and Veterinary Medicine, Jilin University, Changchun 130062;
2Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450002)
Abstract: In the study, we aimed to investigate the antimicrobial activity of isoalantolactone against
Staphylococcus aureus, and further assess the influence of isoalantolactone on the production of α-toxin by S.
aureus. The minimal inhibitory concentrations (MICs) were determined by a broth micro-dilution method. The
effects of isoalantolactone on α-toxin production were assessed by hemolysis, western blot, and real-time
RT-PCR assays. The MICs of isoalantolactone against S. aureus strains were greater than 2048 μg/mL.
However, low concentrations of isoalantolactone (1-8 μg/mL) could substaintially inhibit the expression of
α-toxin by S. aureus. The data present here indicate that isoalantolactone might potentially be used as a lead
compound for the development of anti-virulence drug.
Key words: Staphylococcus aureus; α-toxin; isoalantolactone
中国农学通报 2011,27(32):30-33
Chinese Agricultural Science Bulletin
吴金梅等：异土木香内酯降低金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达
外，Bubeck Wardenburg等也报道了α-溶血素对小鼠金
葡菌肺炎起到了决定性的作用，因为α-溶血素突变株
对小鼠肺脏没有致病性[7]。
以前的研究表明，许多中药单体化合物能够降低
金葡菌α-溶血素的表达[8-9]。异土木香内酯是中药土木
香(Inula helenium)中的倍半萜内酯类化合物，亦是土
木香药材中含量较高的主要有效成分。
1 材料与方法
1.1 菌株及培养条件
金葡菌标准株ATCC29213和ATCC10832购买自
美国模式培养物集存库(ATCC)；MH肉汤(MHB)购自
青岛海博生物技术有限公司。
1.2 试剂和仪器
异土木香内酯购自中国药品生物制品检定所
(CMCC)；二甲基亚砜(DMSO)、抗α-溶血素多克隆抗
体、HRP标记的二抗和溶葡萄球菌素购自Sigma公司；
Super ECL Plus超敏发光液购自北京普利莱基因技术
有限公司；Qiagen RNeasy Maxi column为Qiagen公司
产品；反转录试剂Takara RNA PCR kit（AMV）Ver.3.0
和荧光定量PCR试剂SYBR Premix Ex TaqTM均购自
Takara公司。UV-2600型紫外可见分光光度计（尤尼
柯公司），酶标仪(TECAN)，荧光定量 PCR扩增仪（杭
州博日科技有限公司），半干转膜仪(Biorad)。
1.3 方法
1.3.1 最低抑菌浓度(MIC)的测定 采用CLSI（Clinical
And Labor atory Standards Institute）的 标 准 方 法
M7-A8，倍比稀释测定异土木香内酯对金葡菌
ATCC29213和10832的最低抑菌浓度(MIC)。
1.3.2 溶血试验 ATCC29213和10832在加入不同浓度
的异土木香内酯情况下于MHB培养基中培养至对数
生长后期（OD600=2.5）。取 1.5 mL细菌培养物，离心
（5500×g，4℃，1 min）取上清；在 1.5 mL离心管中加入
100 µL细菌上清、875 µL溶血素缓冲液（0.145 mol/L
NaCl，20 mmol/L CaCl2）和 25 µL脱纤维兔血，混匀后
于 37°C孵育 15 min，后离心（5500×g，室温，1 min）取
上清，并在543 nm测其光密度。
1.3.3 免疫印迹分析 取上述“溶血试验”中的金葡菌培
养物上清 20 μL，加入 5 μL 5 × loading buffer，煮沸
5 min，进行 SDS-PAGE，用半干式转膜仪将蛋白转至
PVDF膜上，5%BSA封闭 2 h，抗α-溶血素多克隆抗体
（1:10000稀释）孵育 1 h，HRP标记的二抗（1:4000稀
释）孵育 1 h，加入 ECL发光液孵育 3 min后，胶片曝
光。
1.3.4 荧光定量 PCR分析 ATCC29213在加入不同浓
度的异土木香内酯情况下于MHB培养基中培养至对
数生长后期（OD600=2.5）。总 RNA 的提取参照
Sambanthamoorthy的方法[10]。离心收获细胞（5000 g，
5 min，4℃），并重悬于含 100 µg/mL溶葡萄球菌素的
TES 缓冲液中，于 37℃孵育 10 min 后用 Qiagen
RNeasy Maxi column分离RNA；RNase-free DNase I用
于清除污染的DNA；应用Agilent 2100 Bioanalyzer检
测 RNA的质量、完整性和浓度。应用 Takara RNA
PCR kit（AMV）Ver.3.0将RNA反转录成为 cDNA并存
放于-20℃备用；荧光定量 PCR所用引物如表 1所示。
应用 SYBR Premix Ex TaqTM在 Real Time PCR扩增
仪中进行扩增。反应体系为 25 µL，循环参数为：95℃
变性 30 s，95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，运行 40个循
环。所有样品均为 3个平行，并以 gyrBRNA作为参
照。采用△△Ct法分析基因的相对表达水平。
1.3.5 统计分析 每个试验均单独地重复 3次，数据以
X±S表示；用SPSS12.0统计软件进行分析，组间进行 t
检验，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 异土木香内酯对金葡菌的抗菌活性
异土木香内酯在 2048 μg/mL的浓度仍然不能抑
制金葡菌ATCC29231和 10832的生长，表明异土木香
内酯没有抗金葡菌活性。
2.2 低浓度的异土木香内酯通过抑制金葡菌α-溶血素
的表达降低其溶血活性
异土木香内酯对金葡菌培养物上清的溶血活性
的影响如表 2所示，加入 8 μg/mL的异土木香内酯，金
葡菌ATCC29213和 10832培养物上清对兔红细胞的
溶血活性分别只有不加药对照组的5.46%和4.18%，当
异土木香内酯的浓度在 1 μg/mL时，其溶血活性也只
有对照组的75.9%和86.4%。该作用呈现剂量依赖性。
α-溶血素是金葡菌培养物上清中引起兔红细胞溶
血的最重要的蛋白，因此，应用免疫印迹的方法检测了
金葡菌培养物上清中的α-溶血素，结果如图 1。异土
引物
gyrB-F
gyrB-R
hla-F
hla-R
RNAIII-F
RNAIII-R
基因
gyrB
gyrB
hla
hla
RNAIII
RNAIII
序列 (5’-3’）
TTATGGTGCTGGGCAAATACA
CACCATGTAAACCACCAGATA
TTGGTGCAAATGTTTC
TCACTTTCCAGCCTACT
TTCACTGTGTCGATAATCCA
GGAAGGAGTGATTTCAATGG
表1 荧光定量PCR引物
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木香内酯抑制金葡菌α-溶血素分泌的作用同样是以一
种剂量依赖的方式，当在1 μg/mL时，α-溶血素的分泌
即受到显著抑制，而在8 μg/mL时，则检测不到α-溶血
素的表达。
2.3 异土木香内酯抑制金黄色葡萄球菌hla和agrA基
因的转录
应用荧光定量 PCR技术检测异土木香内酯对金
葡菌α-溶血素编码基因hla转录的影响，此外，由于hla
基因受agr二元调控系统的正向调节，为此，同时检测
了异土木香内酯对 agrA转录的影响。结果如图 2和
图3所示，在加入8 μg/mL的异土木香内酯作用下，hla
和 agrA的转录分别降低了 12.5倍和 8.5倍，并且这种
抑制作用呈现剂量依赖方式。
-18-16
-14-12
-10-8
-6-4
-20
2
0 1 2 4 8
相
对
基
因
表
达
量
**
*
异土木香内酯/(μg/mL)
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
2
0 1 2 4 8
相
对
基
因
表
达
量
* **
异土木香内酯/(μg/mL)
*表示P<0.05；**表示P<0.01
图2 不同浓度异土木香内酯作用后ATCC29213 hla
的相对基因表达水平
*表示P<0.05；**表示P<0.01
图3 不同浓度异土木香内酯作用后ATCC29213 agrA
的相对基因表达水平
3 讨论
多药耐药金葡菌的不断出现已经成为威胁公众健
康和影响畜牧业发展的主要因素。而过去几十年，没
有开发出有效的全新作用机制的抗金葡菌药物则加重
了这种威胁[11]。因此，临床上迫切需要开发替代的治
疗策略以控制金葡菌所致的感染。
金葡菌的致病性主要取决于其所分泌的许许多多
的毒力因子。例如金葡菌α-溶血素在金葡菌肺部感
染、乳房感染、腹膜感染和角膜感染的发病过程中起到
至关重要的作用[7,12]。因此，用于治疗金葡菌感染的抗
菌药物的治疗效果不但取决于其抗菌或抑菌活性，同
时也取决于其抑制金葡菌毒力因子释放的能力[13]。例
如，一些β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素通过刺激hla
的表达而增加α-溶血素的分泌，表明当应用这些抗生
素治疗金黄色葡萄球菌感染时可能会加重其症状[14]；
相反，克林霉素和利奈唑胺则由于能够降低α-溶血素
的表达而通常被推荐用于金葡菌感染的治疗[13,15]。此
外，基于金葡菌的致病特点，抗毒力策略作为一种替
代策略以对抗金葡菌感染也在国际上获得了极大的
关注[16]。
抗毒力药物的开发主要依赖于新发现能够抑制
细菌毒力因子表达或活性的合成化合物或天然化合
金葡菌菌株
ATCC 29213
ATCC 10832
培养物上清对兔红细胞的溶血活性
0 μg/mL
100%
100%
1 μg/mL
75.9%±5.8
86.4%±6.3
2 μg/mL
64.4±4.8
57.8±3.8
4 μg/mL
30.9±5.8*
17.8±3.8**
8 μg/mL
5.5±2.2**
4.2±2.5**
表2 金葡菌在不同浓度异土木香内酯作用下培养物上清的溶血活性 %
注：a未加药的培养物上清视为100%溶血。*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。
(a)
(b)
图中0、1、2、4、8为异土木香内酯浓度，单位为μg/mL
图1 ATCC 29213(a)和ATCC 10832(b)在不同浓度的异土木香
内酯作用后α-溶血素表达的免疫印迹分析
0 1 2 4 8
一一一
一一一
*
一一一
一一一
*
一
一
* 一一一
一一一
*
一一一
一一一
*
一
一
*
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吴金梅等：异土木香内酯降低金黄色葡萄球菌α-溶血素的表达
物[17]。没有抗菌活性的异土木香内酯，却能够在低浓
度抑制金葡菌α-溶血素的表达，表明异土木香内酯可
潜在地作为抗毒力药物开发的一种重要的先导化合
物。
通过荧光定量PCR，发现异土木香内酯能够显著
抑制金葡菌 agr二元调控系统。事实上，金葡菌在对
数期合成的细胞膜表面蛋白和在对数生长后期合成的
胞外蛋白受到一个由许多调控元件组成的调控网络的
控制，这个调控系统包括 sarA蛋白家族，以及许多的
二元调控系统如 agr和 sae[18]。因此，金黄色葡萄球菌
控制毒力因子表达的过程是非常复杂的，涉及 sar、agr
和其他组分的产物的相互作用以及级联调控作用[19]。
为此，异土木香内酯降低α-溶血素的表达可能部分依
赖于agr二元调控系统。
参考文献
[1] 王良兴,杨乐和,余方友,等.金黄色葡萄球菌致肺部感染的耐药谱
分析[J].中华医院感染学杂志,2011,21(4):769-771.
[2] Jose A, Aldo C A, H oracio R, et al. Field trials of a vaccine against
bovine mastitis. 1. evaluation in heifers[J].J Dairy Sci,1997(80):
845-853.
[3] Bronner S, Monteil H, Prevost G. Regulation of virulence
determinants in Staphylococcus aureus: complexity and applications
[J].FEMS Microbiol Rev,2004(8):183-200.
[4] Song L, Hobaugh M R, Shustak C, et al. Structure of
staphylococcal alpha-hemolysin, a heptameric transmembrane pore
[J].Science,1996(274):1859-1866.
[5] Gouaux E. alpha-Hemolysin from Staphylococcus aureus: an
archetype of beta-barrel, channel-forming toxins[J].J Struct Biol,
1998(121):110-122.
[6] McElroy M C, Harty H R, Hosford G E, et al. Alpha-toxin damages
the air-blood barrier of the lung in a rat model of Staphylococcus
aureus-induced pneumonia[J].Infect Immun,1999(67):5541-5544.
[7] Bubeck Wardenburg J, Patel R J, Schneewind O. Surface proteins
and exotoxins are required for the pathogenesis of Staphylococcus
aureus pneumonia[J].Infect Immun,2007(75):1040-1044.
[8] Shah S, Stapleton P D, Taylor P W. The polyphenol (-)-epicatechin
gallate disrupts the secretion of virulence-related proteins by
Staphylococcus aureus[J].Lett Appl Microbiol,2008(46):181-185.
[9] Qiu J, Wang D, Xiang H, et al. Subinhibitory Concentrations of
Thymol Reduce Enterotoxins A and B and α-Hemolysin Production
in Staphylococcus aureus Isolates[J].PLoS ONE,2010,5(3):e9736.
[10] Sambanthamoorthy K, Smeltzer M S, Elasri M O. Identification
and characterization of msa (SA1233), a gene involved in
expression of SarA and several virulence factors in Staphylococcus
aureus[J].Microbiology,2006(152):2559-2572.
[11] Qazi S, Middleton B, Muharram SH, et al. Nacylhomoserine
lactones antagonize virulence gene expression and quorum sensing
in Staphylococcus aureus[J].Infect Immun,2006(74):910-919.
[12] Ragle B E, Wardenburg Bubeck J. Anti-alpha-hemolysin
monoclonal antibodies mediate protection against Staphylococcus
aureus pneumonia[J].Infect Immun,2009(77):2712-2718.
[13] Bernardo K, Pakulat N, Fleer S, et al. Subinhibitory concentrations
of linezolid reduce Staphylococcus aureus virulence factor
expression[J].Antimicrob Agents Chemother,2004(48):546-555.
[14] Stevens D L, Ma Y, Salmi D B, et al. Impact of antibiotics on
expression of virulenceassociated exotoxin genes in
methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus
[J].J Infect Dis,2007(195):202-211.
[15] Herbert S, Barry P, Novick R P. Subinhibitory clindamycin
differentially inhibits transcription of exoprotein genes in
Staphylococcus aureus[J].Infect Immun,2001(69):2996-3003.
[16] Rasko D A, Moreira C G, Li de R, et al. Targeting QseC signaling
and virulence for antibiotic development[J].Science,2008(321):
1078-1080.
[17] Rasko D A, Sperandio V. Anti-virulence strategies to combat
bacteria-mediated disease[J].Nat Rev Drug Discov,2010,9:117-128.
[18] Booth M C, Cheung A L, Hatter K L, et al. Staphylococcal
accessory regulator (sar) in conjunction with agr contributes to
Staphylococcus aureus virulence in endophthalmitis[J].Infect
Immun,1997(65):1550-1556.
[19] Chan P F, Foster S J. Role of SarA in virulence determinant
production and environmental signal transduction in
Staphylococcus aureus[J].J Bacteriol,1998(180):6232-6241.
·· 33