全 文 ：基金项目:国家自然科学基金项目(30830117) ;国际科技合作项目(2011DFA31260)
作者简介:尹婉嫱，女，博士研究生 研究方向:猪苓菌丝形成菌核的营养因素及作用机制 * 通讯作者:郭顺星，男，研究员，博士生导师
研究方向:药用植物菌根生物学 Tel:(010)62829619 Fax: (010)62895120 E-mail:sxguo2006@ yahoo. com. cn
·论 著·
正交设计法优化培养基中美拉德反应条件以提高猪苓菌核产量的研究
尹婉嫱，郭顺星* (中国医学科学院-中国协和医科大学药用植物研究所，北京 1000193)
摘要:目的 用正交设计法优化培养基中美拉德反应的条件，以提高猪苓菌核产量。方法 以果糖和精氨酸作为美拉德反应
的原料，经过调节 pH后在一定温度下独立灭菌一定时间，之后与含蛋白胨和无机盐的培养基混合均匀并用于诱导猪苓菌核。
以菌核干重为指标，对灭菌前 pH值，果糖与精氨酸浓度比，灭菌时间(min) ，灭菌温度(℃)4 个因素进行了 L9(3
4)正交实验。
结果 极差分析结合方差分析表明，灭菌前 pH值对菌核产量具有显著影响。优化后反应条件为:灭菌前 pH为 10;浓度比为
200∶ 1;灭菌时间为 80 min;灭菌温度为 121 ℃。菌核产率提高了 75%，菌核干重提高到每皿(0. 225 ± 0. 16)g。结论 相比优
化前菌核产率为 30% ～50%，菌核干重为每皿 0. 1 ～ 0. 15 g，新的反应条件显著提高了菌核产量。
关键词:猪苓;菌核;美拉德反应;正交设计法
中图分类号:R931. 2 文献标志码:A 文章编号:1001 － 2494(2011)17 － 1309 － 03
Study on Optimization of Maillard Reaction Conditions in Culture Medium to Enhance Yield of Polyporus
umbellatus Sclerotium by Orthogonal Design
YIN Wan-qiang，GUO Shun-xing* (Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Peking U-
nion Medical College，Beijing 100094，China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To optimize Maillard reaction conditions in culture medium by orthogonal design so as to enhance yield
of Polyporus umbellatus sclerotium. METHODS According to our previous study，it was found that Maillard reaction products in
fructose medium might play a role in sclerotial induction in P. umbellatus. Maillard reaction products，as indicated in the references，
varied with reaction time，carbon-nitrogen ratio in reactants，as well as pH value and temperature in reaction system. In this study，
Fructose and arginine of different concentration ratios were mixed and used as reactants for Maillard reaction after pH value adjustment，
which were sterilized for some time under a specific temperature. The mixture was subsequently mixed with medium containing peptone
and mineral salts. The ultimate medium was used for inducing sclerotium of P. umbellatus. Maillard reaction conditions were optimized
by a L9(3
4)orthogonal design，in which，pH value before sterilization(A) ，concentration ratio(B) ，sterilization time(C)and steriliza-
tion temperature(D)were the four factors to modulate. Each factor had three levels. Sclerotium dryweight was the index for statistic a-
nalysis. RESULTS The results of range analysis and variance analysis showed that the pH value before sterilization(A)significantly
affected sclerotium dryweight. The final optimized conditions were:pH of reaction system was 10 before sterilization;concentration ratio
of fructose and arginine was 200∶ 1;sterilization time was 80 min;and sterilization temperature was 121 ℃. The sclerotium yield was
75% higher than that before optimization 30% －50%，while the sclerotium dryweight increased from 0. 1 － 0. 15 g per dish to (0. 225
± 0. 16)g per dish. CONCLUSION The optimized Maillard reaction conditions greatly enhance P. umbellatus sclerotium forma-
tion，which will be used in the future research.
KEY WORDS:Polyporus umbellatus;sclerotium;Maillard reaction;orthogonal design
猪苓［Polyporus umbellatus (Pers. )Fries］是多
孔菌科传统药用真菌，其菌核为药用部位，具有渗水
利湿的功效。近年来的研究表明，猪苓菌核多糖具
有抑制肿瘤的作用，同时还可以提高人体免疫机能。
由于自然条件下猪苓菌核生长缓慢，需求量的大幅
提高和过度的采挖，猪苓资源短缺问题日益严峻。
以往人工栽培猪苓是以菌核培养菌核，需要解决种
苓问题，因此，本实验室开展了猪苓菌核培养新方法
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中国药学杂志 2011 年 9 月第 46 卷第 17 期 Chin Pharm J，2011 September，Vol. 46 No. 17
的研究，拟在人为条件下以猪苓菌丝形成菌核。之
前的研究表明，在果糖培养基中猪苓可以形成菌核，
而这种诱导菌核的作用很有可能源于果糖与氮源在
高温混合灭菌时产生的美拉德反应产物。将美拉德
反应产物提取并回加到分离灭菌的培养基中，与对
照相比具有显著的诱导菌核形成的作用［1］。美拉
德反应是还原糖与氨基酸、蛋白胨在加热条件下发
生的一系列复杂的化学反应，其产物为含有类黑素
的复杂混合物。该反应受到很多因素的影响，如反
应温度及时间，pH 值，水活度，反应物及其浓度
等［2］。本实验的目的是对培养基中果糖与精氨酸
高压灭菌时发生的美拉德反应条件进行优化，以期
获得更高的猪苓菌核产量。实验考察了灭菌前 pH
值，果糖精氨酸浓度比，灭菌时间，灭菌温度这 4 个
影响因素，设计了 4 因素 3 水平的正交实验。
1 实验材料
MLS － 3750 自动高压灭菌锅(日本 SANYO) ;
航计牌 pH － HJ90B pH计(北京航天计算机公司) ;
FA2004 电子天平(上海恒平)。
果糖，蛋白胨，精氨酸，K2 HPO4 · 3H2 O，
KH2PO4，MgSO4·7H2 O，维生素 B1(VB1) (均为分
析纯) ;10%NaOH(aq)，5%HCl(aq)。
猪苓菌种由本实验室自制，保存于麦麸固体培
养基上。
2 方 法
2. 1 培养基配制
培养基 A(g·L －1) :果糖 ρ1，精氨酸 ρ2(ρ1 +
ρ2 =102)。用 10% NaOH(aq)或 5% HCl(aq)调节 pH
值。
培养基 B(g·L －1) :蛋白胨 4，K2HPO4·3H2O
2，KH2PO4 1，MgSO4·7H2 O 1，琼脂 24。培养基 B
在 121 ℃，101 KPa条件下灭菌 20 min，培养基 A单
独灭菌。将两者于超净工作台混合均匀，加入经过
孔径为 0. 22 μm的微孔滤膜过滤除菌的 VB1 溶液，
使得培养基中 VB1 的终质量浓度达到 0. 05 g·
L －1，分装至直径 9 cm的平皿中冷凝待用。
2. 2 接种与培养
用直径为 1. 5 cm的打孔器在平皿中央打孔，填
装猪苓麦麸固体菌种，接种量为每皿 0. 7 g，25 ℃黑
暗培养，培养 60 d后收获菌核。
2. 3 正交实验设计
为了提高猪苓菌核产量，利用正交实验设计对
培养基 A中影响菌核形成的美拉德反应条件进行
优化，每组 10 个重复。考察了灭菌前培养基 A 的
pH值(A) ，果糖与精氨酸质量浓度比，即 ρ1 ∶ ρ2
(B) ，灭菌时间(C) ，灭菌温度(D)4 个因素，每个因
素各取 3 个水平。采用了 L9(3
4)正交表，各因素每
个水平的取值见表 1。
2. 4 数据统计分析
统计每组的产核率，以菌核干重为指标，进行极
差分析，并使用 SPSS13. 0(SPSS Inc. ，Chicago，IL，
USA)软件对其进行方差分析(P = 0. 05)。
3 结 果
以菌核干重为考察指标，进行极差分析、方差分
析，结果见表 2，3。其中，在第 7 组(A3B1C2D2)及
第 8 组(A3B2C1D3)条件下没有菌核形成。
由极差分析可见，美拉德反应条件中的各因素
对猪苓菌核干重的影响程度为灭菌前 A ＞ D ＞ C ＞
B。由方差分析可见，只有灭菌前 A 这一因素对菌
核产量有极显著影响，而 B，C，D这 3 个因素对菌核
产量影响均不显著。对 A 因素中的 3 个水平进行
方差分析后发现，水平 1(灭菌前 pH 为 9)和水平 2
(灭菌前 pH为 10)两组之间没有显著差异，但这两
组均与水平 3(灭菌前 pH为 11)有显著的差异。
表 1 美拉德反应条件的各因素、水平
Tab. 1 Factors and levels for Maillard reaction conditions
Level
pH value in medium A
before sterilization(A)
ρ1:ρ2
(B)
Sterilization
time(C)/min
Sterilization
temperature(D)/℃
1 9 100∶ 1 40 121
2 10 200∶ 1 80 125
3 11 500∶ 1 120 130
表 2 美拉德反应的正交设计及极差分析
Tab. 2 Orthogonal design and range analysis for Maillard reac-
tion
No． A B C D Dry weight /g per dish
1 1 1 1 1 0． 187 1
2 1 2 3 2 0． 135 0
3 1 3 2 3 0． 176 1
4 2 1 3 3 0． 069 6
5 2 2 2 1 0． 225 0
6 2 3 1 2 0． 161 9
7 3 1 2 2 0
8 3 2 1 3 0
9 3 3 3 1 0． 041 1
k1 0． 166 1 0． 085 6 0． 116 3 0． 151 1
k2 0． 152 2 0． 120 0 0． 133 7 0． 099 0
k3 0． 013 7 0． 126 4 0． 081 9 0． 082 0
R 0． 152 4 0． 040 8 0． 051 8 0． 069 1
·0131· Chin Pharm J，2011 September，Vol. 46 No. 17 中国药学杂志 2011 年 9 月第 46 卷第 17 期
综上所述，选择培养基 A 中美拉德反应的条件
时，灭菌前 pH 应在 9 和 10 两个中选择，而灭菌温
度、灭菌时间，果糖精氨酸浓度比的影响不显著，可
根据设备条件酌情选择。本实验最终选择了直观分
析中的菌核平均干重最高的第 5 组，美拉德反应条
件为 A2B2C2D1，即灭菌前 pH为 10，浓度比为 200∶
1，灭菌时间为 80 min，灭菌温度为 121 ℃，菌核照片
见图 1。优化前培养基 A 中美拉德反应条件为 pH
值自然，果糖精氨酸浓度比为 50 ∶ 1，灭菌温度 121
℃，灭菌时间为 20 min，菌核产率为 30% ～ 50%，菌
核干重为每皿 0. 1 ～ 0. 15 g，优化后菌核产率达到了
75%，菌核干重达到了每皿(0. 225 ± 0. 16)g，可见
优化后的条件起到了提高猪苓菌核产量的目的。
4 讨 论
孙凤玲等［3］使用均匀设计实验考察了反应时
间、反应温度、pH，反应物的量这 4 个因素与美拉德
反应产物的 A280(表示产物中低分子中间体含量)与
A420(表示类黑素含量)的影响。研究表明，4 个因素
表 3 美拉德反应方差分析结果
Tab. 3 Result of analysis of variance for maillard reaction
Source Type Ⅲ SS DF MS F P
A 0． 316 2 0． 158 12． 022 0． 000
B 0． 023 2 0． 011 0． 867 0． 425
C 0． 033 2 0． 017 1． 265 0． 289
D 0． 063 2 0． 031 2． 379 0． 101
Error 0． 816 62 0． 013
注:Type Ⅲ SS －Ⅲ型离均差平方和;DF －自由度;MS －均方;P －显著性;
F0. 05(2，60)=3. 15;F0. 01(2，60)=4. 98
Note:Type Ⅲ SS － Type Ⅲ sum of squares of deviation from the mean;DF － de-
gree of freedom;MS － mean square;P － significance;F0. 05(2，60)= 3. 15;
F0. 01(2，60)=4. 98
图 1 培养 60 d后收获的猪苓菌核(培养基 A 中美拉德反
应条件为 A2B2C2D1)
Fig. 1 Sclerotium of P. umbellatus obtained after 60 d culture
(Maillard reaction condition in medium A is A2B2C2D1)
对美拉德反应产物产量的影响程度依次为 pH ＞反
应温度 ＞反应时间 ＞反应物的量，与本实验中极差
分析得到的 4 个因素对菌核产量的影响程度一致，
这从另一个侧面佐证了美拉德反应产物对菌核形成
的作用。美拉德反应产物包括一些低相对分子质量
的 Amadori重排产物、还原酮和脱氧邻酮醛等物质，
这些物质可以继续发生反应形成高相对分子质量的
棕色含氮类物质———美拉德反应终产物类黑素［4］。
美拉德反应产物对猪苓菌核诱导机制目前还不清
楚。大量研究均表明，美拉德反应产物具有抗氧化，
清除自由基的性质［2，4-6］，之前本室研究认为这种抗
氧化的作用就是诱导猪苓菌核的原因［1］，但这种假
设与国外关于抗氧化剂抑制菌核形成的报道不一
致［7］。值得注意的是，少量报道指出，美拉德反应
产物具有抗氧化剂和氧化增强剂的双重作用［6］，美
拉德反应的中间过程及终产物类黑素中都检测到自
由基［8］。同时，之前很多研究均表明氧化压力是很
多种真菌产菌核的原因。因此，美拉德反应产物对
猪苓菌核的诱导作用有可能不是源于其抗氧化活
性，而是源于其氧化增强作用给猪苓生长环境带来
的氧化压力。在猪苓菌核形成的过程中，美拉德反
应产物的哪一部分发挥了什么样的作用还有待继续
研究。
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(收稿日期:2011-03-15)
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