全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 May 2009, 28(3): 435-439

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2009 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






*Corresponding author. E-mail: zly6559@tom.com
收稿日期: 2008-06-10, 接受日期: 2008-08-04

毛木耳Auricularia polytricha多糖APPIIA对巨噬细胞细胞因子
和 iNOS 基因表达的影响
罗霞 1 余梦瑶 1,3 江南 1,3 许晓燕 1 曾瑾 1 郑林用 2,3*
1四川省中医药研究院中药细胞与分子生物学实验室 成都 610041
2四川省农业科学院土壤肥料研究所 成都 610066
3四川大学生命科学学院 成都 610064



摘 要：从毛木耳 Auricularia polytricha 子实体中分离得到了具有抗肿瘤作用的单一多糖组分 APPIIA，采用 SYBR Green I
指示的 Real-time RT-PCR 技术研究了它对小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 中 IL-1β，IL-6，TNF-α和一氧化氮（NO）合成关键酶
iNOS 基因在 mRNA 转录水平上的作用。采用 Western-Blot 技术，研究了 APPIIA 对 RAW 264.7 细胞生成 iNOS 蛋白的能力。
研究发现，APPIIA 能增强 IL-1β，IL-6，TNF-α 和 NO 合成关键酶 iNOS 基因的转录水平，并能增加 iNOS 蛋白的生成。推
测 APPIIA 可能通过上调相关基因的表达，增加 IL-1β，IL-6，TNF-α分泌和 NO 生成，从而实现其抗肿瘤的重要作用。
关键词：食药用菌，小鼠，巨噬细胞，抗肿瘤，一氧化氮

Effects of Auricularia polytricha polysaccharide on
mouse macrophage cytokine and iNOS gene expression
LUO Xia1 YU Meng-Yao1, 3 JIANG Nan1, 3 XU Xiao-Yan1 ZENG Jin1 ZHENG Lin-Yong2, 3*
1Cytology and Molecular Biology Laboratory, Sichuan Institute of Chinese Materia Medica, Chengdu 610041, China
2Soil and Fertilizer Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China
3College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China
Abstract: The gene transcription level of interleukin (IL)-1β, IL-6, tumor necrosis factor (TNF)-α and iNOS in RAW 264.7 was
detected by real-time RT-PCR method. The protein expression level of iNOS was also tested by Western-Blot method. It was found
that the transcribe level of these genes was all enhanced by Auricularia polytricha polysaccharide APPIIA in a dose-dependent
manner and the protein level of iNOS was also enhanced by APPIIA. It could be concluded that APPIIA might promote the
expression of these genes and inhibit the tumor markedly.
Key words: edible and medicinal fungus, mouse macrophages, anti-tumor, nitric oxide

DOI:10.13346/j.mycosystema.2009.03.020
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毛木耳Auricularia polytricha，是我国常见的一
种药食两用大型真菌。中医药典籍记载，毛木耳具
有补益气血，润肺止咳，活血止血等功效。现代药
理研究发现，毛木耳对机体的凝血作用具有双向作
用，同时具有调节免疫功能（Sheu et al. 2004），抗
氧化（Mau et al. 2001），止痛（Koyama et al. 2002），
抑制肿瘤生长等功效。目前对毛木耳的抗肿瘤作用
机制研究较少，仅推测其可能与机体免疫调节有
关。作者在前期研究中，从毛木耳子实体中首次得
到具有抗肿瘤活性的单一多糖成分（命名为
APPIIA），并研究发现其能够增强巨噬细胞的吞噬
功能，促进巨噬细胞NO的生成，促进抗肿瘤相关
细胞因子IL-1β，IL-6和TNF-α的分泌。为进一步探
讨其抗肿瘤的作用机制，作者研究了其对巨噬细胞
相关基因转录及蛋白表达的影响，以阐明其抗肿瘤
的本质。
1 材料与方法
1.1 细胞
小鼠巨噬细胞株 RAW264.7 购自 ATCC（编号
ATCC TIB-71），细胞株培养于含 10% 胎牛血清的
DMEM 培养液中（含 100U/mL 青霉素，100µg/mL
链霉素），置于 37℃，5% CO2 细胞培养箱中，每隔
2d 传代一次。
1.2 药物
毛木耳多糖 APPIIA，系本实验室从子实体中
提取、制备。
1.3 试剂
RNAiso（TaKaRa）；反转录酶 ReverTra Ace
（Toyobo）；Rnase Inhibitor（Toyobo）；Taq 酶
（Tiangen）；琼脂糖（Biowest）；琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒、SYBR Green I（Generay）；小鼠 β-actin
单克隆抗体、兔抗小鼠 iNOS 抗体（武汉博士德）、
HRP-羊抗鼠 IgG、HRP-羊抗兔 IgG（中杉金桥）；
Beyo ECL plus（碧云天）；X 光胶片（Kodak）；脂
多糖（LPS）（Sigma）。
1.4 仪器
倒置显微镜（Nikon，TS100）；二氧化碳培养
箱（Heraeus，BB5060UV）；电泳仪（Bio-rad，Mini-sub
cell GT + Power Pac）；凝胶成像系统（Bio-rad，Gel
Doc XR）；核酸蛋白测定仪（Bio-rad，Smartspec
Plus）；PCR 仪（Bio-rad，Mycycler）；荧光定量 PCR
仪（Bio-rad，icycler）。
1.5 方法
1.5.1 毛木耳多糖 APPIIA 的提取与纯化：取四川省
中江县菌株 781 干燥子实体。经水提醇沉、Sevag
法（Staub 1965）除蛋白后得到粗多糖，再经 DEAE
纤维素和 Sephacryl S-300 层析得到纯化多糖。经
S180 荷瘤小鼠筛选，得到一具有抗肿瘤活性的多糖
组分，命名为 APPIIA。经检测 APPIIA 不含蛋白质
和核酸，琼脂糖电泳为单一染色条带，表观分子量
约为 110kDa，含硫酸基，为木糖和甘露糖形成的杂
多糖。
1.5.2 逆转录 -聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS 基因 mRNA 表达：APPIIA
对巨噬细胞的诱导：取对数生长期的 RAW 264.7 细
胞按 1×106 个/孔加入 24 孔板中，贴壁后，将 APPIIA
按实验设计，加入 24 孔培养板，并以含 10%小牛
血清的无酚红 RMPI-1640 培养液补足至终体积为
1000µL；每种浓度设 3 个平行孔，共 6 个浓度，终
浓度分别为 0µg/mL ， 50µg/mL ， 100µg/mL ，
200µg/mL，300µg/mL，400µg/mL。同时，做阳性
对照孔（加入终浓度为 10µg/mL 的 LPS）。在 37℃
5% CO2 饱和湿度空气条件下培养 4h。
RNA 样品制备：细胞计数，取 1×106－1×107
个细胞加入 1mL TRIzol 试剂，按说明书方法提取
RNA。紫外分光光度仪测定 A260/A280，检测总 RNA
的质量和浓度。按试剂说明书逆转录为 cDNA，-4℃
保存。
引物设计与合成：登录 NCBI 网站，检索小鼠
β-actin，IL-1β，IL-6，TNF-α和 iNOS 基因的 mRNA
序列。运行 Primer Premier 5 软件，设计 PCR 引物。
β-actin，反向引物：5′-TTGATGTCACGCACGATTT
-3′，正向引物：5′-GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′；
IL-1β，反向引物：5′-CCTCAAGTGCAAGGCTAT-
3′，正向引物：5′-TGGGCTGGACTGTTTCTA-3′；
IL-6，反向引物：5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTT-
3′，正向引物：5′-TTCTTGGGACTGATGCTG-3′；
TNF-α，反向引物：5′-GGTTGACTTTCTCCTGGTA
T-3′，正向引物：5′-GCCTATGTCTCAGCCTCT-3′；
Vol.28 No.3 437
http://journals.im.ac.cn/jwxtcn
iNOS，反向引物：5′-GGGAGGAGCTGATGGAGT-
3′，正向引物：5′-GAGCGAGTTGTGGATTGTC-3′。
标准品的制备：在普通PCR仪上进行IL-1β，
IL-6，TNF-α， iNOS以及β-actin扩增，分别获得
330bp，380bp，423bp，376bp和222bp的产物。胶
回收纯化PCR产物。对胶回收IL-1β，IL-6，TNF-α，
iNOS和β-actin扩增子，紫外定量，计算分子数。按
10-3，10-4，10-5，10-6，10-7稀释标准品。
SYBR-Green法进行PCR检测：在0.2mL的PCR
薄壁管中建立PCR反应。反应体系为50µL，包含1×
PCR Buffer，引物各0.1µmol/L，dNTP 0.2mmol/L，
Taq酶 2.5U，Mg2+ 1.875mmol/L，0.5×SYBR Green
I。PCR反应条件：94℃预变性5min后94℃ 45s、分
别56.0℃（β-actin），53.0℃（IL-1β），50.1℃（IL-6），
55.0℃（TNF-α），55.4℃（iNOS）45s共45个循环，
每个循环后升温到82℃采集荧光生成扩增曲线，循
环完成后从55℃到94℃缓慢升温，生成熔点曲线。
在同一次反应中，均设置标准品（5个浓度）
反应组，空白对照组，不同APPIIA剂量组和LPS阳
性对照组，各组都设3个平行重复。琼脂糖电泳PCR
产物，鉴定扩增产物。
统计方法：数据分析采用icycler荧光定量PCR
仪配套的icycler optical system software v3.1进行分
析。数据以x ± s表示，采用t-检验比较组间差异。
1.5.3 对 iNOS 蛋白表达的 Western-Blot 分析：
APPIIA 对巨噬细胞的诱导：取对数生长期的 RAW
264.7 细胞按 3 × 106 个/孔加入 6 孔板中，贴壁后，
将 APPIIA 按实验设计，加入 24 孔培养板，并以含
10%小牛血清的无酚红RMPI-1640培养液补足至终
体积为 3mL；每种浓度设 3 个平行孔，共 6 个浓度，
终浓度分别为 0，50，100，200，300，400µg/mL。
同时，做阳性对照孔（加入终浓度为 10µg/mL LPS）。
在 37℃ 5% CO2 饱和湿度空气条件下培养 24h。
对 iNOS 蛋白表达的 Western-Blot 分析按 Diao
et al.（2008）方法和试剂说明书进行操作。
成像后的 X-光片用凝胶成像仪，拍照后用
Quantity One 软件分析 β-actin 和 iNOS 条带的光密
度值。计算各样品 iNOS 和内标 β-actin 的比值，分
析组间数据差异。
2 结果与分析
2.1 逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测
2.1.1 标准曲线的绘制：以标准品分子数对数值为
横坐标，CT 值为纵坐标，绘制标准曲线。分别得
到 β-actin，IL-1β，IL-6，TNF-α、iNOS 的标准曲线
方程 Yβ-actin＝-3.730X + 47.147（R2＝0.999），YIL-1β
＝Y＝-3.751X + 45.196（R2＝0.998），YIL-6＝-3.723X
+ 42.328（R2＝1.000），YTNF-α＝-3.544X + 43.847（R2
表 1 APPIIA 对细胞因子和 iNOS mRNA 转录的影响
Table 1 Effect of Auricularia polytricha polysaccharide APPIIA on cytokines and iNOS mRNA transcription
样品
Sample
剂量（µg/mL）
Dose (µg/mL)
IL-1β IL-6 TNF-α iNOS
阴性对照 Blank - 0.001±0.001 0.003±0.001 0.077±0.031 0.002±0.000
LPS 10 0.909±0.260 1 0.126±0.028 1 0.323±0.108 1 0.214±0.029 1
50 0.296±0.180 1 0.023±0.018 1 0.342±0.110 1 0.045±0.013 1
100 0.477±0.210 1 0.053±0.017 1 0.301±0.102 1 0.082±0.056 1
200 0.550±0.203 1 0.108±0.019 1 0.344±0.033 1 0.150±0.049 1
300 0.675±0.114 1 0.105±0.045 1 0.357±0.079 1 0.193±0.045 1
APPIIA
400 0.891±0.094 1 0.124±0.046 1 0.315±0.018 1 0.393±0.080 1
注：与阴性对照组比较，1代表P＜0.01.
Note: Date in the table followed with 1 is significantly different at P<0.01. Total RNA was isolated from RAW 264.7 cells incubated with various
concentrations of APPIIA or LPS for 6h. mRNA of IL-1β, IL-6, TNF-α and iNOS was determined by quantitative RT-PCR and normolized to those of
β-actin for each sample. All data represent means ± S.E.M. of triplicates.

438 Mycosystema

＝0.998），YiNOS＝-3.806X + 47.562（R2＝1.000）。
2.1.2 PCR 产物的确定分析：熔解曲线分析显示，
β-actin，IL-1β，IL-6，TNF-α，iNOS 基因 PCR 产
物的熔解曲线峰值分别在 90℃，90℃，85.5℃，90℃，
90℃，熔解温度均一，峰的形状也较锐利，这充分
说明 β-actin，IL-1β，IL-6，TNF-α，NOS 的 PCR
产物均比较特异，无杂带。
2.1.3 APPIIA 对 IL-1βmRNA 表达的影响：不同浓度
的 APPIIA 均能够极大程度地提升 IL-1β mRNA 的
相对表达丰度，且呈明显的剂量依赖关系，对巨噬
细胞中的 IL-1β转录水平有显著的促进作用（表 1）。
2.1.4 APPIIA 对 IL-6 mRNA 转录的影响：在没有外
界诱导的条件下，巨噬细胞中几乎检测不到有 IL-6
mRNA 的转录。但在 LPS 或 APPIIA 的刺激下，其
转录水平得到极大的提高。不同剂量的 APPIIA 均
能大幅度提升 IL-6 基因的转录水平，且这一作用呈
明显的剂量依赖关系（表 1）。这一结果说明，IPS-B2
能够显著提升巨噬细胞中 IL-6 基因的转录水平。
2.1.5 APPIIA 对 TNF-α mRNA 转录的影响：未加任
何刺激物的培养液培养的巨噬细胞中 TNF-α 基因
的转录水平极低（表 1）。但在 LPS 或 APPIIA 的作
用下，巨噬细胞中 TNF-α基因的转录水平得到大大
提升，随着 APPIIA 浓度的增加，巨噬细胞中 TNF-α
的表达也随之增强。
2.1.6 APPIIA 对 iNOS mRNA 转录的影响：iNOS 基
因在未受刺激的巨噬细胞中转录水平极低，但在
LPS 或 APPIIA 的作用下，其转录水平大幅提高，
增加数倍至数十倍（表 1）。iNOS 基因转录水平提
高与 APPIIA 浓度之间具有明显的剂量依赖关系。
2.2 APPIIA 对 iNOS 蛋白表达的影响
胶片经凝胶成像系统拍照，并运用Quantity One
软件分析β-actin和 iNOS条带的光密度值，计算
iNOS/β-actin值，结果显示，在没有外源刺激物
（APPIIA或LPS）刺激下，RAW264.7细胞内的iNOS
蛋白含量极低，通过Western-Blot方法无法检测。但
在APPIIA或LPS的刺激下，iNOS蛋白水平显著提
高，Western-Blot可检测出清晰条带（图1）。通过对
iNOS和内标β-actin光密度比值比较发现，APPIIA能
够剂量依赖性地增加RAW264.7细胞内iNOS的含
量，这一结果与NO生成和iNOS mRNA转录水平相
一致。

图 1 APPIIA 对 iNOS 蛋白表达的影响
Fig. 1 Effect of Auricularia polytricha polysaccharide APPIIA on iNOS
protein expression. RAW 264.7 cells were treated for 24h with APPIIA
or LPS and then harvested. Whole-cell protein lysates were analyzed by
Western blotting with anti-iNOS antibody and normalized to β-actin.
All data represent means ± S.E.M. of triplicates.
3 结论和讨论
过去的研究已经证明，活化的巨噬细胞在机体
防御肿瘤作用中发挥着重要的功能（Klimp et al.
2002）。目前，针对巨噬细胞活化的抗肿瘤药物和
疗法的研究和应用正在广泛地进行。作者前期的研
究已经表明，毛木耳多糖 APPIIA 能够作用于
RAW264.7 细胞，增强它们的 NO 生成和肿瘤相关
细胞因子的分泌能力。本研究进一步表明 APPIIA
能在 mRNA 水平上大大增加上述因子的转录水平。
巨噬细胞 NO 的释放依赖于细胞内的诱导型一
氧化氮合酶。体内合成NO的天然底物为L-精氨酸，
在 NOS 催化下，L-Arg 末端胍基上的氮原子被氧化
而生成 NO 和瓜氨酸。根据酶的来源、对 Ca2+/CaM
依赖性的不同以及是否接受内毒素及细胞因子诱
导等特点，可将 NOS 分为神经元型（nNOS）、内
皮型（eNOS）和诱生型（iNOS）三种。iNOS 存在
于几乎所有组织细胞中，其中以巨噬细胞、血管平
滑肌细胞和中性粒细胞内含量最多。正常生理情况
下 iNOS 基因并不表达，但在 LPS，TNF，IFN，IL-1
等因子的刺激下，iNOS 即被诱导生成，不依赖
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Ca2+/CaM 而持续催化产生大量的 NO。iNOS 的诱
导过程需要 4－8h。在本实验中发现，APPIIA 能够
在mRNA水平和蛋白水平上诱导RAW264.7细胞剂
量依赖性地大量表达 iNOS。这一结果提示，APPIIA
抗肿瘤作用机制之一可能是通过诱导巨噬细胞
iNOS 高水平地表达，并进一步生成大量 NO，进而
作用于肿瘤细胞，对其产生杀伤效果。
本研究表明，毛木耳多糖 APPIIA 能够剂量依
赖性地增加上述基因的 mRNA 转录水平，同时对
iNOS 的蛋白表达水平也有显著提高，这可能是
APPIIA 发挥抗肿瘤活性的重要途径。

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