全 文 ：西北林学院学报 2(X )7 , 2 ( 4 ) : 131 一 134
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t Fo心 ytr Uin ve o i yt
木蹄层孔菌化学成分及不同提取物体外抗肿瘤活性研究
陆勇芹` , 周文明2 ’ , 王 琦2 , 李玲玲 2
( 1
. 西北农林科技大学 生命科学学院浮 . 理学院 , 陕西 杨陵 71 21 0 )
摘 要 :采用石油醚 、 氛仿 、 乙酸 乙醋 、 水饱和 的正丁醉对木蹄层孔菌 95 % 乙醉提取物进行分
离 , 运用 MrT 比色法对各提取物进行体外杭肿瘤活性的测定 。 结果表明氛仿提取物对 H el a
细胞表现出较强的抑制作用 ,在测定浓度范围内呈现出良好的剂童依赖性抑制作用 , 而 乙酸 乙
醋和正丁醉提取物在同一浏定浓度范围内抑制作用不如氛仿提取物 , 其中石油醚提取物抑制
作用最弱 。 化学预试表明 ,木蹄层孔菌中存在酚性成分 , 有机酸 ,糖 、 多糖和普类 , 内酣 、 香豆素
及其普类 , 植物 苗醇 、 菇类化合物 , 葱酸及其普类 。
关键词 :木蹄层孔菌 ;抗肿瘤活性 ;提取物 ; MrT 法
中图分类号 : 57 18 . 8 文献标识码 : A 文章编号 : 10 1一 461 ( 2 0 7) 04 刁131 拱
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K e y wo
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木蹄层孔菌 ( oF mes fo enz ant ir us ) 又名火绒层孔
菌 , 为担子菌纲 , 多孔菌目 , 多孔菌科 ( olP 印。acr e -
a e
)
、层孔菌属 ( oF lesn )真菌 。 木蹄层孔菌是世界性分布的木腐性真菌 ,危害多种阔叶树木川 。 在 18 世
纪和 19 世纪 ,曾被用来作为止血的膏药 ,在一些传
统的药典中被用来作为针灸的工具 。 其药用部位为
子实体 , 粗提物具有抗氧化性 , 利尿性 ,退烧 , 消积
化 ,止痛 ,消炎和抗肿瘤等作用 , 已经被应用于传统
药物 2[ 一 ’ ] 。 国内已有报道其乙醇粗提物对肿瘤细胞
具有很强的抑制作用 , 但未做进一步研究 。 本实验
通过试管法对其进行系统预试 ,初步确定其化学成
分 , 同时对木蹄层孔菌 95 % 乙醇提取物进行初步分
离 ,并采用 M T T 法 , 以体外培养的人体宫颈癌细胞
( H
e h )为模型 , 测定不同提取物的体外抗肿瘤活
性 ,初步确定了该菌抗肿瘤的活性提取物 。
1 材料与方法
1
.
1 实验材料
木蹄层孔菌 ( oF二 fo me 瓜a ir us L . ex . rF )子实
体采自陕西太白山 , 经鉴定为多孔菌科层孔菌属木
蹄层孔菌 。 将采集的木蹄层孔菌子实体于 45 ℃烘
干 , 粉碎 , 备用 。
1
.
2 主要药品与试剂
D ME M 为 G I BCO 公 司 产 品 , 批 号 N o .
收稿日期 : 2X() 7刃 1. 2 2
作者简介 :陆勇芹 ( 19 8 2 -
通讯作者 :周文明 ( 196 6 -
修回日期 二以力 ,仍一 8
)
,女 ,陕西蒲城人 ,硕士研究生 ,研究方向为天然产物化学 。
)
,男 , 湖南桑植人 , 博士 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要从事有机合成和天然产物化学方面的研究 。
西北林学院学报 2 卷
l ro 0 71 1 ;新生牛血清( N B s),郑州佰安生物工程有
限公司 ,批号 01 106 ;十二烷基硫酸钠 ( S Ds) 为西安
化学试剂厂产品 ,批号 9 803 1;2 胰岛素为北京鼎国
生物技术有限责任公司 , 唾哇蓝 ( 3 一「4 , 5 一 id m e ht y hlt -
i a z o l
一
2
一
y l」一 , 5 d ip h e n y l te tarz o l i u m b r o id e , M竹 ) 为
is gm
a 分装 ,原产品编号为 巧 50 ;其余试剂均为市
售分析纯 。
1
.
3 细胞系
H el a 细胞株购自军事医学科学院病毒研究所 。
培养于含 10 % 小牛血清的 D M EM 培养基中 ( 内含
青霉素 IOO U / nIL , 链霉素 10 0 U / m L ) , 在 37 , 5%
CO : 条件下培养 ,每 2 一 3 d 传一代 。
1
·
4 化学成分系统预试 [’]
1
.
4
.
1 供试样品的制备 水提取液 :称取木蹄层孔
菌子实体样品 10 9 , 加人蒸馏水 10 0 m L , 在室温浸
泡过夜 ,滤液 or m L 用于检查氨基酸 、多肤和蛋白质
等 。 剩余样品渣及浸液在 60 ℃水浴中加热 or m in ,
立即过滤 。 此液用于检查糖 、多糖 、皂贰 、 贰类和蹂
质等 。
酸性乙醇提取液 : 称取木蹄层孔菌子实体样品
or g
,加人 70 m L O . 5% 盐酸乙醇溶液 , 在水浴上回
流 10 m in ,乘热过滤 ,得酸性乙醇提取液 。 此液用检
查酚性成分 、有机酸和生物碱等 。
甲醇提取液 :称取木蹄层孔菌子实体样品 10 9 ,
加人 70 m L 甲醇 ,在水浴上回流 10 m in , 乘热过滤 ,
滤液供检查黄酮及其贰类 、 葱酿及其贰类 、强心贰 、
香豆素及其贰类 、 内脂 、酉旨类 、挥发油 、植物街醇和油
脂类等。
乙醚提取液 :称取木蹄层孔菌子实体 5 9 粗粉 ,
加乙醚 50 m L ,水浴回流 20 m in ,滤液浓缩至 5 m L ,
检测内醋 、 油脂和挥发油 。
1
.
4
.
2 试管预试 法 向盛有供试液的试管中加人
相关试剂 ,根据颜色 、 沉淀 、 荧光等反应现象判断某
化学成分的存在 。
1
.
4
.
3 圆形滤纸层析法 用毛细管吸取不同的提
取液在圆形滤纸上点样 ,使乙醇从中心展开 ,待乙醇
挥发后 ,喷以不同显色剂 。 根据出现的颜色 、斑点或
产生的荧光 ,判断样品的成分 。
1
.
5 不同提取溶剂样品的制备
称 3 . 5 k g 已粉碎的木蹄层孔菌子实体 ,用 95 %
工业酒精与样品 l尔 1 的比例进行超声波提取 ,每
次提取 l h ,共 3 次 。 浓缩回收工业酒精 , 得乙醇浸
膏 ;再加水悬浮 ,依次用石油醚 、 氯仿 、 乙酸乙醋 、水
饱和的正丁醇进行萃取 ,减压浓缩得石油醚提取物 、
氯仿提取物 、 乙酸乙醋提取物 、 正丁醇提取物 。
1
.
6 试样制备
分别称取各溶剂提取物 50 m g ,先溶于少量无
水乙醇 , 通过超声和加热的办法使其充分完全溶
解 ,临用前以 DM EM 为基础培养基 + 20 % 新生牛血
清 + 1% 的 SD S 为稀释液将其稀释为 50 、 10 、 250 、
5 00 和 1 0X() 林g/ m L o
1
.
7 M rT 法测定不同溶媒提取物的抗肿瘤作用 〔’ ]
将肿瘤细胞 h e l a , 以 5 x 10 , /孔接种于 96 孔
板 ,置 CO : 培养箱 ( 5% CO : ,饱和湿度 , 37 ℃ ) 中培
养 24 h 后 ,每孔加人不同终浓度的药物 2 0 卜L , 空
白对照组加 20 协L 稀释液 , 置 CO : 培养箱 ( 5%
CO
: ,饱和湿度 , 37 ℃ )继续培养 48 h ,每孔加人 MT T
( 5 m g/ m L ) 20 协L , 37℃孵育 6 h ,然后吸出 10 林l液
体 ,再加 10 林l 甲攒溶解剂 ( S DS 液 : s DS l o g 溶解
于 10 0 mL 的四蒸水中 , 用 10 m o F L H cl 调至为 .0
01 m o F L 的 H C I ) 37 ℃ 过夜 , 在酶标仪 ( 型 号
EXI 80 U V )上测 O D值 (双波 : 450 n m 、 490 mn ) 。
抑制率 二 ( 1 一 实验组 oD 值 /对照 o D 值 ) x
100%
1
.
8 统计学方法
采用 DSP v3 . ol 专业版软件进行方差分析 。
2 结果与分析
2
.
1 化学成分系统预试结果
表 1 木蹄层孔菌化学成分预试结果
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预 试结 果
A (试管法 ) B( 圆形滤纸法 )
酚性成分 + +
有机酸 + +
揉质 +
生物碱
氨基酸 、 多肤和蛋白质
糖、 多糖和昔类 + +
皂昔
黄酮类及其昔类 +
内醋、香豆素或其昔类 + +
植物街醇、 三菇成分 + +
葱醒及其昔类 十 +
挥发油 、 油脂
注 : “ 十 ” 表示阳性反应 , “ 一 ” 表示阴性反应。由表 1 可知 ,木蹄层孔菌中存在酚性成分 ,有机
酸 ,糖 、多糖和昔类 , 内醋 、香豆素及其昔类 ,植物幽
醇 、菇类化合物 ,葱醒及其昔类 。 可能含有蹂质 ,黄
酮类及其昔类 。
2
.
2 不同溶剂提取物重量及提取率
不同溶剂提取物称重 , 计算提取率 (相对于总
生药量 )结果见表 2 。
第 4期 陆勇芹 等 木蹄层孔菌化学成分及不同提取物体外抗肿瘤活性研究
表 2 不同溶剂提取物重t 及得率
口
1’ ab le 2 Th e we ih ge n a dp二e n ti 卿 J d注e r欣t e x oc .t
26358
提取溶剂
石 油 醚
氛仿
乙酸乙醋
正 丁 醇
提取物状态
褐色浸膏
褐色浸膏
褐色浸膏
褐色浸膏
提取物重量/ g提取率/ %
40 .2 7.ro26 1
2
.
3 不同溶剂提取物对 H el a肿瘤细胞增殖的作用
经与细胞共育 8 4h 后 ,发现不同浓度的提取物
处理 H el a 细胞 , 随浓度的增加其抑制率也增加 ,在
测定浓度范围内表现为剂量依赖性抑制 。 其中氯仿
提取物在 1 0 0 林留mL 时抑制率高达 7
.
37 %
, 乙酸
乙醋提取物 1 00 林岁mL 时达到 69
.
63 %
,正丁醇提
取物表现出较弱的抑制作用 , 石油醚提取物抑制作
用最弱 。 可见氯仿提取物和乙酸乙醋提取物在体外
对肿瘤细胞有很强的细胞毒活性 (表 3 ) 。
表 3 木蹄层孔菌不同提取物对 H el a
细胞作用 48 h 后的抑制率
1’alJ le 3 hT e in hi bi t呵 e伟ec t on he la e el s o f
凡朋 fo 而记 n如雌。 击玉溉 t e x it 习 c t %
浓度/
(林 g
一 :
) 石油醚 抓仿 乙酸乙醋 正丁醇
0
17
.
6二
37
.
9 1二
4 2
.
3 6二
5 0
.
2 9二
” . 3 7 二
0
9
.
6 7二
2 6
.
6 9二
4 1
.
7 8二
4 8
.
16二
5 4
.
3 5二
由基产生过多 ,脂质过氧化物增多的表现 。 近年来
研究表明木蹄层孔菌子实体乙醇提取物能明显提高
肿瘤细胞的凋亡率 , 提示其体外的抗肿瘤活性可能
与提高肿瘤细胞的凋亡率有关 ;能显著降低肝脏 , 肾
脏 M D A含量 ,说明其抗肿瘤作用可能与其能减轻
体内脂质过氧化程度从而减轻细胞的损伤程度有
关〔’ “ ] 。 这些实验研究 , 为进一步研究木蹄层孔菌子
实体抗肿瘤作用提供了实验依据 。
从抗肿瘤活性方面证实 ,木蹄层孔菌子实体的
不同提取物在所用浓度下对肿瘤细胞均有不同程度
的抑制作用 ,氯仿和乙酸乙醋提取物是木蹄层孔菌
子实体抗肿瘤作用的主要部位 , 由此可确定木蹄层
孔菌子实体中存在天然抗肿瘤活性物质 ,但是本试
验只选取了体外生长的 H el a 细胞进行了研究 ,有一
定的局限性 , 因此有必要扩大试验肿瘤细胞范围 ,并
进行活体抗肿瘤实验 。 石油醚和正丁醇提取物抑制
效果不明显或以其他的作用机制发挥抗肿瘤作用 ,
有待于进一步研究 。
1982 年 M os ~ an 首先报道用 M T T 法来检测细
胞活性 , 以后又有研究人员用此法测定抗癌药物对
肿瘤增殖活性的效应 。 该方法简便 、 实验周期短
(一般只需 4 一 6 d ) 、 所需细胞数目较少 、人为误差
小 ,所得资料较精确 , 且无放射性污染 , 因此它也就
成为药物筛选的主要手段【’ ] 。 针对以前对木蹄层
孔菌子实体抗肿瘤研究都是以乙醇提取物为材料 ,
对木蹄层孔菌子实体中抗肿瘤活性化合物的研究很
有必要 ,所以对其抗肿瘤活性部位的筛选是进一步
研究其抗肿瘤活性成分的关键 。
本研究采用 M rT 法 , 以人体宫颈癌细胞 ( H el a )
为筛选模型 , 以体外抗肿瘤活性为指标 ,对木蹄层孔
菌子实体不同溶剂提取物抗肿瘤活性进行了筛选 。
结果表明 ,氯仿和乙酸乙醋提取物是木蹄层孔菌子
实体抗肿瘤作用的主要部位 ,要确定其活性部位含
有的抗肿瘤活性成分 ,还要对其主要活性部位的化
学成分进行分离 、 提取和纯化 , 此项工作正在进行
中。 从目前的研究状况来看 ,木蹄层孔菌子实体在
抗肿瘤方面有很好的应用前景 ,对其中的抗肿瘤活
性成分有待进一步研究 。
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10以) 26 .
注 : 二 尸 < 0 . 01 , C K 为对照
2
.
4 不同提取物对 H el a 细胞增殖作用的比较6[]
用 51脚a P lot 5 . 0 [’ ]分析其作用 4 s h 后各提取
物的 CI , 值 。 石油醚提取物的 CI , 为 6 9 39 . 134 协岁
m L
,氯仿提取物的 IC , 为 303 . 0 83 林岁 m L , 乙酸乙醋
为 33 7 . 9 5 4 林g/ m L , 正 T 醇 的为 5 7 4 . 7 15 协g/ mL 。
比较各提取物对 H el a 细胞 尤知值 ,发现氯仿提取物
对 H el a 细胞增殖抑制作用最强 , 乙酸乙醋物次之 ,
正丁醇不明显 ,石油醚提取物最弱 。 由此提示木蹄
层孔菌子实体对 H el a 细胞的有效部位可能在氯仿
和乙酸乙醋 ,其中氯仿提取物是最具有活性成分。
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b lo记 gl u e ose , an d l iPi d P涵 le in
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3 讨论
iH to hs i等很早就报道了从木蹄层孔菌中分离
出的多糖成分对小鼠艾氏腹水癌具有有效的抗肿瘤
作用 [ S J 。 肿瘤的发生机制不仅涉及肿瘤细胞的失
控性增殖 , 而且与细胞凋亡有关 ,细胞凋亡在肿瘤生
长过程中起负调控作用 ,可 以遏制肿瘤迅速生长 ; 自
由基反应与肿瘤的发生和发展过程密切相关 ,在复
杂的癌变过程中可能起重要作用 9[] , M DA 是脂质过
氧化的主要分解产物 , M DA 含量升高实际上是氧自
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