全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2016， 33（6）： 1040-1044
Journal of Zhejiang A＆ F University
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.06.016
红哺鸡竹异香柱菌的形态学和分子鉴定
李洪滨1， 朱诚棋2， 周 湘1， 马良进1， 苏 秀1
（1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院 ， 浙江 临安 311300； 2. 华南农业大学 林学院 ， 广东 广州
510642）
摘要： 竹丛枝病是普遍发生并导致竹林退化的最具破坏性的病害之一。 研究该病害的病原对于该病的防治有重大
的意义。 异香柱菌属 Heteroepichlo觕 箬竹异香柱菌 Heteroepichlo觕 sasae 是引起竹子丛枝病的病原之一。 利用形态学
结合系统发育分析的方法， 对采自浙江桐乡的红哺鸡竹 Phyllostachys iridescens 丛枝病病原进行了分离鉴定。 结果
表明： 根据该分离物的形态特征、 平板纯培养物的培养特征以及基于内源转录间隔区-核糖体 DNA（ITS-rDNA）序列
的系统发育分析， 最终确定为箬竹异香柱菌。 该分离物与红哺鸡竹丛枝病的关系还需进一步研究。 图 5参 14
关键词： 森林保护学； 红哺鸡竹； 丛枝病； 箬竹异香柱菌； 植原体； 系统发育分析
中图分类号： S763.1 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2016）06-1040-05
Morphological and molecular identification of Heteroepichlo觕 sasae
isolated from Phyllostachys iridescens
LI Hongbin1, ZHU Chengqi2, ZHOU Xiang1, MA Liangjin1, SU Xiu1
（1. School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China; 2. School of
Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China）
Abstract: Witches’-broom, one of the most common diseases of bamboo, induces extremely destructive deterio-
ration of bamboo stands. This study on the pathogens of witches’-broom was conducted to help control the dis-
ease. Branches of Phyllostachys iridescens were collected from Tongxiang City in Zhejiang Province, which suf-
fered from witches’-broom, and its pathogen, Heteroepichlo觕 sasae, was studied by morphologic and phyloge-
netic methods. Results showed that according to morphological, cultural, and phylogenetic characteristics Het-
eroepichlo觕 sasae was isolated from infected Phyllostachys iridescens branches. However, the relationship be-
tween this isolate and witches’-broom disease needs further study. ［Ch, 5 fig. 14 ref.］
Key words: forest protection; Phyllostachys iridescens; witches’-broom; Heteroepichlo觕 sasae; phytoplasma;
phylogenetic analysis
竹子是多年生的禾本科 Gramineae 植物。 中国约有竹子 39 属 500 余种。 红哺鸡竹 Phyllostachys iri-
descens广泛分布在浙江、 江苏、 湖北等省， 是非常重要的经济和观赏竹。 竹子丛枝病（witches’-broom of
bamboo） 又名扫帚病， 鸟巢病， 能导致竹子生长衰退， 严重影响竹子质量以及出笋率， 降低其观赏性，
甚至竹子大面积枯死。 虽然国内已有一些有关竹子病原菌的研究报道［1－2］， 但有关竹子丛枝病病原的研
究报道相对较少。 竹子丛枝病病原复杂， 涉及多个病原物如竹针孢座囊菌 Aciculosporium take， 竹暗球
腔菌 Phaeosphaeria bambusae， 异香柱菌属 Heteroepichloe 以及植原体（phytoplasma）等， 也有多种病原物
混合侵染的报道［3］。 竹香柱型丛枝病在中国报道的较少， 其病原菌包括箣竹香柱菌 Epichlo觕 bambusae 和
箬竹香柱菌 Epichlo觕 sasae 等 2 种。 朱熙樵 ［4］曾在浙江省境内的短穗竹 Brachystachyum densiflorum， 淡
收稿日期： 2015-11-20； 修回日期： 2015-12-23
基金项目： 浙江省重中之重林学一级学科开放基金项目（KF201330）； 浙江省教育厅资助项目（Y201431042）
作者简介： 李洪滨， 从事林木病原微生物鉴定研究。 E-mail： 240615800@qq.com。 通信作者： 苏秀， 实验师，
从事林木病理学研究。 E-mail： suxiu@zafu.edu.cn
第 33 卷第 6 期
竹 Phyllostachys glauce， 白哺鸡竹 Phyllostachys dulcis 及毛竹 Phyllostachys edulis 上收集到箣竹香柱菌的
标本； 王华清等 ［5］也从毛竹上采集到箣竹香柱菌的样品。 2002 年， 日本学者 TANAKA 等 ［6］根据形态学
结合分子检测的结果， 将这 2 种菌更名为箣竹异香柱菌 Heteroepichlo觕 bambusae 和箬竹异香柱菌 H.
sasae。 目前， 国内明确的报道是 H. sasae 能引起箬竹丛枝病［1,7－8］及短穗竹丛枝病［9］。 对于植原体与真菌
复合侵染引起丛枝病的情况， 有研究发现， 水竹 Phyllostachys heteroclada 丛枝病病枝的电镜观察中同时
存在类细菌、 植原体和瘤座菌菌丝， 并且类细菌的培养液接种健株后能诱发水竹丛枝病［10］； 朱熙樵等［11］
从竹瘤座菌 Balansia take 引起的竹丛枝病病枝中发现有植原体的存在。 本研究应用形态学特征观察结合
聚合酶链式反应检测手段， 对浙江桐乡市红哺鸡竹丛枝病枝进行了病原物的分离与分子鉴定。
1 材料与方法
1.1 试验材料
红哺鸡竹健株和丛枝病株均于 2014 年 4 月采自浙江省桐乡市灵安镇。 采集的新鲜样品直接用于试
验或保存于－70 ℃备用。
1.2 试验方法
1.2.1 形态观察 观察采集到的新鲜子实体的颜色、 大小及质地； 作真菌子座横截面的徒手切片， 观察
真菌的子囊壳、 子囊及子囊孢子。
1.2.2 分离培养及培养特征的观察 取新鲜的子实体， 将它切成 2～3 mm 的小段， 用体积分数为 75%的
乙醇浸泡 2~3 s 后， 再用体积分数为 10％的次氯酸钠消毒 3～5 min， 最后用无菌水漂洗， 用灭菌滤纸控
干后移植于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上， 放入 25 ℃的恒温培养箱培养。 隔 24 h 观察并记录真菌的
生长状况。
1.2.3 红哺鸡竹丛枝病真菌的分子检测 ①植物总 DNA 的提取。 分别称取 0.1 g 真菌子座及平板菌丝
体， 采用 Takara 各种材料全基因组提取试剂盒（Takara, 中国大连）的方法提取总 DNA， 浓度检测合格
后， 置于－20 ℃冰箱中备用。 ②聚合酶链式反应扩增。 聚合酶链式反应的引物为真菌内源转录间隔区-核
糖体 DNA（ITS-rDNA）区段通用引物对 ITS1F/ITS4， 用 Taq 酶（Takara, 中国大连）进行扩增， 具体反应体
系参照说明书。 聚合酶链式反应条件为 94 ℃预变性 3 min, 35 个循环中， 94 ℃变性 30 s， 50 ℃退火 45
s, 72 ℃延伸 1 min, 最后 72 ℃延伸 10 min。 产物于 4 ℃保存。 ③ 聚合酶链式反应产物的电泳检测及序
列测定。 聚合酶链式反应产物在 10 g·kg－1琼脂糖凝胶， 150 V， 25 min 电泳检测后， 委托杭州皓丰生物
技术有限公司测序。
1.2.4 红哺鸡竹丛枝病植原体的分子检测 ①植物总 DNA的提取。 称取 0.1 g感病及健康的红哺鸡竹植
株的韧皮部组织， 采用常规的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法分别提取总 DNA， 浓度检测合格后， 置
于－20 ℃冰箱中备用。 ②聚合酶链式反应扩增。 参照邱并生等［12］的方法， 采用巢式聚合酶链式反应的方
法扩增植原体。 所用引物为植原体通用引物 R16mF2/R16mR1 及 R16F2/R16R2［13］， 用 Taq 酶（Takara, 中
国大连）进行扩增。 第 1轮以植株的总 DNA为模板， R16mF2/R16mR1 为引物， 聚合酶链式反应条件为94
℃预变性 3 min； 35 个循环中， 94 ℃变性 30 s， 55 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 1 min； 最后 72 ℃延伸 10
min。 第 2 轮用第 1 轮扩增产物的 50 倍稀释液为模板， R16F2/R16R2 为引物， 退火温度提高到 60 ℃，
其余条件与第 1 轮相同。 聚合酶链式反应产物的电泳检测及序列测定与 1.2.3相同。
1.2.5 序列同源性比较及系统发育树构建 从美国生物技术信息中心（NCBI）数据库（http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/）下载与本实验所得序列相关的基因序列， 并使用 MEGA 6.06［14］数据软件中的 neighbor-join-
ing法构建进化树， 其中 ‘bootstrap’ 设定为 1 000 次重复， 遗传距离使用 MEGA 6.06 数据软件屮提供
的 ‘Jukes and Cantor ’ 法进行计算。
2 结果与分析
2.1 感病植株症状表现
红哺鸡竹丛枝病多发于老竹林以及缺乏管理且过密的竹林， 发病时间多为 4 月初至 7 月中旬， 发病
症状为个别竹枝发病， 进而扩展到其他枝条。 发病的竹枝呈现扫把状， 分枝增多， 竹叶明显变小， 叶片
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的颜色也较正常叶片淡（图 1）。
2.2 红哺鸡竹丛枝真菌的形态特征
子座包裹于竹叶鞘中， 为弯曲杆状， 中间稍厚， 两端稍细，
形如香柱， 为肉质质地， 长度约为 3～7 cm， 呈灰色或者黑色，
中轴有一浅黄色线状条带连接两端（图 2A）， 切开后内部为绿色。
子囊壳大多为长圆形或卵圆形， 紧密地着生于子座外侧， 颜色
为褐色或暗红色， 成熟的子囊壳外侧有一孔状开口（图 2B）， 隐
约可见内部长条状子囊（图 2C）。 组织分离实验发现， 该菌生长
极其缓慢， 容易被杂菌污染， 常规组织分离 15 d 左右才长出菌
丝体， 菌丝为纯白色的毛绒状， 菌正反面菌丝颜色一致（图 2D）。
在对该菌落的逐步观察记录中发现， 该菌在组织分离 20～30 d 生
长速度最快， 之后生长减缓。
图 2 子实体和菌落形态
Figure 2 Fruiting bodies and colony
。
2.3 红哺鸡竹丛枝真菌的分子检测
以真菌 ITS-rDNA 区段通用引物 ITS1F/ITS4 作为引物， 从红哺鸡竹子座及平板菌丝体中扩增到了约
600 bp的片段（图 3）， 与预期大小相符； 而健康组织及双蒸水的对照中没有出现特异扩增带， 说明该病
样中确实有真菌存在。
2.4 红哺鸡竹丛枝植原体的 PCR检测结果
利用巢式聚合酶链式反应技术从表现症状的红哺鸡竹的韧皮部组织中没有扩增出片段， 而从阳性对
照桑萎缩病样品（本实验保存）中扩增到了约 1.2 kb 的预期大小的片段（图 4）。 说明感病红哺鸡竹没有受
到植原体的侵染。
2.5 红哺鸡竹丛枝真菌序列分析及系统进化树构建
红哺鸡竹丛枝真菌经测序列得到 545 bp 的 ITS-rDNA 序列， 将该序列与美国生物技术信息中心中的
基因序列进行比对。 结果表明： 该病原菌与异香柱菌属 Heteroepichlo觕 的 2 个代表种 sasae-K， sasae-H
（GeneBank 登录号： AB065430.1和 AB065432.1）的同源性高达 97%。 从美国生物技术信息中心下载相关
图 1 红哺鸡竹丛枝病症状
Figure 1 Witches’-broom symptom of infected
Phyllostachys iridescens
。
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第 33 卷第 6 期
的 ITS-rDNA 序列， 并构建系统发育进化树（图 5）， 结果可见： 分离自红哺鸡竹的丛枝真菌与 Het-
eroepichlo觕 sasae-K和 Heteroepichlo觕 sasae-H的亲缘关系最近， 此节点支持率为 100%。
3 结论与讨论
本研究通过形态学特征观察和聚合酶链式反应检测从红哺鸡竹丛枝病枝中检测到了 1 种真菌， 并根
据 ITS-rDNA序列一致性和系统进化树分析结果， 明确该真菌为箬竹异香柱菌 Heteroepichlo觕 sasae。
目前， 已知竹香柱型丛枝病病原有箣竹香柱菌和箬竹香柱菌 2种。 前者的子座为微黄色， 平板培养
物分生孢子较短， 后者子座为紫色， 分生孢子较长， 其余构造没有显著差异［6］。 采自浙江桐乡红哺鸡竹
丛枝病的子座颜色为深紫色， 与箬竹香柱菌更为接近； 而本试验中， 平板纯培养物未能见到分生孢子产
生， 这也许跟培养时间、 温度、 营养有关系。 本试验采用的是 PDA 培养基及 25 ℃的培养条件， 今后可
以对这些条件做些调整进行进一步的研究。 系统发育学上， ITS-rDNA 系统发育树显示， 采自红哺鸡竹
图 3 红哺鸡竹丛枝真菌 ITS-rDNA 序列聚合
酶链式反应扩增电泳图
Figure 3 PCR amplification of ITS-rDNA of fungi
图 4 红哺鸡竹丛枝植原体 16S rRNA 基因序列聚
合酶链式反应扩增电泳图
Figure 4 PCR amplification of 16S rRNA gene of phytoplasma
associated with Phyllostachys iridescens witches’-broom
。 。
图 5 利用邻接法构建的基于 ITS-rDNA序列的系统进化树
Figure 5 Phylogenetic tree based on ITS-rDNA sequences of Ph. iridescens witches’-broom and related fungi constructed with the
neighbor-joining method
o觕
o觕
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李洪滨等： 红哺鸡竹异香柱菌的形态学和分子鉴定 1043
浙 江 农 林 大 学 学 报 2016 年 12 月 20 日
丛枝病的试验菌株与异香柱菌属 Heteroepichlo觕 构成一个分支， 且与 Heteroepichlo觕 sasae 高度聚类， 节
点支持率达到了 100%， 说明它们的亲缘关系很近， 可以解释为红哺鸡竹丛枝病的试验菌株为 H. sasae
的 1个分离物， 由于寄主不同， 产生了一些遗传上的差异。
国内异香柱菌引起竹丛枝病的报道较少， 对 H. sasae 和 H. bambusae 这 2 种病原的描述也比较简
单。 本研究从红哺鸡竹丛枝病枝上分离到的真菌与程燕林等［9］在短穗竹丛枝病枝上分离鉴定的真菌均为
箬竹异香柱菌。 这将该真菌的寄主范围又进一步扩大， 但该真菌是否为红哺鸡竹丛枝病的病原菌， 还需
要进一步的致病性实验验证。 中国竹丛枝病发生十分普遍， 有必要对不同竹种上的香柱菌进行详细的形
态学以及分子系统学的研究以确定其分类地位。
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