全 文 ：Mycosystema
菌 物 学 报 15 September 2010, 29(5): 771-776

jwxt@im.ac.cn
ISSN1672-6472 CN11-5180Q
©2010 Institute of Microbiology, CAS, all rights reserved.






基金项目：浙江省自然科学基金（No. Y3090409）；哈尔滨市青年科学基金（No. 2002AFQXJ006）
*Corresponding author. E-mail: peikequan@ibcas.ac.cn
收稿日期: 2010-05-05, 接受日期: 2010-05-24

染色体倍性差异对蜜环菌生物种系统发育学分析的影响
孙立夫 1,2 张艳华 1 杨国亭 3 宋玉双 4 秦国夫 4 宋瑞清 3 赵俊 4
裴克全 2*
1绍兴文理学院生命科学学院 绍兴 312000
2中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室 北京 100093
3东北林业大学林学院 哈尔滨 150040
4国家林业局森林病虫害防治总站 沈阳 110034


The effect of chromosome ploidy diversity on Armillaria biological
species phylogeny analysis
SUN Li-Fu1, 2 ZHANG Yan-Hua1 YANG Guo-Ting3 SONG Yu-Shuang4 QIN Guo-Fu4
SONG Rui-Qing3 ZHAO Jun4 PEI Ke-Quan2*
1Life Science Faculty, Shaoxing University, Shaoxing 312000, China
2State Key Laboratory of Vegetation and Environmental Change, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
3College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
4Forest Diseases and Insect Pests Prevention and Cure General Station of Chinese State Forestry Department, Shenyang 110034, China


蜜环菌属 Armillaria (Fr.: Fr.) Staude 是担子菌
亚门中一个经济价值很高的属。它是寄主范围广，
致病能力强，世界性分布的重要病原菌（秦国夫等
2001）；同时它还有一定的特殊性，特别是高度分
化的根状菌索，既能寄生、共生又可腐生的生存能
力，以及在营养菌丝阶段明显而稳定的双倍体核等
（Kile et al. 1994）。蜜环菌属这些惟一性的特征表
明：该属处在伞菌中远离其他属的地位，说明蜜环
菌在较高等的担子菌中代表一条优越的进化路线
（Kile et al. 1994）。因而基于分子标记进行系统发
育学研究是蜜环菌研究热点中较为重要的一个方
向。在研究不同大陆间的蜜环菌系统发育关系中，
有些生物种只能获得双倍体菌株，这样便产生了一
个问题：参试菌株若单、双倍体混杂在一起分析，
其染色体倍性差异是否会对系统发育学的分析结
果产生影响呢？本文将用 ISSR-PCR 作分子标记，
以法国蜜环菌 A. gallica Marxm. & Romagn.为材料
来设计实验进行验证。
ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）标
记是 Zietkiewicz et al.（1994）首次使用的一种分子
DOI:10.13346/j.mycosystema.2010.05.001
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标记技术，它通常为显性标记，呈 Mendel 式遗传，
有很好的稳定性和多态性，经济高效，是近年来使
用较多的理想分子标记之一（王伟继和孔杰 2002；
Lefrancois et al. 2002；Sunil et al. 2003；Liang et al.
2005；Venkateswarlu et al. 2006；Estrada et al. 2007；
张介驰等 2007；宋小亚等 2007；Nguyen et al.
2008；唐利华等 2008；许美燕等 2008；段会军等
2008；王卓仁等 2010）。在蜜环菌 Armillaria 系统
发育学研究中，ISSR 标记已有使用（秦国夫等
2001；孙立夫等 2003；孙立夫等 2009b）。
蜜环菌属的有性生殖多是双因子控制的四极
性异宗配合的交配机制（Hinttika 1973；秦国夫和
Hantula 2002）。法国蜜环菌为异宗配合种，其单倍
体的染色体数量为 4 条（Guillaumin et al. 1991），
控制性别的两个基因分别在两条不同的染色体上，
不存在连锁关系（Anderson & Ulllrich 1979），且这
两个基因存在大量的复等位基因（秦国夫等
1999）。当两个单倍体亲本交配时，细线状的同源
染色体逐步相互配对联会，在 F1 代形成两套（4 对）
染色体，即双倍体，这两套染色体分别来自两个亲
本。一个或几个基因座位上的等位基因相同的二倍
体或多倍体称纯合子，基因型表示为 AA 或 aa；不
同时则称为杂合子，基因型表示为 Aa（邹喻苹
2001）。本研究选用的 ISSR-PCR 标记大部分为显性
标记，但也有相当一些 ISSR-PCR 扩增的条带呈共
显性，且符合孟德尔遗传规律（Tsumura et al.
1996）。其表现为共显性意味着当两个等位基因具
有不同的碱基长度时，可将 AA 和 Aa 分开，即它
能分开纯合子和杂合子，而显性标记则不能将之分
开。如果是纯合的双倍体，则它的 ISSR-PCR 扩增
产物与单倍体的应该是一样的，即电泳时单倍体亲
本和双倍体 F1 代的多态性及带型相差无几；若是
杂合的双倍体则不论 ISSR-PCR 扩增的条带是共显
性还是显性，其带型应与两个单倍体亲本中表现为
显性的多态性高的一个亲本的带型相似或相同。
本研究中的双倍体菌丝是由两个单倍体亲本
交配，即由两个已知的来自中国的单倍体菌丝，通
过其含有的两个交配型复等位基因的控制，在亲和
性交配反应后产生的，即亲代与其 F1 代的亲缘关
系是清楚的。用这些菌株再加上来自欧洲的一些单
倍体菌丝来构建系统发育树，通过单倍体亲本和双
倍体 F1 代间的系统发育树支序上的位置判断，若
F1 代与其亲本出现在同一支序里，则表明双倍体的
F1 代可以代表其单倍体的亲本参与洲际大陆间水
平上的系统发育树的构建和分析。以此来确定参试
菌株染色体倍性差异是否会对其系统发生学的分
析结果和聚类分析产生影响。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养
选择 6 个单倍体的法国蜜环菌菌株进行互交可
育实验，菌株编号分别为 02108、02146、02162、
02163、96031/2 和 96032/31，其中前 4 个菌株可分
别同后 2 个菌株中的任一个互交可育而产生双倍体
（表 1），并将亲合反应产生的双倍体菌丝进行扩繁
培养，参见孙立夫等（2003）的方法。
1.2 DNA 提取与 ISSR-PCR 扩增
DNA 提取详见孙立夫等（2009a）的方法。用
ISSR-PCR 标记对表 1 中全部菌株以及 5 个来自欧
洲的法国蜜环菌单倍体菌株（编号为 E-m60、
E-m61、E-m62、E-m63、E-m64）进行扩增，所
用 6 个引物以及反应体系详见孙立夫等（2009b）
的方法。
1.3 电泳检测与数据处理
用 1.5%的琼脂糖进行凝胶电泳检测。用
Labworks（4.0）专业软件读取电泳带，并遵循以下
几个原则：一是只记录易于辨认的带，排除模糊不
清的带；二是排除所要比较的泳道中无法准确标识
的带；三是迁移率相同，但强度不同的带，当强带
与弱带的亮度相差 1 倍时，应视为不同的带（邹喻
苹 2001）。在形成相对分子量数据表后进行 0-1 数
据转换，并进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 电泳图谱比较分析
从 ISSR-PCR 扩增的电泳图谱可以看到：双倍
体的 F1 代电泳带型和条带特点有一定的共性：在
绝大多数双倍体的 F1 代两侧的 2 个亲本中，至少
有 1 个亲本的条带特征与之相同或相似，即绝大多
数双倍体 F1 代的电泳带型与 2 个亲本中的至少其
中 1 个的带型相同或相似（图 1）。极个别双倍体泳
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表 1 单倍体与双倍体菌株亲缘关系对应表
Table 1 The genetic relationship of haploid/diploid isolates of Armillaria gallica
亲本/F1 代菌株编号
Parent/F1 generation strain No.
模板号
Template No.
单/双倍体
Haploid/Diploid
亲本-F1 代关系
Relationship of parent strains and F1 generation strains
a（02108） u7 单倍体 Haploid 亲本 Parent
d（02146） u31 单倍体 Haploid 亲本 Parent
e（02162） u42 单倍体 Haploid 亲本 Parent
f（02163） u43 单倍体 Haploid 亲本 Parent
③（96031/2） g7 单倍体 Haploid 亲本 Parent
④（96032/31） g8 单倍体 Haploid 亲本 Parent
3a 3a 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (a×③=3a)
3d 3d 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (d×③=3d)
3e 3e 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (e×③=3e)
4a 4a 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (a×④=4a)
4d 4d 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (d×④=4d)
4e 4e 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (e×④=4e)
4f 4f 双倍体 Diploid F1 代 F1 Generation (f×④=4f)
注：单倍体均为亲本，双倍体均为 F1 代；×：杂交.
Note: Haploid: Parent; Diploid: F1 generation; ×: Mating.

图 1 单倍体与双倍体菌株 ISSR-PCR 扩增图谱 本图是所用 6 个引物之一[(A/C/G)(G/A/T)(A/T/C)(TCG)5]的扩增电泳图. M：200bp DNA
Ladder Marker；1：③；2：3a；3：a；4：4a；5：④；6：4d；7：d；8：3d；9：③；10：3e；11：e；12：4e；13：④；14：4f；15：f；M：同前；
16：E-m60；17：E-m61；18：E-m62；19：E-m63；20：E-m64；M：同前.
Fig. 1 Amplification by ISSR-PCR with diploid and haploid strains of Armillaria gallica: the electrophoregram is one of 6 primers
[(A/C/G)(G/A/T)(A/T/C)(TCG)5] amplification results. M: 200bp DNA Ladder Marker; 1: ③; 2: 3a; 3: a; 4: 4a; 5: ④; 6: 4d; 7: d; 8: 3d; 9: ③; 10: 3e;
11: e; 12: 4e; 13: ④; 14: 4f; 15: f; M: As the former; 16: E-m60; 17: E-m61; 18: E-m62; 19: E-m63; 20: E-m64; M: As the former.

带出现了特别的 2 个亲本都没有的条带，这可能是
染色体联会后发生染色体交叉重组从而改变了部
分碱基序列，造成 PCR 产物的改变。但这种情况发
生的几率很小，主要的规律仍是遗传占主导地位。
2.2 聚类分析
根据单/双倍体基于 ISSR-PCR 扩增电泳图谱
生成的 0-1 数据，用非加权配对算术平均法
（UPGMA）进行聚类分析，分析软件为 NTSYSpc
2.02a 版本。
从所得遗传相似性系数可以看出，单倍体亲本
与双倍体 F1 代间的遗传相似性关系与从电泳图谱
直观分析所得结果相一致，即大部分 F1 代与两个
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亲本中的至少一个亲本的相似性系数较大，例如，
双倍体 F1 代 3a、3d、3e 与单倍体亲本③的遗传相
似性系数分别为 0.81、0.85、0.82，与另一亲本 a、
d、e 的相似性系数分别为 0.72、0.63、0.72，而两
个亲本之间的遗传相似性系数分别为 0.73、0.60、
0.70；这 7 个菌株与 5 个外群（欧洲法国蜜环菌）
的相似性系数大部分在 0.6 以下。这表明法国蜜环
菌的同一大陆的单/双倍体间的遗传相似性要大于
不同大陆间的遗传相似性。
根据 0-1 数据，用分析软件 NTSYSpc 2.02a 版
本进行聚类分析。构建的系统发育树表明：作为外
群的欧洲大陆 5 个法国蜜环菌单倍体菌株与中国的
单倍体/双倍体法国蜜环菌菌株明显分成两个发育
系。在中国的发育系中，除 d 变异较大而独立成为
一个分支外，其余各双倍体菌株分别围绕着③和 a、
④和 e、f 等几个单倍体亲本而形成了 3 个主要的发
育分支（图 2）。在这个发育树中所有 7 个双倍体菌
株都与各自的 2 个亲本中的其中 1 个亲本出现在同
一分支中。这表明在大多数情况下双倍体菌株在系
统发育树中的位置会出现在与其 2 个亲本中的其中
1 个亲本遗传距离较近的同一分支里，而不会因为
其是双倍体的缘故而游离于同一大陆水平的系统
发育系之外。
3 讨论与结论
通过对电泳图谱的直接观察和 0-1 数据的聚类
分析表明，从野外采集的双倍体菌株可以作为洲际
大陆板块间这一水平尺度的代表菌株，参与蜜环菌
生物种系统发育学的研究。对于在洲际大陆板块这
一尺度水平上研究系统发育学而言，自然产生的双
倍体菌株的参试不会影响其所代表的洲际大陆板块
的蜜环菌生物种菌株在系统发育树上的应有位置。
另外，电泳图谱的观察比较和聚类分析还表
明，ISSR 标记的重复性和稳定性是很好的。本研究
对③和④两个 DNA 模板的扩增各做了 1 次重复，
并在同一块胶上进行了电泳，两次扩增结果的电泳
带型几乎完全一致，聚类分析所得遗传相似性系数
达到了 0.98，说明 ISSR 标记是很理想的一种分子
标记，其多态性片段覆盖了整个基因组，检测的多
态性信息更加全面，而且 ISSR 的引物序列在研究
对象的基因组中是真实存在的，所以它的真实性更
好。据此可以确定，部分用双倍体菌株作为参试菌
株，用 ISSR 标记进行不同大陆间的蜜环菌生物种
系统发育学的研究可以得到理想的结果。

图 2 同种蜜环菌的同一大陆内单倍体亲本及双倍体 F1 代菌株与不同大陆单倍体菌株间的系统发育树
Fig. 2 The rootless phylogenetic tree based on haploidy and diploidy strains of the same Armillaria biological species from different continents.
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