全 文 ：菌 物 学 报 26（4）：557~564，2007
Mycosystema

糙皮侧耳（平菇）疏水蛋白的分离纯化及其界面自组装特性
研究
马爱民* 单麟军 杜昭平 谢笔钧
（华中农业大学食品科技学院 武汉 430070）
摘 要：从糙皮侧耳 Pleurotus ostreatus Pm039 菌丝体中分离纯化到一种疏水蛋白并命名为 Po.HYD1，
SDS-PAGE显示其分子量约 15kDa。Po.HYD1具有高度的表面活性，100µg/mL浓度下能够降低水表面张
力至 25.5mN/m。在 1~100µg/mL浓度范围内存在 6µg/mL和 24µg/mL两个关键浓度，说明了不同浓度范
围内自组装条件的改变。水接触角测定证明了 Po.HYD1自组装膜的包被能够逆转固体表面的可湿润性。
原子力显微镜分析揭示了 Po.HYD1在云母表面形成厚度 4.2±0.1nm“小杆层”；在高定向热裂解石墨表
面形成厚度 3.2~3.8nm吸附层；在剧烈振荡诱导下的水溶液中形成形状相似、取向一致但体积大小不等的
“耳型”颗粒。
关键词：糙皮侧耳，疏水蛋白，平衡表面张力，水接触角，原子力显微镜
中图分类号：Q939.96 文献标识码：A 文章编号：1672-6472（2007）04-0557-0564

Purification of hydrophobin from Pleurotus ostreatus and
characterization of the interfacial self-assembly property
MA Ai-Min∗ SHAN Lin-Jun DU Zhao-Ping XIE Bi-Jun
(College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
Abstract：A hydrophobin designated as Po.HYD1 was purified from Pleurotus ostreatus Pm039. SDS-PAGE
analysis showed an approximate molecular mass of 15kDa. Po.HYD1 showed highly surface activity, and it was
able to decrease water surface tension to 25.5mN/m at concentration of 100µg/mL. Two crucial concentrations,
6µg/mL and 24µg/mL, were found by protracting the concentration-surface tension curve in range of
1~100µg/mL, which maybe indicate different conditions concerning interfacial self-assembly. Measurement of
water contact angles suggested Po.HYD1 can reverse surface wettability through coating solid materials. Atomic
force microscopy revealed Po.HYD1 formed distinct assemblages at different hydrophilic-hydrophobic
interfaces. It formed “rodlet layer” with thickness of 4.2±0.1nm on mica surface, formed adsorption layer with
thickness of 4.2±0.1nm on highly oriented pyrolytic graphite surface, and formed ear-like particles with similar
shape, identical orientation and various sizes in aqueous solution by induction of vigorous shaking.
Key words: Pleurotus ostreatus, hydrophobin, equilibrium surface tension, water contact angle, atomic force

基金项目： 国家自然科学基金资助项目（No. 39770530, No. 30170658）
*通讯作者 Corresponding author. Tel: 027-62229767; E-mail: maaimin@yahoo.com
收原稿日期：2007-05-30，收修改稿日期：2007-07-18
DOI:10.13346/j.mycosystema.2007.04.005
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microscopy
疏水蛋白（hydrophobin）是一类由丝状真菌特异产生的分泌型小分子蛋白质，具有8
个保守性半胱氨酸和相似水缘性图谱（氨基酸亲水-疏水性特征图谱）（Wosten, 2001）。
疏水蛋白在真菌生长发育过程中起着极为重要且广泛的生物学作用，如：降低水表面张力，
辅助基内菌丝脱离水相环境进而形成气生结构（Wosten et al., 1999）；赋予真菌气生结构
表面极高的疏水性并介导其对疏水性表面（如寄主）的附着（Talbot et al., 1996）；保护子
实体外表层并在子实体内部形成疏水性微通道保障高湿度环境下正常的气体交换
（Lugones et al., 1999；Trembley et al., 2002）等等。这些重要的生物学功能均是基于疏水
蛋白分子能够在疏水-亲水界面（如空气-水、油-水、空气-细胞壁等界面）发生自组装，进
而形成两亲性蛋白质膜这一机制所产生的（Wessels, 2000）。然而，疏水蛋白具有十分特
殊的生化性质，无法通过常规的蛋白质分离方法获得。疏水蛋白组装体仅能被100%三氟乙
酸（trifluoroacetic acid，TFA）有效地解离为单体结构并保持其完整性和生物学活性，而
解离的单体分子在水溶液中又迅速寡聚化进而形成高度不溶的组装体（林福呈，2001）。
本实验室曾利用mRNA差异显示技术克隆到一个与子实体发育相关的糙皮侧耳（平
菇）疏水蛋白基因（Ma et al., 2007）。为了在蛋白质水平进一步探讨疏水蛋白在高等担子
菌生长发育过程中的重要生理作用，本文报道了糙皮侧耳（平菇）菌丝体疏水蛋白的分离
纯化，并对其界面自组装特性进行了初步研究。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株：糙皮侧耳（平菇）Pleurotus ostreatus（Jacq. : Fr.）Quél，菌株编号Pm039，
为本实验室保存。
1.1.2 主要仪器：蛋白质电泳系统（Mini-PROTEAN3，Bio-Rad），原子力显微镜（NanoScope
IV，Veeco），视频光学接触角测量仪（DSA-100，Kruss），全自动表面张力仪（K-100，
Kruss）。
1.1.3 主要试剂：TFA（Sigma），丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、Tris、SDS（Amresco），
低分子量蛋白标准（TaKaRa），PDA培养基（Difco）。其它药品均为国产分析纯。
1.2 菌种培养
将试验菌株接种于贴有玻璃纸的PDA培养基上，25℃培养20d后收获气生菌丝。
1.3 疏水蛋白的分离纯化
将收获并经冷冻干燥的气生菌丝在液氮中研磨至精细粉末。所得粉末称重后，按照料
液比1:10（m/v）迅速转移至经沸水预热的抽提液Ⅰ（2% SDS，0.05mol/L Tris pH6.8）中，
保持100℃抽提10min，然后将此悬浊液4000r/min离心15min后收集沉淀。无菌水洗涤沉淀
中残留的SDS并经4000r/min离心10min后收集沉淀，重复此操作6～8次。将离心所得沉淀
置于抽提液Ⅱ（氯仿:甲醇=2:1）中，65℃抽提10min并过滤收集不溶物，重复此操作5次后
冷冻干燥。所得干燥材料称重后，按照25mg/mL加入100%TFA，置于冰浴中解离6h。将TFA
4期 马爱民等：糙皮侧耳（平菇）疏水蛋白的分离纯化及其界面自组装特性研究 559
悬浊液12000r/min离心15min，收集上清液并用氮气吹干后加入适量60%乙醇水溶液于25℃
静置溶解12h。将60%乙醇水溶液12000r/min离心30min，收集上清液后置于4℃透析除去乙
醇。将透析所得蛋白水溶液在漩涡混合仪上剧烈震荡5min，得到疏水蛋白组装体悬浊液。
将组装体悬浊液12000r/min离心30min，收集沉淀。最后，所得沉淀物经冷冻干燥后置于密
闭容器中室温保存备用。
1.4 疏水蛋白水溶液制备及含量测定
称取适量疏水蛋白组装体，加入少量三氟乙酸于4℃溶解30min，经氮气吹干后加去离
子水4℃静置溶解。为了避免疏水蛋白在水溶液中发生自组装，本文测定中所用疏水蛋白
水溶液均为新鲜配制。参照Bradford（1976）法测定高浓度疏水蛋白水溶液蛋白质含量并
以去离子水稀释至所需浓度。
1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
将疏水蛋白溶液进行SDS-PAGE分析，分离胶浓度15%，浓缩胶浓度5%。电泳结束后，
凝胶经硝酸银染色。
1.6 平衡表面张力测定
分别配制浓度为1.0、2.5、5、10、15、25、50、75、100µg/mL疏水蛋白水溶液。使用
Kruss K-100全自动表面张力仪分别测定各浓度样品的平衡表面张力值，测量温度25℃。从
“探测板”插入液面开始计时并每间隔10s记录当时液面表面张力值，当所测定张力值的
标准偏差连续达到≤0.005mN/m即视为达到平衡。
1.7水接触角（WCA）的测量
配置浓度为 20µg/mL的疏水蛋白水溶液并对所选用聚合物材料表面进行改性：将各疏
水性材料（Teflon、Parafilm “M”和硅烷化玻璃）分别浸泡于疏水蛋白水溶液中，25℃培
育 16h后，将材料取出，用去离子水冲洗材料表面 3次并吹干后待测；将疏水蛋白水溶液
滴加于各亲水性材料（尼龙、玻璃和云母）表面并确保表面完全被溶液覆盖，经空气干燥
后，用去离子水冲洗试验材料表面 3次并吹干后待测；未经疏水蛋白包被的原材料使用去
离子水冲洗材料表面 3次并吹干后待测。
使用 Kruss DSA-100 型视频光学接触角测量仪测定各试验材料经改性前后表面的
WCA。测定时，水滴体积一致采用 10µL，每种材料平行测定 10次后取平均值。
1.8 原子力显微镜（AFM）
配置浓度为 20µg/mL 的疏水蛋白水溶液并使其在不同疏水性-亲水性界面形成组装
体：将新鲜剥离的高定向热裂解石墨（HOPG）片浸泡于疏水蛋白水溶液中 25℃培育 16h，
取出石墨片用去离子水反复冲洗材料表面，经空气干燥后待测；将疏水蛋白水溶液滴于新
鲜剥离的云母片表面并空气干燥，然后用去离子水反复冲洗云母表面，经空气干燥后待测；
将疏水蛋白水溶液置于旋涡混合仪上与空气剧烈混合 3min 即得组装体悬浊液，将此悬浊
液滴于新鲜剥离的云母片表面并空气干燥后待测。
使用 Veeco NanocopeⅣ型 AFM及 NanoScope v.5.14 rev.8分析软件。采用轻敲模式
（tapping mode），Si3N4探针，扫描速率 1.057Hz，扫描数 512。所得图像仅经过自动平滑
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图1 糙皮侧耳Pm039菌株气生菌丝疏
水蛋白的SDS-PAGE分析
1. 纯化的疏水蛋白Po.HYD1；2. 低分子质量
蛋白质标准
Fig.1 SDS-PAGE analysis of hydrophobin
isolated from aerial hyphae of P. ostreatus
Pm039. 1. Purified hydrophobin Po.HYD1; 2.
Low molecular weight protein marker.
处理（flatten auto）。
2 结果
2.1疏水蛋白的 SDS-PAGE分析
根据疏水蛋白在水-空气界面自组装形成不溶性
组装体和担子菌疏水蛋白仅溶解于 TFA 的特性，我
们从糙皮侧耳 Pm039 菌株气生菌丝中分离纯化疏水
蛋白并进行 SDS-PAGE 分析，结果显示，分离得到
的疏水蛋白达到电泳纯水平，其分子量约为 15kDa
（图 1）。将此纯化的疏水蛋白命名为 Po.HYD1。
2.2 Po.HYD1水溶液的平衡表面张力测定
使用Kruss K-100全自动表面张力仪分别测定
1～100µg/mL浓度范围内各测试样品的平衡表面张
力值，并绘制浓度-表面张力曲线。由图2可以看出，
Po.HYD1通过水-空气界面自组装过程能够显著地降
低水表面张力，且表面张力降低程度随浓度的增加而
增加。这一试验模仿了糙皮侧耳菌体分泌疏水蛋白单
体至培养基中并在水-空气界面自组装成两亲性膜，
进而降低培养基表面张力下降并起始气生结构形成
的过程。另外不难发现，在浓度-表面张力曲线中存
在两个拐点：6µg/mL（C1）和约24µg/mL（C2）。浓
度小于C1的测试样品，溶液界面张力随浓度增加显著下降但仅能达到约45mN/m；浓度大
于C2的测试样品，界面张力均下降至相近水平，即25mN/m～28mN/m；浓度介于C1～C2
之间的测试样品，界面张力的下降幅度也较为显著且随浓度的增加液面张力能够下降至较
低水平（＜30mN/m）。这可能反映了不同浓度条件下Po.HYD1形成了不同的自组装膜。
Wang等（2004）测定了浓度4.5µg/mL为裂褶菌 Schizophyllum commune 疏水蛋白SC3
单体发生寡聚化并进而自组装的临界浓度；Lumsdon等（2005）证明瑞氏木霉 Trichoderma
reesei 产生的HFBⅡ疏水蛋白在2µg/mL的浓度下几乎不能引起任何水表面张力的下降，而
8µg/mL的HFBⅡ仅能够将水表面张力降低至约45mN/m。另一方面，Askolin等（2006）的
试验显示，20µg/mL的HFBⅡ和100µg/mL的SC3分别能够最大降低水液面张力至28mN/m和
27mN/m。基于上述试验证据我们可以推断：Po.HYD1单体分子受“吸附效应”控制向水-
空气界面定向迁移，其中（1）C1是Po.HYD1单体分子能够在水-空气界面相互聚合并进而
发生自组装过程的最低浓度；（2）C1～C2是Po.HYD1分子在水-空气界面自组装过程中采
取不同“排布方向”的浓度范围。在浓度由C1向C2不断提高的过程中，Po.HYD1分子可能
采取了多种排布方式来获得该浓度下的最低表面自由能；（3）当浓度大于C2时，水-空气
界面被取向一致且保持最低能量状态的疏水蛋白分子“饱和”，其界面张力仅在一个很小
4期 马爱民等：糙皮侧耳（平菇）疏水蛋白的分离纯化及其界面自组装特性研究 561
图2 Po.HYD1水溶液在浓度范围1～100μg/mL的平衡表面
张力值
Fig.2 Equilibrium surface tension values of Po.HYD1 solutions at
different concentrations ranging from 1 to 100µg/mL.
的 范 围 内 变 化 （ 25mN/m ～
28mN/m）。这种小范围的变化可能
与Ⅰ类疏水蛋白自组装膜的“多孔
性”及双分子吸附层的形成有关。
2.3 Po.HYD1聚合物材料表面的自
组装对其水接触角（WCA）的改变
Po.HYD1能够在疏水性-亲水性
界面自组装形成两亲性膜并在疏水
性材料表面暴露其亲水侧或在亲水
性材料表面暴露其疏水侧，并因此
逆 转 材 料 表 面 的 可 湿 润 性
（wettability）（图3）。
水接触角的改变表征着材料表
面可湿润性的变化。我们将WCA＞
90°定义为疏水性，而WCA＜90°定
义为亲水性。由表 1 可以看出，所
选用的聚合物材料经疏水蛋白包被后其可湿润性发生了逆转，即疏水性材料表面转变为亲
水性而亲水性材料表面转变为疏水性。














图 3 疏水性和亲水性材料表面可湿润性的逆转
A，B：疏水性材料表面变为亲水性；C，D：亲水性材料表面变为疏水性
Fig.3 Reverse of wettability on surfaces of hydrophobic and hydrophilic materials. A, B: Hydrophobic surface was turned
into hydrophilic surface; C, D: Hydrophilic surface was turned into hydrophobic surface.
562 菌 物 学 报 26卷
表 1 不同疏水性和亲水性材料的水接触角变化
Table 1 Water contact angle (WCA) variations of different hydrophobic and hydrophilic materials
材料
Materials
初始WCA
Initial WCA
Po.HYD1吸附后WCA
Po.HYD1-adsorbed WCA
WCA改变值
WCA variation
Teflon 110±3° 36±2° 69～79°
Parafilm “M” 105±2° 43±2° 58～66°
硅烷化玻璃
Siliconized glass
108° 40±5° 63～73°
尼龙
Nylon
51±4° 98±3° 40～54°
云母
Mica
31±3° 77±1° 42～50°
玻璃
Glass
39±2° 75±2° 40～32°

2.4 Po.HYD1组装体的超显微结构
分别利用云母和高定向热裂解石墨（HOPG）作为亲水性和疏水性支持物，通过原子
力显微镜（AFM）研究疏水蛋白 Po.HYD1在水-空气（静态和动态）界面和水-疏水性固体
界面自组装所形成膜或颗粒的超显微结构。
Po.HYD1在 HOPG表面主要形成厚度 3.2～3.8nm具有较高覆盖率的单分子吸附层，
在此吸附层的局部形成了双分子层。组成此单分子层的 Po.HYD1 分子呈“短杆型”，宽
度为 15～20nm，长度为 30～35nm；而双分子层分子（如图中所标记的）的体积明显大于
单分子层分子，这可能是由于双分子层具有较大的伸展空间造成的（图 4-A和 B）。Po.HYD1
在云母表面呈现为厚度 4.2±0.1nm的Ⅰ类疏水蛋白膜特征的“小杆层”结构，其覆盖率相
对于 HOPG表面形成的吸附层较低。组成“小杆层”的单个小杆宽度 8～12nm，长度 60～
80nm（图 4-C和 D）。两种自组装膜间形态的差别可能是由于不同极性的支持物呈现了疏
水蛋白自组装膜的两个极性相反的表面（疏水侧和亲水侧）造成的。也就是说，当膜形成
于疏水性固体时其亲水面暴露；而当膜形成于亲水性固体时其疏水面暴露。Po.HYD1溶液
在剧烈振荡产生的动态水-空气界面形成了不可溶性微粒。将此悬浊液干燥于云母片后形成
形状相似、取向一致但体积大小不等的“耳型”颗粒。这种颗粒同样属于水-空气界面的组
装体，但动态的界面使 Po.HYD1 分子不可能成膜而只能发生相互聚集进而形成巨大的组
装体颗粒（图 4-E和 F）。
3 讨论
Wessels（1997）根据疏水蛋白的溶解特性和水缘性图谱差别将它们分为两大类，即Ⅰ
类和Ⅱ类疏水蛋白，Ⅰ类疏水蛋白主要由担子菌和子囊菌产生，其组装体具有极高的不溶

4期 马爱民等：糙皮侧耳（平菇）疏水蛋白的分离纯化及其界面自组装特性研究 563
图4 不同条件下Po.HYD1所形成组装体的超显微结构
A，B：HOPG表面自组装膜（扫描面积，A：1µm × 1µm；B：600nm × 600nm）； C，D：云母表面自组装膜（扫描面
积，C：1µm × 1µm；D：600nm × 600nm）；E，F：组装体颗粒（扫描面积，E：2.14µm × 2.14µm；F：1.25µm × 1.25µm）
Fig.4 Ultrastructures of Po.HYD1 assemblages formed under different conditions. A, B: Assembled film formed on HOPG
surface (scanning area, A: 1µm × 1µm; B: 600nm × 600nm); C, D: Assembled film formed on mica surface (scanning area, C:
1µm × 1µm; D: 600nm × 600nm); E, F: Assembled particles (scanning area, E: 2.14µm × 2.14µm; F: 1.25µm × 1.25µm).

解性，可以抵抗 2%SDS溶液在 100℃下的抽提，而仅能够被 100%TFA通过破坏单体间短
程的疏水相互作用将其解离为可溶性单体，而Ⅱ类疏水蛋白则仅由子囊菌产生，其组装体
的稳定性相对较差，能够溶解于 60%乙醇和 2%SDS溶液（Linder et al., 2005）。根据疏水
蛋白组装体溶解特性和自组装膜疏水侧特有“小杆层”结构的呈现，糙皮侧耳 Pm039 菌
株所产疏水蛋白 Po.HYD1可确认为典型的Ⅰ类疏水蛋白。
表面张力测定显示了 Po.HYD1具有高度的表面活性，在 100µg/mL浓度下能够将水表
面张力降低至 25.5mN/m，因此推断 Po.HYD1执行着与 SC3疏水蛋白相似的生物学功能，
即降低水表面张力起始气生菌丝生长并形成刚性膜保护气生结构外表面。AFM 研究显示
Po.HYD1在疏水性支持物（HOPG）和亲水性支持物（云母）表面形成的自组装膜具有显
著差别，这种差别一方面可能是由于不同极性的支持物分别呈现了蛋白质膜的亲水面与疏
水面；另一方面可能是由于 Po.HYD1 分子在疏水性的 HOPG表面与亲水性的云母表面分
别处于不同的构象状态（Janssen et al., 2004）。WCA的测定表征了 Po.HYD1在聚合物材
料表面自组装后逆转了其原本的可湿润性。同时，Po.HYD1对于不同材料表面WCA的改
564 菌 物 学 报 26卷
变并不是完全相同的。这可能是由 Po.HYD1 与不同材料表面的亲和性差异以及试验材料
本身可湿润性及微观结构的差异所共同决定的。
Po.HYD1具有疏水蛋白显著的生物物理学特点，这将使其在组织工程与器官移植、药
物传递与剂型转换及食品加工等诸多领域中极具应用前景。

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