全 文 ：第 30卷 ,第 3期 光　谱　实　验　室 Vol . 3 0 , No . 3
2 0 1 3年 5月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory May , 2 0 1 3
高效液相色谱法分析车前草中的黄酮化合物
① 联系人 ,手机: ( 0) 13707391411; E-mail: limingjuan01@ 126. com; rongdonglii@ yahoo. com. cn
作者简介:李明娟 ( 1983— ) ,女 ,湖南省邵阳市人 ,讲师 ,硕士 ,研究方向为天然药物成分分析。
收稿日期: 2012-10-24;接受日期: 2012-10-28
李明娟a ,b　刘 磊b　傅春燕a　李荣东① b
a (邵阳医学高等专科学校　湖南省邵阳市宝庆西路 18号　 422000)
b(湖南中医药大学　湖南省长沙市含浦科教园区　 410208)
摘　要　建立检测车前草中总黄酮含量的高效液相色谱法 ,探索车前草黄酮苷的水解条件。通过水解
车前草黄酮提取物 ,将黄酮苷水解成苷元 ,再用 HPLC法测定水解后车前草黄酮苷元含量。 以 Shim-pack
VP-ODS( 150L× 4. 6, 10μm)为分析柱 , 流动相为甲醇 -0. 1%磷酸水溶液梯度洗脱 ,流速为 1. 0m L /min,检
测波长为 360nm ,柱温 30℃ ,采用峰面积外标法计算含量。 通过比较水解前、后黄酮苷元的检测量 ,发现水
解后检测到黄酮量高。 此法测得车前草中槲皮素的含量为 1. 36mg /g ,木犀草素的含量为 0. 35mg /g ,黄芩
素的含量为 0. 89mg /g , 3种苷元的含量之和为 2. 60mg /g。 首次以水解后的车前草总黄酮苷元作为车前草
黄酮含量的评价指标 ,首次建立了水解 -HPLC法检测车前草黄酮含量 ,为测定车前草及其提取物中黄酮类
化合物的含量提供了灵敏、准确和快速的测定方法 ,为不同品种和产地的车前草及其提取物质量监控提供
依据。
关键词　车前草 ;总黄酮 ;高效液相色谱法
中图分类号: O657. 7+ 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 1004-8138( 2013) 03-1437-07
1　引言
车前草系多年生草本植物车前科车前或平车前的全草 ,味甘寒无毒 ,药源丰富 ,价格低廉 ,毒副
作用小 ,是一味非常有前途的草药 [1 ]。其主要成分黄酮类有效成分具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗血栓、
抗肿瘤、抗过敏、降糖等多种生理活性 [2, 3 ]。 进一步的研究表明 ,车前草黄酮类各化合物在药理活性
上存在差异 [4 ]。因此 ,对车前草及其提取物中黄酮类化合物的研究 ,有助于质量控制 ,保证药效。目
前 ,一般采用比色法测定总黄酮含量来对药材、提取物及制剂中黄酮类化合物进行质量控制 [5 ] ,然
而 ,由于与黄酮类似结构化合物质的干扰 ,比色法测得的总黄酮含量往往偏高 ,结果不准确。研究表
明 ,车前草中的黄酮类成分主要包括木犀草素及其苷、槲皮素、黄芩素及其苷 ,车前子苷、高车前苷
等 [6 ]。由于车前草中的黄酮苷多是糖苷 ,而且研究表明 ,极大多数黄酮苷口服主要转变成相应的黄
酮苷元被吸收 ,口服黄酮苷类化合物的效应成分为其苷元 ,鉴于上述情况 ,本研究采用对车前草提
取物进行酸水解 ,然后以 HPLC法测定槲皮素、木犀草素、黄芩素的含量 ,计算总含量 ,首次建立了
以水解后的车前草总黄酮苷元作为车前草黄酮含量的评价指标 ,能准确检测车前草黄酮类化合物
含量的方法 ,从而达到对车前草或其提取物的黄酮含量进行质量控制的目的。
2　实验部分
2. 1　仪器和试药
SPD10A-vp型高效液相色谱仪 (日本岛津公司 ) ; UV -SPD型检测器 (日本岛津公司 ) ;
UV -2450型紫外分光光度计 (日本岛津公司 ) ; KQ3200B型超声波清洗器 (昆山市超声仪器公司 ) ;
RE-52A型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂 ) ; ZD-2型电位滴定仪 (上海虹益仪器仪表公司 ) ;甲
醇 (色谱纯 ,天津科密欧化学试剂公司 ) ,其他试剂为分析纯。 液相用水为怡宝纯净水。
2. 2　色谱条件
色谱柱:岛津 Shim-pack V P-ODS( 4. 6mm× 150mm , 5μm);流动相为甲醇 ( A )和 0. 1%磷酸水
溶液 (B )的混合溶液梯度洗脱 ,流速为 1. 0m L /min,洗脱条件为 0— 10min, A的浓度从 70%降至
50% ; 10— 20min, A的浓度从 50%升至 70% ;检测波长为 360nm ,柱温 30℃。进样量: 10μL。在此
色谱条件下 ,对照品及样品的色谱图如图 1、图 2所示。
图 1　对照品高效液相色谱图
图 2　样品高效液相色谱图
2. 3　溶液制备
2. 3. 1　对照品混合溶液的制备
准确称取经五氧化二磷干燥过夜的对照品槲皮素、木犀草素、黄芩素适量 ,分别加甲醇制成
30、 16、 17μg /mL的溶液 ,分别取此 3种溶液 0. 30, 0. 60, 1. 20, 2. 40, 4. 80mL置于同一 25 mL容量
瓶中 ,配制对照品混合溶液。
2. 3. 2　车前草黄酮类成分的提取和供试品溶液的制备
准确称取药材粉末约 2. 5g ,加 70%乙醇 50m L浸泡过夜 ,超声提取 2次 (用量为 50mL、
25mL) ,每次 1h,过滤 ,合并滤液用旋转蒸发仪减压浓缩成浸膏。加入近 50mL水溶解浸膏 ,并用石
油醚萃取 2次 ( 50, 25m L) ,合并两次水层溶液 ,转入 50mL容量瓶中 ,加水至刻度 ,摇匀 ,取此溶液
10mL,加入不同浓度的盐酸溶液 10mL,不同温度下恒温水浴水解不同时间后 ,迅速冷却 ,用乙酸
乙酯 (用量 20、 20、 10mL) ,萃取 3次 ,合并乙酸乙酯层减压浓缩成浸膏 ,用 70%甲醇溶解并稀释浸
膏定容至 50mL,再稀释 5倍 ,用微孔有机滤膜过滤后用于 HPLC分析 ,即为供试品溶液。
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3　结果与讨论
3. 1　线性关系考察
准确量取“ 2. 3. 1”项下不同浓度的对照品混合溶液各 10μL分别进样 ,以进样量 (μg /mL)与峰
面积积分值进行线性回归。 其结果如表 1。
表 1　黄酮苷元的线性回归和检出限
组分 回归方程 相关系数 线性范围
(μg /mL)
检出限
( mg /kg)
定量限
( mg /kg)
槲皮素　 y= 24966x - 2164. 9 0. 9997 0. 36— 5. 76 5. 0 16. 1
木犀草素 y= 61848x+ 14059 0. 9989 0. 192— 3. 07 3. 6 11. 8
黄芩素　 y= 68001x - 7837. 4 0. 9990 0. 204— 3. 26 1. 7 5. 7
3. 2　精密度试验
取对照品混合溶液 ,连续 3天进样 ,每日连续进样 5次 ,测定其日内精密度和日间精密度。计算
各待测峰的相对标准偏差 RSD,结果见表 2, RSD均小于 3. 0% ,说明仪器的精密度良好。
3. 3　稳定性实验
取样品溶液 20mL,分别在配制后 0, 2, 4, 6, 12, 24h进样 1次 ,计算各峰的相对标准偏差 RSD,
结果见表 2。 RSD均小于 3. 0% ,说明样品的稳定性良好。
3. 4　重复性实验
准确称取 5份车前草粉末各 2. 5g,均按样品处理方法处理 ,测定结果如表 2,总黄酮苷元的平
均含量为 2. 609mg /g, RSD为 1. 32%。 说明样品的重复性良好。
表 2　精密度、稳定性、重复性实验结果 (RSD% )
标准品
精密度 (% )
日内精密度 日间精密度 稳定性 (% ) 重复性 (% )
槲皮素　　 0. 68 2. 69 2. 65 1. 93
木犀草素　 0. 96 2. 13 1. 73 1. 15
黄芩素　　 0. 52 1. 95 1. 58 0. 89
总黄酮苷元 0. 72 2. 26 1. 97 1. 32
3. 5　加标回收率实验
准确称取车前草干燥粉末约 2. 5g各 6份 ,配置三种对照品溶液浓度为 0. 700、 0. 210、
0. 462mg /mL的混合溶液 50mL,按照回收率实验要求分别精密加入一定量对照品溶液于 5份样品
溶液中 ,按“样品溶液的制备”项下制备 ,分别测定其含量 ,计算加样回收率 ,具体数据见表 3。结果
表明 3种对照品的加样回收率都在 95%到 100%之间 ,说明加样回收率良好。
3. 6　水解条件的单因素实验
水解的目的是为了使车前草黄酮苷最大程度地水解成苷元 ,同时也要尽可能的保证黄酮苷元
稳定 ,不被氧化变质。 综合考虑 ,考察了以下 3项影响水解的因素。
3. 6. 1　盐酸浓度的影响
按供试品配制方法 ,分别用浓度为 2. 5, 3. 75, 5. 0, 7. 5, 10mol /L的盐酸 70℃水解 1h,制的供
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试品溶液 ,依法测定。 结果车前草中槲皮素、木犀草素、黄芩素的总含量如图 3,表明盐酸浓度为
5mol /L较为适宜。
表 3　加标回收率实验结果
标准品 样品
( g)
含量
( mg)
加入量
( mg)
测得量
( mg)
回收率
(% )
平均值
(% )
RSD
(% )
槲皮素 2. 5235 3. 4320 4. 060 7. 4229 98. 30 98. 16 1. 3568
2. 5556 3. 4756 4. 060 7. 4587 98. 10
2. 4895 3. 3857 3. 360 6. 7025 98. 71
2. 5215 3. 4292 3. 360 6. 7122 97. 70
2. 5013 3. 4018 2. 730 6. 1678 100. 13
2. 5651 3. 4885 2. 730 6. 1107 96. 05
木犀草素 2. 5235 0. 8832 1. 050 1. 8800 97. 25 98. 41 1. 0991
2. 5556 0. 8945 1. 050 1. 9462 100. 09
2. 4895 0. 8714 0. 630 1. 4882 99. 12
2. 5215 0. 8825 0. 630 1. 4921 98. 65
2. 5013 0. 8755 0. 420 1. 2667 97. 78
2. 5651 0. 8978 0. 420 1. 2856 97. 56
黄芩素 2. 5235 2. 2459 2. 310 4. 5614 100. 12 98. 15 2. 0357
2. 5556 2. 2745 2. 310 4. 5694 99. 67
2. 4895 2. 2157 1. 386 3. 6046 100. 08
2. 5215 2. 2441 1. 386 3. 5125 96. 76
2. 5013 2. 2261 0. 924 3. 0480 96. 01
2. 5651 2. 2829 0. 924 3. 0873 96. 27
总黄酮苷元 2. 5235 6. 5611 6. 860 13. 2521 98. 74 97. 78 1. 1699
2. 5556 6. 6446 6. 860 13. 4082 99. 29
2. 4895 6. 4728 4. 116 10. 3898 98. 12
2. 5215 6. 5558 4. 116 10. 3684 97. 36
2. 5013 6. 5034 2. 744 8. 9629 96. 92
2. 5651 6. 6692 2. 744 9. 06149 96. 26
3. 6. 2　水解温度的影响
在盐酸浓度为 5mol /L, 30, 45, 60, 75, 90℃条件下水解 1h,依法测定。结果车前草中槲皮素、木
犀草素、黄芩素的总含量如图 3,表明以水浴 75℃水解较适宜。
3. 6. 3　水解时间的影响
在 5mol /L盐酸溶液 , 75℃水浴条件下 ,水解 0. 5, 1, 1. 5, 2, 2. 5h,依法测定。结果车前草中槲皮
素、木犀草素、黄芩素的总含量如图 3,表明水解 1h较为适宜。
图 3　单因素实验结果图
3. 7　水解条件的正交实验
根据单因素实验结果 ,做盐酸浓度、水解温度和水解时间的 3因素 3水平正交实验。实验安排
如表 4。所得实验结果如表 5。
1440 光谱实验室 第 30卷
表 4　因素及水平 L9 ( 33 )
水平因素
A:盐酸浓度 (mol /L) B:温度 (℃ ) C:时间 ( h)
1 3. 75 60 1
2 5 75 1. 5
3 7. 25 90 2
表 5　正交实验及结果
序号 因素
A B C D
含量 ( mg /g )
1 1 1 1 1 1. 96
2 1 2 2 2 2. 19
3 1 3 3 3 2. 03
4 2 1 2 3 2. 15
5 2 2 3 1 2. 31
6 2 3 1 2 2. 17
7 3 1 3 2 1. 93
8 3 2 1 3 2. 05
9 3 3 2 1 2. 09
Ⅰ 2. 06 2. 01 2. 06 2. 12
Ⅱ 2. 21 2. 18 2. 14 2. 09
Ⅲ 2. 02 2. 09 2. 09 2. 08
R 0. 19 0. 17 0. 08 0. 04
表 6　正交实验结果分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F P
A 0. 0201 2 0. 0100 50 < 0. 05
B 0. 0145 2 0. 0072 36 < 0. 05
C 0. 0033 2 0. 0016 8 > 0. 05
D误差 0. 0003 2 0. 0002
　　对实验测得结果 (见表 5)进行直观分析和方差分析 (见表 6) ,车前草提取物总黄酮苷的酸水解
中 ,盐酸的浓度是最主要的影响因素 ( P < 0. 05) ,水解温度则略次之 ,水解时间对水解效果的影响
最小 ,酸水解的最优条件是 A2B2C2 ,即车前草提取物采用 5mol /L盐酸 75℃水解 1. 5h,黄酮苷元含
量最多 ,黄酮苷水解最充分。
3. 8　样品测定及结果
按“ 2. 2”项下方法制成供试品溶液 ,进样 10μL,外标法测定槲皮素的含量为 1. 36mg /g ,木犀草
素的含量为 0. 35mg /g ,黄芩素的含量为 0. 89mg /g, 3种苷元的含量之和为 2. 60mg /g ,色谱图
见图 4。
图 4　样品黄酮含量测定高效液相色谱图
1441第 3期 李明娟等:高效液相色谱法分析车前草中的黄酮化合物
3. 9　讨论
3. 9. 1　车前草总黄酮提取方法的选择
国内外研究车前草总黄酮提取工艺已较多 ,本课题选用了文献报道中的最优提取方案 [7, 8 ] ,能
最大限度地提取到黄酮类成分 ,也为车前草黄酮提取物及其饮片中黄酮类成分的检测提供了方法。
3. 9. 2　检测波长的选择
对槲皮素、木犀草素、黄芩素对照品溶液进行紫外光谱扫描 ,发现三者在 254nm、 360nm波长
处都有较大吸收 ,但在 254nm采集样品信息 ,发现出峰较多 ,目标峰与干扰峰不能完全分离 ,因此
选择 360nm为检测波长。
3. 9. 3　洗脱条件的选择
黄酮苷元含酚羟基 ,化合物显弱酸性 ,因此在流动相中需加入少量弱酸 ,否则会出现拖尾和峰
型增宽 ,分离效果不好的结果 ,流动相酸性太强会损坏色谱柱 ,综合考虑选用 0. 1%磷酸比较合适。
溶剂的选取曾尝试不同比例的甲醇 -0. 1%磷酸 ( 50: 50, 55: 45, 60: 40, 65: 35, 63: 37)等浓度洗脱 ,其
中黄芩素、木犀草素峰型较宽 ,理论塔板数不高 ,后改用梯度洗脱 ,经反复摸索 ,确定了上述的分析
条件。
4　结论
总之 ,目前对车前草总黄酮的含量测定仍仅限于采用紫外分光光度法 ,不能消除其他相似化合
物的干扰 ,使得检测结果偏高。 HPLC定量结果准确 ,但车前草黄酮苷类对照品获取不易 ,检测成本
高 ,仍未有研究报道采用 HPLC法检测车前草黄酮苷含量。 由于车前草中黄酮类化合物大多以糖
苷的形式存在 ,口服用药黄酮苷有效成分转变成相应苷元 ,因此 ,本实验采用酸水解黄酮苷 ,再检测
苷元含量的方法 ,即水解-HPLC法 ,此法测定车前草中总黄酮的含量显著优于紫外分光光度法 ,能
够更加准确地反映车前草中的黄酮含量。
参考文献
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1442 光谱实验室 第 30卷
Determination of Flavonoids in plantain by HPLC
LI Ming-Juana,b　 LIU Leib　 FU Chun-Yana　 LI Rong-Dongb
a (Shaoyang Med ical College, Shaoyang 4220000, P. R. China )
b( Hunan University of Chinese Med icine,Chang sha 41000, P. R. China )
Abstract　 To dtermine f lav onoid aglycones content in plantain, HPLC method was established .
Hydroly sis condition of f lavonoid g lycosides in plantain w as studied. Fi rst ext racted f lav onoids in
plantain, refined and acid hydrolysis, then the content of f lav onoid aglycones in plantain af ter
hydrolysis w as determined by RP-HPLC method. The separation was carried out on a Shim-pack V P-
ODS( 4. 6mm× 150mm , 5μm) column eluted wi th mobile phases of w ater containing methnol-0. 1%
phosphoric acid at the f low rate of 1. 0mL /min, the detectiv e w aveleng th was 360nm and column
temperature w as 30℃ . The results show ed that the content of flavonoids in plantain af ter hydroly sis is
highier than before hydrolysis, it s quercetin content is 1. 36mg /g, luteolin content is 0. 35mg /g and
baicalein content is 0. 89mg /g in plantain, three kinds of the f lav onoid aglycones content sum is
2. 60mg /g. Fo r the first time, hydrolysis-HPLC method for determina tion of the content of flowonoids
in plantian was established. It can be provided basis for quali ty control and applied for detectmation of
f lavonoids with di fferent v arieties and origin of the plantain.
Key words　 Plantain; Flavonoids; HPLC
作者联系人 (通讯作者 )不得是“挂名”的 ,其地址不得省略
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在上盖了个戳: 地址不详 ,退! 可见 ,虽然你单位大名鼎鼎 ,但还并不是邮局人人皆知。 “退”! 还是一个好运。
因为你遇上一个邮局负责任的人 ,他毕竟还要花费人力物力来“退”! 也好让人清楚“退”的缘故。 若碰上一个
不负责任的 ,将邮件丢进了垃圾箱。没有收到邮件 ,作者就质问编辑部 ,我们冤不冤?
有的作者联系人地址只写上他单位的大名 ,好像他在单位是大名鼎鼎、人人皆知的。这种邮件 ,单位的收
发室 ,也通常予以退回 ,甚至丢进垃圾箱或集中卖废纸。 所以 ,请作者联系人勿将你单位的详细地址 (县、区、
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提供的邮寄地址不详和提供的联系人是“挂名”的 ,因此而造成的损失 ,由提供者自己承担。
《光谱实验室》编辑部
1443第 3期 李明娟等:高效液相色谱法分析车前草中的黄酮化合物