全 文 ：收稿日期:2009-11-10基金项目:中共高校基本科研业务费专项基金资助作者简介:刘霞(1973-),女 ,高级工程师 ,博士 ,主要从事中药的品种 、质量及资源开发研究;Tel:027-87859019, E-mail:lrx1125@ 126.com。＊通讯作者:陈科力 , E-mail:kelichen@ 126.com。
湖北麦冬及其近缘种的 ISSR多样性研究
刘 霞1 ,刘 震 2 ,杨 旻 2 ,陈科力2＊
(1.武汉理工大学化学工程学院 ,湖北 武汉 430079;2.湖北中医药大学药学院省部共建中药资源和中药
复方教育部重点实验室 ,湖北 武汉 430065 )
摘要 目的:对形态上难以区分的湖北麦冬及其近缘植物 , 利用 ISSR分子标记技术进行多样性研究 , 并探索
其亲缘关系。方法:设计 5因素 4水平正交实验 ,进行 PCR反应体系的优化;从 ISSR引物序列表中随机选取 80个
引物 , 对所有样品进行 PCR扩增 ,筛选实验有效引物;用优选的条件对样品进行 ISSR分子标记 , 计算样品间的相似
系数 , 构建聚类分析树系图。结果:建立了麦冬类植物优化的 PCR扩增程序 ,筛选出了 9个有效引物 , 得到了各样
品的 ISSR电泳谱和系统发育树系图 , 谱和图清楚反映出了各品种之间的区别及其亲缘关系。结论:本文建立的 IS-
SR分子标记技术可用于湖北麦冬及其近缘种的多样性及亲缘关系研究。
关键词 湖北麦冬;麦冬;ISSR;多样性研究
中图分类号:R282.5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)07-1052-04
StudyonDiversityofLiriopespicatavar.proliferaandIts
AffinisSpecieswithISSRMethod
LIUXia1 , LIUZheng2 , YANGMin2 , CHENKe-li2
(1.SchoolofChemicalEngineering, WuhanUniversityofTechology, Wuhan430079, China;2.KeyLaboratoryofTraditionalChinese
MedicineResourceandCompoundPrescription, MinistryofEducation;PharmacyDepartment, HubeiUniversityofChineseMedicine,
Wuhan430065, China)
Abstract Objective:TostudytheidentificationofLiriopespicatavar.proliferaanditsafinisspecies, whicharedifficulttobe
differentiatedwithroutinemethod, basedonISSRmolecularmarkertechnologyandexploretheirrelationship.Method:Accordingto
thepre-experiment, todesignorthogonalexperimentoffourlevelsandfivefactorstooptimizethePCRreactionsystem.Toselectran-
domly80 primersfromISSRprimerssequencetableandthenscreenefectiveprimersfromtheexperimenttroughPCRamplifyingofall
samples.MarkthesampleswithoptimalISSRconditions, andcalculatethesimilaritycoeficientbetweensamples, thenbuildthephy-
logenetictreeofthesesamples.Result:ThestudyestablishedabeterISSRreactionsystemandthePCRamplificationprocedurefor
Liriopespicatavar.proliferaanditsafinisspecies, screenedout9 efectiveprimersandachievedISSRelectrophoreticspectrumand
phylogenetictreeof15samples.Conclusion:TheestablishedISSRmolecularmarkertechniquescanbeusedfortheresearchesofiden-
tificationandgeneticrelationshipforsomeLiriopeandOphiopogonspecies.
Keywords Liriopespicata(Thunb.)Lour.var.proliferaY.T.Ma;Ophiopogonjaponicus(Thunb.)Ker-Gawl.;ISSR;Genetic
diversity
湖北 麦冬 Liriopespicata(Thunb.) Lour.
var.proliferaY.T.Ma.是湖北种植面积较大的药用
植物之一 ,其块根是中药山麦冬的主要来源 ,具有养
阴生津 、润肺清心的功效 ,临床应用极为广泛。湖北
麦冬与山麦冬属短葶山麦冬 、阔叶麦冬和沿阶草属
麦冬 、沿阶草等近缘植物在形态上较为相似 ,不开花
时很难准确鉴别 ,这给麦冬类植物野生资源的寻找 、
品种鉴定和优良品种选育带来了一定困难。 DNA
分子标记技术的出现成为植物品种选育和鉴别的有
效手段 ,简单序列重复区间扩增多态性分子标记技
术 ISSR具有操作简单 、多态性丰富 、重复性好的特
点〔1-4〕 ,目前对麦冬类植物涉及分子标记技术的研究
已有川麦冬种内直立型及匍匐型的 ISSR分子鉴
定〔5〕 ,以及麦冬类植物的 RAPD分析〔6〕 ,对麦冬类
植物品种间的 ISSR多样性研究尚未见报道。由于
RAPD方法所得到的谱图重现性不高 ,因此 ,本文对
湖北麦冬及其近缘种运用 ISSR分子标记技术进行
多样性研究 ,并探索其亲缘关系 ,以期对麦冬类植物
的品种鉴别和良种繁育提供新的分子生物学依据 。
1 仪器与试药
1.1 实验材料 实验用样品共计 15份 ,其中湖北
麦冬 1 ～ 3号分别采自湖北襄樊(2份 ,栽培)及武汉
·1052· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 7期 2010年 7月
(1份 , 栽培);麦冬 Ophiopogonjaponicus(Thunb.)
Ker-Gawl.13 ～ 15号分别采自湖北神农架(2份 ,野
生)及武汉(1份 ,栽培);短葶山麦冬 Liriopemuscari
(Dence.)Baily11 ～ 12号 , 分别采自福建泉州 (栽
培)、仙游(野生)与湖北武汉(栽培);阔叶麦冬 Liri-
opepalatyphylaWangetTang.4 ～ 7号 4份 ,分别采
自湖北武汉 (栽培 )、罗田 (野生)、江苏南京(栽
培)、江西庐山(野生);以上样品的原植物分别经湖
北中医药大学汪乐源教授或陈科力教授鉴定。另有
样品 8 ～ 10号 3份 ,分别采自湖北中医药大学校园 、
江西庐山和湖北武汉植物园 ,其叶片均较窄 ,因未能
采到花 ,故均未能鉴定到种 ,其品种待定。
各样品分别取植物幼嫩叶片 ,硅胶干燥 ,剪成 2
～ 3mm的细条 ,液氮研磨成粉末 ,装入灭菌 1.5 mL
离心管 , -20℃保存备用 。
1.2 仪器与试药 PCR仪(德国 BIO-RADPTC-
200);CF15RX高速冷冻离心机(日本日立);WD-
9413A凝胶成像分析仪 、DYY-8C型电泳仪 、DYC-
33A型电泳槽(北京六一仪器厂);微量移液器(10、
200、1000 μL,德国 TripeteBRAND01D6477);0.2
mLPCR薄壁管(美国 Axygen);Tris、EDTA(上海生
工生物工程公司);Taq酶(天根生化科技(北京)有
限公司);dNTPs(TOYOBO东洋纺(上海)生物科技
有限公司);100bpDNALadder、引物 、SybralGreenI
(捷瑞生物工程(上海)有限公司);索莱宝植物基因
组 DNA提取试剂盒(生化科技(北京)有限公司);
溴酚蓝(上海生工生物工程公司)。
2 实验方法与结果
2.1 基因组 DNA的提取及检测 选择索莱宝植
物基因组 DNA提取试剂盒提取样品总 DNA,紫外
检测其浓度为 100 ～ 200 ng/μL。 DNA提取物置于
-20 ℃低温保存备用 。
2.2 PCR反应体系的优化 根据预试验 ,设计 5
因素 4水平正交试验 ,见表 1,用 L16 (45)正交表 。
取个别样品的总 DNA按正交设计进行扩增 ,重复实
验 3次 ,各次实验扩增后的总 DNA电泳后按条带清
晰程度及条带数量分为 5等 ,统计各因素各水平 3
次试验所得平均分 ,得分最高的水平为该因素的最
佳水平 〔7〕。
电泳结果见图 1,在 16个组合中 ,由于 dNTPs、
Taq酶 、Mg2 +、引物 、模板的浓度不同 ,扩增效果存在
着明显的差异 ,其中第 3、5、6、7、11、14、16号组合扩
增出的条带不仅清晰而且多态性高。根据扩增条带
的多态性和条带亮度计分 , 3号组合得分最高 ,因此
确定为本实验较佳的扩增体系 ,即该反应体系含有
10×PCRbufer2.0 μL, MgCl2(25 mmol/L)1.6μL,
dNTPmix(10 mmol/L)0.5 μL, TaqDNApolymerase
(2.5 U/μL)1.2 μL, 引物(10 pmol/μL)0.8 μL,
DNA模板(20 ng/μL)3.0 μL,加入补足 ddH2O使
反应体积达到 20 μL。扩增程序:94 ℃预变性 5
min;94 ℃变性 1 min, 52 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸
1.5 min,共 40个循环;最后 72 ℃延伸 10 min。以
ddH2O为空白对照 ,进行扩增 。 PCR扩增产物用
1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离 ,在凝胶扫描仪下观察
并拍照。
表 1 PCR反应体系优化正交设计因素与水平设置
水平 dNTPs/mM Taq酶/U Mg2+/mM 引物/μM 模板/μL
1 0.5 1.0 1.4 0.6 1
2 0.5 1.1 1.5 0.7 2
3 0.5 1.2 1.6 0.8 3
4 0.5 1.3 1.7 0.9 4
5 0.6 1.0 1.5 0.8 4
6 0.6 1.1 1.4 0.9 3
7 0.6 1.2 1.7 0.6 2
8 0.6 1.3 1.6 0.7 1
9 0.7 1.0 1.6 0.9 2
10 0.7 1.1 1.7 0.8 1
11 0.7 1.2 1.4 0.7 4
12 0.7 1.3 1.5 0.6 3
13 0.8 1.0 1.7 0.7 3
14 0.8 1.1 1.6 0.6 4
15 0.8 1.2 1.5 0.9 1
16 0.8 1.3 1.4 0.8 2
图 1 PCR反应体系正交优化电泳结果
2.3 引物筛选 从加拿大 BritishColumbia大学提
供的 ISSR引物序列表中随机选取 80条引物 ,按照
“2.2”项下优化确定的反应体系 ,对所有样品进行
PCR扩增。选取对各样品均能稳定扩增出三条以
上电泳条带的引物作为实验有效引物。通过对 80
条引物进行多次反复筛选 ,得到可有效扩增的引物
9条 ,引物序列见表 2。
2.4 ISSR-PCR及电泳检测成像 对所有样品的
PCR扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶分离检测。取 7
μL扩增产物与 1 μL溴酚蓝及 1 μLSybralGreenI
混合点样 。用 1×TAE电泳缓冲液电泳 ,电压 5V/
cm, 50 min后在凝胶成像分析系统下检测提取效果
·1053·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 7期 2010年 7月
并拍照 。见图 2、3。
表 2 扩增引物序列表
编号 碱基序列
808 AGAGAGAGAGAGAGAGC
817 CACACACACACACACAA
818 CACACACACACACACAG
820 GTGTGTGTGTGTGTGTC
824 CACACACACACACACARG
827 ACACACACACACACACG
836 AGAGAGAGAGAGAGAGYA
843 CTCTCTCTCTCTCTCTRA
857 ACACACACACACACACYG
注:R为 A或 G, Y为 C或 T
图 2 引物 818扩增的电泳结果
图 3 引物 824扩增的电泳结果
图 4 不同产地及不同品种麦冬样品
的 ISSR聚类分析树状图
2.5 数据分析和系统发生树的构建 对 9个有效
引物扩增的电泳结果统计各样品的电泳条带 ,按相
同迁移位置上有扩增条带(不论强弱)计为 1,无带
计为 0 ,得到全部样品的 ISSR图谱二态数据矩阵 ,
用 SPSS软件计算个体间的杰卡德(Jaccard)相似系
数 ,用 UPGMA法进行聚类分析 ,构建树系分支图 ,
见图 4。
3 讨论
3.1 ISSR是一个反应稳定 、重现性较好的分子标
记技术 ,但确定各类样品的最佳扩增程序 ,筛选有效
引物的工作量非常之大 。本实验设计了 5因素 4水
平正交试验 ,建立了反应稳定 、条带清晰 、多态性较
高的 PCR扩增程序 ,并选取了 9个有效的引物用于
湖北麦冬及其近缘种的 ISSR分析 ,这为 ISSR标记
技术用于麦冬类药材的鉴别和系统发育研究提供了
可直接选用的方法 。
3.2 从实验 15个样品的 ISSR电泳谱和树系图可
见 ,每种植物的 ISSR谱具有一定稳定性和独特性 ,
依据 ISSR谱的比对和聚类分析 ,可以明确将这些在
形态上难以鉴别的麦冬类植物区别开。湖北麦冬 、
短葶山麦冬 、阔叶麦冬和麦冬除了各自聚为一类外 ,
有一些引物的 ISSR谱呈现一致性 ,因此容易鉴别各
个物种。 3个待鉴定样品中 8号样品与湖北麦冬聚
为一类 ,同时除了引物 857以外 ,其它 8个引物的电
泳图谱都是与湖北麦冬完全一致的 ,因此 ,可以确定
它为湖北麦冬 。 10号样品除了与麦冬聚为一类外 ,
它与 13号麦冬样品的 808、820、827、843引物的电
泳图谱是完全一致的 ,因此可以确定 10号样品为麦
冬。 9号样品与麦冬类样品聚为一个大类 ,与山麦
冬属植物分开遗传距离也较远;但它与麦冬类样品
的遗传距离也较远(大于 15接近 20%),因此 ,它应
当属于沿阶草属的另一种植物 Ophiopogonsp.。一
些因产地和生长方式(栽培 、野生)不同的样品 ,如
阔叶麦冬 、麦冬等 ,其较多引物的 ISSR谱具有较大
差异 ,但也总有一些引物的 ISSR谱呈现一致性 ,因
此 ,他们仍然聚为一类。正是某些引物的 ISSR谱的
不一致性 ,为种下的变异提供了分子的证据。因此
还可以利用该方法对湖北麦冬种下的优良栽培品种
及各种种质资源进一步进行研究 。
3.3 由本实验可见 ,麦冬类植物样品的 ISSR电泳
谱和树系图 ,可为其系统发育提供分子依据。如引
物 818扩增到的 4个条带为所有样品共有 ,说明这
些麦冬类植物亲缘关系都比较接近;树系图显示 1、
2、3、8号湖北麦冬 , 10、13、14、15号麦冬 , 4、5、6、7
号阔叶麦冬 , 11、12号短葶山麦冬 、9号沿阶草各聚
·1054· JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 7期 2010年 7月
为一类 ,且湖北麦冬和短葶山麦冬聚为最为接近的
两个类群 ,其遗传距离也最近 ,说明它们均作为山麦
冬的原植物是有一定依据的;湖北麦冬和山麦冬又
与阔叶麦冬类群一起又麦冬类群相分开 ,这与传统
分类及与品种鉴定结果完全相符。
参 考 文 献
[ 1] 李海生 .ISSR分子标记技术及其在植物遗传多样性分
析中的应用 [ J] .生物学通报 , 2004, 39(2):19-21.
[ 2] 孙洪 ,程静 , 詹克慧 , 等 .ISSR标记技术及其在作物遗
传育种中的应用 [ J] .分子植物育种 , 2005, 3(1):123-
127.
[ 3] 周延清 .DNA分子标记技术在植物研究中的应用
[ M] .北京:化学工业出版社 , 2005:146.
[ 4] AmmirajuJSS, DholakiaBB, SantraDK, etal.Identifi-
cationofintersimplesequencerepeat(ISSR)markersasso-
ciatedwithseedsizeinwheat[ J] .TheorApplGenet,
2001, 102(5):726-723.
[ 5] 叶桂英 , 杨美全 ,梁国鲁 , 等.两种常用麦冬栽培品种的
ISSR分子鉴定 [ J] .亚太传统医药 , 2007, 3(11):84-86.
[ 6] 陈家春 , 左毅 ,黄璐琦 , 等.湖北麦冬及其近亲缘药用植
物的随机扩增引物 DNA分析 [ J] .医药导报 , 2007, 26
(7):738-741.
[ 7] 余艳 , 陈海山 , 葛学军 , 等 .简单重复序列间区(ISSR)
引物反应条件优化与筛选 [ J] .热带亚热带植物学报 ,
2003, 11(1):15-19.
半夏种内不同居群间半夏蛋白含量的比较
蔡 鹏 1, 2 , 彭正松 2＊ ,曾小群 2 ,靳忠英2 ,万洪深 2 ,李 欣 2
(1.四川农业大学农学院 ,四川 雅安 625014;2.西华师范大学生命科学学院 ,四川 南充 637002)
摘要 目的:测定不同原产地半夏块茎中半夏凝集素(PTA)的含量。方法:采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对 38
个半夏居群块茎中的 PTA进行分离 ,并用凝胶成像系统定量分析 PTA的含量。结果:不同居群间 PTA含量差异较
大 , 每克干燥块茎中的 PTA含量介于 0.0249 ～ 0.0662 g之间。 PTA含量大于 0.05 g的高含量居群占 50%;低于
0.03 g的低含量居群占 5%;介于 0.03g和 0.05g之间的中等含量居群占 45%。秦岭淮河一带的居群PTA含量普
遍很高 , 四川省的高含量半夏居群较少 ,且仅有的四个高含量居群全分布在沱江沿岸地区。结论:PTA的含量受基
因型控制 , 与半夏居群原产地有关。
关键词 半夏;居群;凝集素;含量;块茎
中图分类号:R284.1 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2010)07-1055-04
收稿日期:2009-12-07基金项目:四川省杰出青年基金后续项目(05ZQ026-041)作者简介:蔡鹏(1981-),女 ,在读博士研究生 ,主要从事植物遗传学研究;Tel:028-85232103, E-mail:cp215@163.com。＊通讯作者:彭正松 , Tel:0817-2568011, E-mail:pzs8833@ 163.com。
半夏 [ Pineliaternata(Thunb.)Breit.]为天南
星科半夏属多年生草本植物 ,以块茎入药 ,是大宗中
药材 ,迄今已有 2000多年的药用历史 。其药理作用
有降逆止呕 、燥湿化痰和消痞散结等 〔1〕;外用可治
疗急性乳腺炎 、急慢性化脓中耳炎等。近年来发现
半夏还具有抗早孕 、抗肿瘤 、降血脂 、护肝和治疗冠
心病等多种重要作用。半夏含半夏凝集素(Pinelia
TernateAgglutinin, PTA)、生物碱 、β-谷甾醇 、琥珀酸
和鸟苷等多种有效成分。药效成分含量的高低是评
价中药材品质高低的重要指标 ,半夏生物碱 、β-谷甾
醇 〔2〕 、鸟苷〔3〕等物质的含量曾被用于评估不同产地
半夏的品质差异 。 PTA是半夏抗早孕 、抗肿瘤 〔4〕等
药理作用的主要有效成分 ,但不同居群间 PTA含量
是否存在差异 ,笔者未见国内外文献报道 。本研究
通过对来自不同省份的半夏块茎进行 PTA含量测
定 ,分析不同居群间 PTA含量差异 ,以期为半夏的
品质研究提供新的依据 。
1 材料和方法
1.1 实验材料 采自 14省区的 38个居群的半夏
块茎 ,经成株鉴定为天南星科植物三叶半夏 Pinelia
ternata(Thunb.)Breit.,并种植于四川省南充市西
华师范大学试验田 ,供试材料居群编号和产地见表
1。
1.2 仪器与试剂 LDZX-40SⅡ型立式自动电热
压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂), YHW-
1103AT远红外恒温干燥箱(天津华北实验仪器有限
公司), BS224S电子天平 (北京赛多利斯仪器系统
有限公司), 60目标准检验筛(浙江上虞市探矿仪
·1055·JournalofChineseMedicinalMaterials 第 33卷第 7期 2010年 7月