全 文 ：Journal of Kunming Medical University
CN 53 -1049/ R
昆明医科大学学报 2012，（8）：1～ 5
老鹳草素对破骨细胞体外骨吸收功能的影响
张小超 １），何 波 １），陈 鹏 １），陆义芹 １），董泽军 ２），刘吉开 ２），沈志强 １）
（1） 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明 650500；2） 中国科学院昆明植
物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室，云南昆明 650204）
［摘要］目的 观察老鹳草素（geraniin，Ge） 对体外培养破骨细胞（OC） 的形成及其骨吸收功能的影响．方
法 由1日龄SD大鼠四肢长骨分离OC，和象牙骨片共同培养，或直接接种于培养板中，分别采用抗酒石酸酸
性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase，TRAP） 和甲苯胺蓝染色技术观察不同浓度的Ge对体外培养OC形
成及OC性骨吸收功能的影响．结果 Ge呈浓度依赖性减少体外培养的TRAP染色阳性多核细胞即成熟破骨细胞
（matureosteoclast，mOC） 数目；与空白对照组比较，Ge各浓度组均使OC性骨吸收陷窝个数和面积减少、灰度
变浅．结论 Ge减少体外培养OC的形成并抑制体外培养OC的骨吸收功能．
［关键词］老鹳草素；骨质疏松；破骨细胞；骨吸收
［中图分类号］R973［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2012） 08－0001－05
EffectsofGeraniinonOsteoclasticBone-resorptionActivity
ZHANGXiao－chao１），HEB１），CHENPeng１），LUYi－qin１），DONGZe－jun２），LIUJi－kai２），SHEN
Zhi－qiang１）
（1）School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products，
Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650500；２）Kunming Institute of Botany，The Chinese
Academy of Sciences，Kunming Yunnan 650204，China）
［Abstract］ObjectiveToevaluatetheeffectsofgeraniin（Ge） onthegenerationofosteoclasts（OCs） and
itsbone-resorptionactivityinvitro．MethodsOCsisolatedmechanicallyfromlongbonesofSDratsagedone-day
were plated in 48-well plates directly or on ivory bone slices in 24-well plates for culture together with different
concentrationsofGe．TRAPstainingandtoluidinebluestainingwereusedtoevaluatethegenerationofOCandbone
resorptiononivoryslices．ResultsGedecreasedthetotalnumbersofmultinucleatedTRAP-positiveosteoclastsin
cultures. Gedecreasedthenumberofresorptionpitsonslices，totalareasofresorptionpitson slicesaswell asthe
average luminance of pits．Co lusionGe can inhibit the generation of OCs and the bone-resorption activity of
osteoclastsinvitro.
［Keywords］Geraniin；Osteoporosis；Osteoclasts；Boneresorption
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30660212）；云南省自然科学基金资助项目（2004C0044M）；云南省社会发展
计划基础研究专项基金资助项目（2008CC009）
［作者简介］张小超（1982～），女，黑龙江哈尔滨市人，硕士，助理实验师，主要从事药理学研究工作．
［通讯作者］沈志强．E-mail：shzhq21cn@yahoo.com.cn
破骨细胞 （osteoclast，OC） 的分化或其功能
改变所导致的骨改建失衡是骨质疏松的重要病理
基础．破骨细胞骨吸收功能活跃是其发生的病理
生理之一，对破骨细胞骨吸收功能的抑制是防治
骨质疏松症的主要药理基础．破骨细胞的主要生
理功能是骨组织吸收，在骨吸收与骨重建中起启
动作用[1]．
老鹳草素 （geraniin，Ge） 化学结构式见图1.
提取分离自滇产叶下珠（Phyllanthusurinaria） 植物
全草中，纯度99%，属多酚类化合物．本课题组
第33卷2 昆明医科大学学报
前期研究表明Ge具有明显的抗维甲酸致大鼠骨质
疏松作用[2]．本研究着重探讨Ge对OC的形成及其
骨吸收功能的影响，从细胞水平评价老鹳草素的
抗骨质疏松作用的细胞学机制．
图1 老鹳草素的化学结构式
Fig.1Thechemicalstructureofgeraniin
于75%乙醇中1min，脱颈处死后分离四肢长骨，
按文献方法分离培养OC[3，4]．培养3～5h后换液，
换以按照分组分别加入了相应浓度药物的完全培
养液．设加入含药完全培养液的时间为0h．
1.4.2Ge对体外培养 OC生存率的影响 分组：
空白组，Ge10-8mol/L组、10-9mol/L组、10-10mol/L
组和10-11mol/L组，乙酰唑胺10-6mol/L组；每组4
孔．
OC 在 48 孔培养板中常规培养 3 d，隔天换
液．按说明书配制 TRAP 染液，置于水浴箱中
37℃预热．2.5%戊二醛固定OC10min，去离子水
冲洗；加入预热的TRAP染液，37℃水浴箱中染
色1h；自来水冲洗后，光学显微镜下观察TRAP
阳性细胞．
显微镜下胞浆中有紫红色不溶性颗粒反应且胞
核阴性的细胞为TRAP阳性细胞，若细胞核数≥3
个，则认为是成熟破骨细胞 （mature osteoclast，
mOC），TRAP阳性但细胞核数<3个，则认为是破
骨细胞前体（pre-osteoclast，pOC）[5]．
显微镜200倍分辨率下计数每孔中所有TRAP
阳性多核破骨细胞（即mOC） 和pOC．mOC占该
孔所有TRAP阳性细胞的百分比为该孔的OC融合
指数．
1.4.3Ge对体外培养 OC骨吸收功能的影响 分
组：空白对照组，Ge10-7mol/L组和10-9mol/L组，
Az10-6mol/L组；每组4孔，每孔1张骨片，每张
骨片直径1.5cm，厚度50μm．
Ge各浓度组和Az组的含药完全培养液中二甲
基亚砜的终浓度低于0.01‰，PBS缓冲液的终浓
度低于0.1‰．空白对照组加入完全培养液．
骨片用超声波清洗器在冰蒸馏水中清洗3min，
共3次；骨片每面各用紫外灯照射消毒4h；使用
前用无血清培养液浸泡于24孔培养板中，至接种
细胞悬液前吸出培养液．
OC接种于象牙骨片上，常规条件下与骨片共
同培养，隔天换液．分别在培养至3d和9d时每
组固定染色2个孔的骨片：骨片经戊二醛固定、清
洗、系列酒精脱水后，以1%甲苯胺蓝染色，用光
学显微镜下观计数OC在骨片上形成的吸收陷窝，
图文分析系统计算陷窝面积和每个陷窝的平均灰
度．
1.5统计学处理
用SPSS版统计软件处理所得数据．选用单因
素方差分析 （One-way ANOVA） LSD 方法统计，
结果均以均数±标准差（x±s） 表示．
1 材料与方法
1.1药品和试剂
Ge由中国科学院昆明植物研究所植物化学与
西部植物资源持续利用国家重点实验室刘吉开教授
提供；乙酰唑胺（acetazolamide，Az） 由上海信谊
制药厂提供；MediumM 199，GIBCO 公司产品；
胎牛血清 （fetalbovineserum，FBS），杭州四季青
生物制品有限公司产品；象牙骨片，由上海复旦大
学医学院放射医学研究所金慰芳教授馈赠；甲苯胺
蓝，Chroma公司产品，上海化学试剂公司进口分
装，抗酒石酸酸性磷酸酶 （tartrate-resistant acid
phosphatase，TRAP） 试剂盒，Sigma公司产品．
1.2动物
1日龄SD大鼠，昆明医科大学实验动物中心
（合格证号SCXK（滇） 2005-008） 提供．
1.3主要仪器
BH-2型光学显微镜和1×71-12FL/PH型倒置
相差显微镜，日本 Olympus；病理多头显微镜，
DM4000B型徕卡高级显微摄影系统，德国LEICA；
SB3200 型超声波清洗器，Shanghai Branson 公司；
HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，同
济大学千屏影像工程公司．
1.4方法
1.4.1OC的制备与培养 1日龄SD大鼠，浸泡
相应时间点空白对照组的陷窝计数少 （P＜
0.05）．Az组的陷窝比同一时间点 Ge组的陷窝少
（P＜0.05）．虽然3d时，Ge10-7mol/L组的陷窝均
数比10-9mol/L组小，但该差异没有统计学意义；
而9d时，10-9mol/L组的陷窝比10-7mol/L组明显
增多（P＜0.01）．除空白对照组外，其它3个组的
陷窝计数在3d和9d两个时间点之间无明显差异
（P＞0.05），见表4．
2.2.2骨片陷窝面积 与OC同骨片共培养3d比
较，共培养 9 d 后，空白对照组、Ge 组和 Az 组
9d时的陷窝面积明显增大，但药物对陷窝面积的
抑制率也增加．3d和9d时间点的Ge和Az骨片
陷窝面积都明显小于同一时间点的空白对照组
（P＜0.05）．3d时，3个加药组之间的陷窝面积无
统计学意义．9d时，Ge10-9mol/L组的陷窝面积
比10-7mol/L大，面积比值较高，抑制率较低，见
表5、6.
2.2.3骨片陷窝平均灰度 空白对照组3d和9d
时间点的灰度值相近（P＞0.05）．Ge和Az组的陷
窝平均灰度均低于同一时间点的空白对照组（P＜
0.05）．Ge 10-9mol/L 组 9 d 的平均灰度比 3 d 的
低．同一时间点内3个加药组之间的陷窝平均灰
度无统计学差异（P＞0.05）．与 3 d 比较，9 d 时
Ge10-7mol/L和 Az10-6mol/L组的灰度值的差异无
统计学意义（P＞0.05），见表7．
张小超，等．老鹳草素对破骨细胞体外骨吸收功能的影响 3第 8期
2 结果
2.1Ge对体外培养OC生存率的影响
2.1.1mOC计数 TRAP染色后见OC形态各异，
核数不等，大小不一，胞浆深染为紫红色，而胞
核阴性．mOC计数结果表明，Ge10－8mol/L和10－9
mol/L组及乙酰唑胺组的mOC数均比空白对照组
少（P＜0.01）．Ge各浓度组的mOC个数都高于乙
酰唑胺组（P＜0.05），见表1．
2.1.2pOC计数 与空白组pOC计数相比，在10
－8mol/L 到 10－11mol/L范围内，随 Ge 浓度的下降
pOC有增加的趋势，但仅10－8mol/L组与空白组比
较差异有统计学意义 （P＜0.01）．乙酰唑胺组的
pOC数最低（P＜0.01），见表2．
组 别 药物浓度（mol/L） mOC数（个） 抑制率（%）
空白组 - 21.50±3.51 -
Ge组 10-8 13.50±2.52**▲ 37.21
10-9 15.25± .75**▲▲ 29.07
10-10 19.00±1.83▲▲ 11.63
10-11 20.00±2.58▲▲ 6.98
Az组 10-6 9.25±0.96** 56.98
表1 老鹳草素对体外培养成熟破骨细胞形成的影响（TRAP染色） ［n=4，（x±s）］
Tab.1Effectsofgeraniinontheformationofmatureosteoclastsinvitro［n=4，（x±s）］
与空白组比较，**P＜0.01；与Az组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01.
组 别 药物浓度（mol/L） pOC数（个）
空白组 - 344.75±49.07
Ge组 10-8 276.00±2 .87**△△
10-9 308.75±19.92△△
10-10 335.00±3 .84△△
10-11 350.00±3 .14△△
Az组 10-6 202.00±16.57**
表2 老鹳草素对体外培养破骨细胞前体形成影响（TRAP
染色） ［n=4，（x±s）］
Tab.2 Effects of geraniin on the formation of
pre-osteoclastsinvitro［n=4，（x±s）］
与空白组比较，**P＜0.01；与Az比较，△△P＜0.01.
2.1.3融合指数 与空白对照组比较，Ge10－8mol/L
和 10-9mol/L 组的融合指数降低 （P＜ 0.05），Ge
10-10mol/L和10-11mol/L组的融合指数高于乙酰唑
胺组（P＜0.05），而与空白对照组之间的差异无统
计学意义（P＞0.05）．Ge10-11mol/L~10-8mol/L各
组的融合指数虽然有依浓度的上升而下降的趋势，
但各组之间的差异都没有统计学意义．Az组的融
合指数低于空白对照组（P＜0.01），见表3．
2.2Ge对体外培养OC骨吸收作用的影响
2.2.1骨片陷窝计数 培养3d，骨片上的陷窝形
态多样，边缘清晰，多为单个圆形或椭圆形等，有
少数陷窝融合呈不规则形，有时成串出现．培养9
d时，空白对照组的陷窝比3d时的陷窝多，且较
大，融合多．3d和 9d的加药组陷窝计数明显比
与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与Az组比较，▲P＜0.05.
组 别 药物浓度（mo/L） 融合指数（%） 抑制率（%）
空白组 - 5.90±0.82 -
Ge组 10-8 4.63±0.48** 21.53
10-9 4.68±0.59* 20.68
10-10 5.41±0.89▲ 8.31
10-11 5.40± .45▲ 8.47
Az组 10-6 4.37±0.14** 25.93
表3 老鹳草素对体外培养OC融合指数的影响［n=4，（x±s）］
Tab.3Effectsofgeraniinonfusionindexofosteoclastsinvitro［n=4，（x±s）］
分 组 药物浓度（mol/L）
3d 9d
陷窝计数（个/视野） 陷窝计数（个/视野） 抑制率（%）
对照组 - 16.25±3.304 23.50±3.317△△ －
Ge组 10-7 9.00±1.633**▲ 44.62 6.25±1 500**▲＃＃ 73.40
10-9 12.00±4.320*▲▲ 26.15 12.25±1.708**▲▲ 47.87
Az组 10-6 4.50±1.915** 72.31 1.50±0 77** 93.62
抑制率（%）
表4 老鹳草素对OC与骨片共同培养3d和9d时骨片陷窝计数的影响［n=4，（x±s）］
Tab.4Effectsofgeraniinonthenumberofpitsonslicesofosteoclastsandboneslicesco-culturedfor3dand9
［n=4，（x±s）］
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与3 d的对照组比较，△△P＜0.01；与Az比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与Ge10-9
mol/L比较，＃＃P＜0.01.
分 组 药物浓度（mol/L） 陷窝面积（μm2/视野） 面积比值（%） 抑制率（%）
对照组 - 459.18±62.84 0.49± 07 -
Ge组 10-7 293.66±23.77* 0.32±0.03 36.05
10-9 352.44±2 .66* 0.38±0.03 23.24
Az组 10-6 345.95±39.88** 0.37±0.04 24.66
表5 老鹳草素对OC与骨片共同培养3d的骨片陷窝面积的影响［n=4，（x±s）］
Tab.5Effects of geraniin on total areas of pits on slices of osteoclasts and bone slices co-cultured for 3 d［n =
4，（x±s）］
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01.
分 组 药物浓度（mol/L） 陷窝面积（μm2/视野） 面积比值（%） 抑制率（%）
对照组 - 1165.90±123.03 1.25±0.13 -
Ge组 10-7 570.41±32.62**△△ 0.61±0.04 51.08
10-9 836.42±19.86**△△▲▲ 0.90± .02 28.26
Az组 10-6 195.57± 2.01** 0.21±0.06 83.23
表6 老鹳草素对OC与骨片共同培养9d的骨片陷窝面积的影响［n=4，（x±s）］
Tab.6Effects of geraniin on total areas of pits on slices of osteoclasts and bone slices co-cultured for 9 d［n =
4，（x±s）］
与对照组比较，**P＜0.01；与Az组比较，△△P＜0.01；与Ge10-7mol/L比较，▲▲P＜0.01.
第33卷4 昆明医科大学学报
分 组 药物浓度（mol/L）
9 d
陷窝灰度 n 陷窝灰度 抑制率（%）
对照组 - 16 145.69±37.40 - 11 141.91±34.61 -
Ge组 10-7 11 120.91±28.19* 16.98 10 100.00±23.88** 29.53
10-9 9 113.78±30.28* 21.90 10 85.20±29.50**△ 39.96
Az组 10-6 7 95.29± 1.17** 34.60 5 86.60±24 98** 38.98
n 抑制率（%）
3 d
表7 老鹳草素对OC与骨片共同培养3d和9d的骨片陷窝平均辉度的影响［n=4，（x±s）］
Tab.7Effectsofgeraniinonaverageluminanceofpitsofosteoclastsandboneslicesco-culturedfor3dand9d
［n=4，（x±s）］
与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与3d的Ge10-9mol/L组比较，△P＜0.05.
3 讨论
经体外破骨细胞分离培养，细胞体积大，有
多个核，且有伪足样运动．同时破骨细胞胞浆内
含有丰富的 TRAP， 它是酸性磷酸酶的同功酶，
而且更具有特异性．本研究从新生大鼠乳鼠长骨
中分离的破骨细胞具有多核、伪足样运动、TRAP
强阳性等特点，符合破骨细胞的鉴定标准，因此
本方法分离培养破骨细胞是可行的．如在玻片上
培养OC，一般于 24 h 细胞开始凋亡， 说明破骨
细胞在玻片上培养一般只能存活24h左右[6]．
TRAP特异性分布于OC的胞浆中，通常作为
鉴别OC的重要标志．TRAP的表达与破骨细胞的
功能密切相关，是破骨细胞重要的酶组织化学识
别标志．通常用偶氮偶联组化分析技术，在含酒
石酸钾钠的酸性条件下，TRAP将奈酚 AS- BI 磷
酸盐水解产生奈酚AS-BI，后者即与染液中六偶氮
副品红结合，在酶活性部位形成不溶性红色沉
淀．TRAP染色阳性的多核细胞计数是以破骨细胞
特征性酶组织化学反应为基础的检测方法，用于
研究处理因素对破骨细胞的短期作用时，方法简
便、灵敏度高[7]．
本研究发现，10-8mol/L 和 10-9mol/L的 Ge 可
降低体外培养TRAP阳性mOC的存活率，显示出
明显的抑制作用．并且与乙酰唑胺相似，Ge同时
也表现出阻止 pOC 融合分化的作用．说明浓度
10-8mol/L和10-9mol/L的Ge影响体外培养OC的生
存率．但Ge只在10-8mol/L浓度时才减少 pOC 数
目，说明Ge首先抑制pOC融合为多核OC，较高
浓度时才影响pOC的存活．从而进一步抑制mOC
的生成．
本实验中空白对照组的OC可以在象牙骨片上
形成典型的陷窝．所有加药组3d和9d的陷窝计
数、陷窝面积和陷窝平均灰度都低于同一时间点
的空白对照组，说明 10-7mol/L与 10-9mol/L的 Ge
和Az10-6mol/L一样可抑制体外培养OC的骨吸收
功能，减少陷窝的数目、面积和灰度．在3d时，
Ge10-7mol/L和10-9mol/L的陷窝计数、面积和平均
灰度无明显浓度差异，但到 9 d 时 10-7mol/L组的
陷窝个数和面积均小于10-9mol/L组．Ge同一浓度
组 2 个时间点间的陷窝个数和灰度无明显差异，
但陷窝面积则是9d的大于3d的，此时9d组的
抑制率也高于3d组．提示Ge抑制OC性骨吸收
与Ge浓度和作用时间都有关，Ge浓度高、作用时
间长，则形成的陷窝少、面积小．
本研究结果提示，Ge抑制体外培养OC 的骨
吸收功能，可能与其减少OC的形成密切相关．
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（2012－05－02收稿）
张小超，等．老鹳草素对破骨细胞体外骨吸收功能的影响 5第 8期