全 文 ：0 引言
健康植物组织内部的特殊环境为内生菌的生存提
供了优越的条件，从目前己经研究过的植物来看，内生
真菌在植物体内是普遍存在的，药用植物内生菌很可
能是未知真菌的宝库[1]。内生真菌长期生活在植物体
内的特殊环境中，并与宿主协同进化，与植物形成了互
惠共生关系。由于植物组织内部环境的特殊性，内生真
菌已成为寻找有效生物活性成分的重要来源之一[2-3]。
基金项目：天然产物研究与利用湖北省重点实验室开放基金（2008NP06）；三峡大学博士启动基金（KJ2008B015）。
第一作者简介：涂璇，女，1974年出生，湖北宜昌人，副教授，博士，主要从事微生物资源及代谢产物研究。通信地址：443002宜昌市大学路8号三峡
大学化学与生命科学学院，Tel：0717-6395931，Email：tuxuan7@yahoo.com.cn。
收稿日期：2010-07-01，修回日期：2010-09-15。
筒鞘蛇菰内生真菌的分离及拮抗菌筛选
涂 璇，张亚雄 1，韩青梅 2，俞 辰 1，安 然 1
（1三峡大学化学与生命科学学院/湖北省天然产物研究与利用重点实验室，湖北宜昌 443002；
2西北农林科技大学/陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌 712100）
摘 要：为了考察筒鞘蛇菰（Balanophora harlandii Hook. f.）内生真菌的类群组成，寻找高活性的抗菌物
质，用组织块分离法和杯碟法筛选出能产生高抑菌活性的蛇菰内生真菌菌株。从神农架野生筒鞘蛇菰
不同组织内共分离、纯化得到49株内生真菌，对其中生长良好的28株内生真菌归属于半知菌亚门丝孢
纲的2目2科7个属，分别是丝核菌属（Rhizoctonia）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、地霉属
（Geotrichum）、小孢霉属（Microsporum）、从梗孢属（Monilia）和粉孢属(Oidium)。这28株内生真菌对于3
种供试靶标细菌表现不同的抑菌活性，其中SG47菌株的抑菌作用较强。这些内生真菌能够产生丰富
的抑菌活性物质，极具从中寻找新型杀菌剂或药物先导化合物的潜力。
关键词：筒鞘蛇菰；内生真菌；鉴定；活性筛选
中图分类号：Q939.96 文献标志码：A 论文编号：2010-2028
Isolation and Screening of Endophytic Antibacteria from Balanophora harlandii Hook. f.
Tu Xuan1, Zhang Yaxiong1, Han Qingmei 2, Yu Chen 1, An Ran1,
(1College of Chemistry and Life Sciences, Three Gorges University/
Hubei Key Lab of Natural Products Research and Development, Yichang Hubei 443002;
2Northwest A&F University/Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling Shanxi 712100)
Abstract: The Objective was to evaluate the composition of endophytic fungi groups of Balanophora harlandii
Hook. f., and screen high inhibition activity substances from them. The endophytic fungi were isolated from
surfaced-sterilized tissue, the inhibition activity substances were screened by agar well tests. 49 strains of
endophytic fungi were isolated from Balanophora harlandii Hook. f.. 28 strains which grow well in PDA were
classified into 7 different genera, 2 families, 2 orders through on their morphological characteristics. They were
Rhizoctonia, Aspergillus, Penicillium, Geotrichum, Microsporum, Monilia and Oidium respectively.
Antagonistic activities of the endophytic fungi against 3 bacteria strains were tested in vitro. The cell-free
filtrate of fermentation broth of strain SG47 showed notable inhibition effect on tested bacteria strains. The
endophytic fungi isolated from Balanophora harlandii Hook. f. showed biological diversity, most of them had
the ability to produce antibacterial activity substances. The plant endophytic fungi have a high potential to find
novel pesticides or new medicines produced as secondary metabolites.
Key words: Balanophora harlandii Hook. f .; endophytic fungi; identification; bioactivity-screening
中国农学通报 2011,27(01):309-312
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
筒鞘蛇菰（Balanophora harlandii Hook. f.）又称鹿仙草，
为蛇菰科蛇菰属草本寄生植物，在湖北省神农架自然
保护区中分布较多，在当地被誉为“文王一支笔”。蛇
菰具有止血、生肌、镇痛等功效，民间常用于治疗胃痛、
血崩、痢疾和外伤出血等症。目前关于蛇菰的研究主
要集中在对其化学成分的分离分析，已从蛇菰中分离
到的化合物主要是一些木质素类、三萜类、甾醇类以及
黄酮类等的化合物，从筒鞘蛇菰中分离得到的熊果
烷-12-烯-11-羰基-3-醇正二十八酸酯为一新化合物[4-6]，
而关于蛇菰内生菌的研究还鲜见报道。目前由于细菌
的耐药性以及新变异病毒的产生，需要开发和研究出
新的抗菌、抗病毒的活性物质。由于蛇菰的寄生性，其
特殊的生理环境使蛇菰内生菌具备产生一些新颖结构
的生理活性物质的可能，因而研究和开发蛇菰内生菌
为寻找到新的抗菌活性物质开辟新的资源。
本研究通过对湖北省神农架自然保护区中的野生
筒鞘蛇菰不同组织中内生真菌进行分离、纯化培养，并
根据其形态进行初步的鉴定，采用杯碟法进行皿内抑
菌试验，筛选获得一些有应用潜力的活性菌株。现将
结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 供试植物和靶标细菌
筒鞘蛇菰蛇菰（Balanophora harlandii Hook. f.）于
2008年 7月采自湖北神农架野生植物保护区，由湖北
省天然产物研究与利用重点实验室汪鋆植教授鉴定。
靶标细菌：大肠杆菌（E.coli）、铜绿假单胞菌
（Pseudomonas aeruginosa）和 金 黄 色 葡 萄 球 菌
（Staphylococcus aures）。以上菌株由三峡大学化生学
院微生物实验室提供。
1.2 蛇菰组织表面消毒
用自来水反复冲洗植物表面，洗尽泥沙后用纱布
滤干，蛇菰的根、茎、叶、花等不同组织分别用75%乙醇
浸1 min、3%次氯酸钠浸10 min、75%乙醇浸30 s、0.2%
升汞浸 1min，最后用无菌水冲洗 3~4次 [7]。取最后一
次冲洗液进行无菌检验，如在 PDA培养基上无菌生
长，表明消毒彻底。
1.3 蛇菰内生真菌的分离
将表面消毒彻底的蛇菰组织样品用手术刀切去外
皮，将内部组织切成大小均匀的小块，置于PDA平板
中，28℃培养。每皿放 3~5个组织块，每种组织做 3
皿。观察组织块周围内生真菌的生长情况，一旦有菌
丝长出，立即挑出进一步纯化。将得到的纯菌种在斜
面培养基上划线接种，并置于28℃培养箱内培养，待长
好后放入4℃冰箱保存备用。
1.4 蛇菰内生真菌的初步鉴定
对上述分离纯化后的内生真菌进行固态菌丝培
养，参照文献[8]根据菌丝形态、颜色以及孢子对其进
行初步鉴定。
2 结果与分析
2.1 蛇菰内生真菌分离结果
取消毒彻底的蛇菰植物根、茎、叶、花组织培养，共
分离获得49株菌落形态明显不同的内生真菌，其中分
离至根部的有21株，分离至茎组织的有28株。花和叶
组织没有分离得到内生真菌。
种属
无孢目，无孢
科，丝核菌属
丝孢目，丛梗孢
科，粉孢属
丝孢目，丛梗孢
科，地霉属
丝孢目，丛梗孢
科，丛梗孢属
丝孢目，丛梗孢
科，青霉属
丝孢目，丛梗孢
科，曲霉属
丝孢目，从梗孢
科，小孢霉属
菌株编号
SG001、SG005、SG004、SG011、SG012、
SG019、SG023、SG028、SG031、SG033、
SG035、SG037、SG038、SG045、SG049
SG003
SG016、SG047
SG048
SG002、SG014、SG036
SG018、SG020、SG022、SG024、SG026
SG039
典型特征
菌丝在分技处缢缩，褐色；具横隔，菌核表面粗糙，褐色至黑色，表里颜色相同，
菌核之间有丝状体相连，菌丝组织疏松；不产生无性孢子。
菌丝体表生；分生孢子梗直立。顶部产生菌丝型的分生节孢子(粉孢子)；
分生孢子串生，单胞，无色。
菌落为酵母状菌落，但它有真菌丝，菌丝有横隔，成熟后菌丝断裂
成裂生孢子。裂生孢子多为长筒形，也有方形或椭圆形。
分生孢子梗二叉状或不规则分枝，无色；芽生串孢型的
分生孢子椭圆形至长卵圆形，单细胞，孢子链呈念珠状。
分生孢子梗多次分枝，排列成帚状；最上层分枝(产孢细胞)瓶状；
分生孢子单细胞，近球形，无色。菌丝体具横隔。
分生孢子梗直立，顶端膨大成球形，上面着生1~2层放射状分布的瓶状小梗，
分生孢子聚集在分生孢子梗顶端呈头状，分生孢子球形、单孢。
从菌丝体上形成梭形大型分生孢子，两端尖，多隔，表面具刺，
此外，还能产生小型分生孢子。
表1 蛇菰内生真菌的分离鉴定结果
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涂 璇等：筒鞘蛇菰内生真菌的分离及拮抗菌筛选
2.2 蛇菰内生真菌初步鉴定结果
从蛇菰内生组织中共分离到49株真菌菌株，但仅
对在 PDA平板上生长良好的 28株做了初步鉴定，具
体描述见表1。其中15菌株未产生孢子，13菌株产生
孢子，归属于半知菌亚门，丝孢纲的2目，2科，7属，其
分别是丝核菌属（Rhizoctonia）、曲霉属（Aspergillus）、青
霉属（Penicillium）、地霉属（Geotrichum）、小孢霉属
（Microsporum）、从 梗 孢 属（Monilia）和 粉 孢 属
(Oidium)。在鉴定的 28株蛇菰内生菌中，丝核菌属的
内生真菌数量较多，是优势菌群，其次是曲霉属和青霉
属。地霉属2株，小孢霉属、从梗孢属和粉孢属都各有
一株。
2.3 具抑菌活性蛇菰内生真菌的筛选
用杯碟法测定蛇菰内生真菌发酵液粗提物对3种
靶标细菌抑菌活性。由表2可知，供试28株内生真菌
中有12株对大肠杆菌有抑菌作用，有6株对铜绿假单
菌株号
SG01
SG02
SG03
SG04
SG05
SG11
SG12
SG14
SG16
SG18
SG19
SG20
SG22
SG23
抑菌效果
E.coli
－
－
－
－
－
＋
－
－
＋＋
＋
＋＋
－
＋
＋＋＋
Pse. aeruginosa
－
－
＋＋＋
－
－
－
－
－
－
＋
－
－
－
－
Stap. aures
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
菌株号
SG24
SG26
SG28
SG31
SG33
SG35
SG36
SG37
SG38
SG39
SG45
SG47
SG48
SG49
抑菌效果
E.coli
－
－
－
－
＋＋
－
－
＋＋＋
＋＋＋
＋＋
＋＋
＋＋＋
－
＋
Pse.aeruginosa
＋
－
－
－
－
－
－
＋＋
－
＋
－
＋＋＋
－
－
Stap. aures
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
－
＋＋＋
－
－
表2 蛇菰内生真菌发酵液的抑菌结果
注：“＋”代表有抑菌圈直径6~10 mm，“＋＋”代表抑菌圈直径11~20 mm，“＋＋＋”代表抑菌圈直径21~30 mm，“－”代表无抑菌作用。
胞菌有抑菌作用，其中SG37、SG38和SG47表现较强
的抑菌活性，抑菌圈直径都大于 20 mm，但是仅SG47
菌表现对金黄色葡萄球菌有抑菌作用。供试的铜绿假
单胞菌和金黄色葡萄球菌为本实验室从临床上分离出
的耐药菌，对一般的常见抗生素都表现出一定的耐药
性，以耐药菌为筛选靶标能够快速筛选出高活性的内
生菌次生代谢物。
图1为SG47号菌株的菌落培养特征，菌落呈白色
绒毛状，质地疏松，外圈菌丝茂盛，菌落凸起，呈同心
圆，基内中心颜色浅黄。产生白色裂生孢子，圆柱形，
两端圆钝，菌丝体具横隔，部分菌丝螺旋扭曲。
3 结论与讨论
蛇菰的不同组织中均存在内生真菌，而且呈现明
显生物多样性。从植物组织内分离到的内生菌数量和
种类受很多因素的影响，分离材料的来源、分离部位、
分离方法、分离培养基成分、表面消毒程度以及培养条
件等都会影响分离的效果。不同的宿主植物其定殖的
的内生菌种类和数量都有一定差别，植物内生真菌中
有大量的无孢类型真菌，具有一定普遍性，且曲霉属和
青霉属的真菌具有一定优势[9-11]。本实验从蛇菰的根、
茎组织中分离出的49株内生真菌，但仅对其中28株在
PDA培养基上生长良好的菌株进行鉴定，这28株菌仅
通过初步的形态鉴定就归类到 7个属，如果对其进行图1 SG47的菌落特征和菌丝特征（×400）
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深入的分子水平的鉴定，其中的种的地位会更明确，多
样性更具体。
蛇菰内生真菌能产生丰富的抑菌活性物质。以上
的研究结果表明，以耐药菌作为筛选靶标菌能够提高
活性菌株的筛选效率，避免一些低活性或重复活性物
质的筛选。本实验采用的大肠杆菌就是一般实验室常
用的普通大肠杆菌，对该菌有抑制效果的活性菌株数
量较多，而以耐药性铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌
为筛选菌时，活性菌株的出筛率则大大降低。这样可
以减少后续研究的工作量，提高新活性物质的筛出效
率。SG47对2种耐药细菌表现出明显的抑菌效果，因
而该菌株产生的活性物质对于将来开发为新的（医用
或农用）抗菌药物具有一定的开发潜能，值得进一步研
究。
在从筒鞘蛇菰组织内共分离出49株菌中，只有28
株能够在 PDA培养基良好生长，另外分离出的 21株
菌可能需要一些特殊的营养物质才能正常生长。可见
研究新的培养基为获得更多的内生菌菌株极为重要，
这些较难培养的菌株产生新颖活性物质的可能性也更
大，这将是植物内生菌研究的一个重要方向。
参考文献
[1] 赵桂华,等.杨树内生真菌的分离和鉴定[J].南京林业大学学报:自
然科学版,2008,(32)3:76-78.
[2] 郭良栋,等.内生真菌研究进展[J].菌物系统2001,20(1):148-152.
[3] 易晓华,等.除虫菊内生真菌的分离及其发酵产物抑菌活性筛选
[J].西北植物学报,2008,28(2):0317-0323.
[4] 夏新中,韩宏星,屠鹏飞.筒鞘蛇菰的三萜及甾醇成分研究[J].中草
药,2001,1(32):6-9.
[5] 滕荣伟,王德祖,杨崇仁.蛇菰的化学成分[J].云南植物研究,2000,22
(2):225-233.
[6] 阮汉利,张勇慧,皮惠芳等.蛇菰的化学成分研究.天然产物研究与
开发[J]，2006,18:74-75.
[7] Coombs J T, Christopher M M Franco. Isolation and identification
of actinobacteria from surface-sterilized wheat roots[J]. Applied
and Enviromental Microbiology,2003,9:5603-5608.
[8] 张纪中.微生物分类学[M].上海:复旦大学出版社,1990.12.
[9] 陈立军,孙广宇,张荣,等.油菜内生真菌的分离鉴定[J].石河子大学
学报:自然科学版,2004,7(22):66-68.
[10] 曹理想,田新莉,周世宁.香蕉内生真菌、放线菌类群分析.中山大学
学报:自然科学版[J],2003,42(2):70-73.
[11] 杨春燕.八角莲内生真菌分离、鉴定的初步探索.生物学杂志
[J].2006,23(6):32-34.
·· 312