全 文 ：２９卷０２期
Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．０２
草 业 科 学
ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥ
３０１－３０５
０２／２０１２
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后生物
生产层 新银合欢中单宁提取工艺优化研究
李 茂１，２，字学娟１，２，３，周汉林１，２，刘国道１，２
（１．中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，海南 儋州５７１７３７；
２．中国热带农业科学院热带草业与畜牧研究所，海南 儋州５７１７３７；
３．海南大学应用科技学院（儋州校区），海南 儋州５７１７３７）
摘要：对新银合欢（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）中单宁类物质的提取工艺进行优化研究，选择液料比、提取温度、提取
时间、提取剂体积分数等因素分别进行单因素和正交试验。结果表明，在液料比４０∶１、提取温度５０℃、提取时间
６０ｍｉｎ、丙酮体积分数５０％的条件下，单宁提取效果最佳，测得新银合欢单宁平均含量为２．５４％。
关键词：新银合欢；单宁；提取
中图分类号：Ｑ９４６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０６２９（２０１２）０２－０３０１－０５
＊
新银合欢（Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）为豆科含羞
草亚科银合欢属多年生灌木或乔木，是我国一种重
要的木本豆科饲用植物［１］。新银合欢叶片干物质中
粗蛋白质含量为２２％～２９％，被联合国粮农组织的
饲料专家誉为干旱地区的“蛋白质仓库”；且氨基酸、
胡萝卜素、多种维生素和微量元素含量丰富，是联合
国粮农组织向亚太地区推广的多用途优良树种之
一［１］。１９６１年８月华南热带作物科学研究院（现中
国热带农业科学院）从中美洲引进少量萨尔瓦多型
银合欢种子，１９６２年开始试种观察，繁殖种子［２］。
单宁（Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｔａｎｎｉｎ）是指存在于植物体内
的多元酚类物质，并可与蛋白质、生物碱和多糖等化
合物发生反应，是一种保护性物质［３－４］。在畜牧业生
产中，单宁一般被当作饲料的抗营养因子，特别在热
带亚热带木本饲用植物中含量较高，影响动物的采
食和消化。国内许多学者已经从紫花苜蓿（Ｍｅｄｉ－
ｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）、槟榔果（Ａｒｅｃａ ｃａｔｅｃｈｕ）、红豆草（Ｏｎｏ－
ｂｒｙｃｈｉｓ ｖｉｃｉａｅｆｏｌｉａ）、山蚂蝗属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）、决明
（Ｃａｓｓｉａ ｎｉｃｔｉｔｏｍｓ）等植物中提取单宁或进行相关研
究［５－９］，而新银合欢的研究主要集中在其栽培技术、
营养价值和含羞草素上［１０－１３］，对其单宁的提取研究
较少。本研究建立了新银合欢中单宁的优化提取工
艺，为科学利用新银合欢资源提供理论依据。
１ 材料与方法
１．１试验材料
１．１．１植物材料 供试所用新银合欢（开花期）新鲜
嫩茎叶，采集于中国热带农业科学院热带作物品种
资源研究所实验基地（海南省儋州市）。样品经杀青
后烘干、过８０目筛粉碎备用。
１．１．２试剂 单宁酸（Ｃ７６Ｈ５２Ｏ４６）、磷钼酸、钨酸钠、
磷酸、无水碳酸钠、无水乙醇、丙酮、甲醇。
Ｆｏｌｉｎ－Ｄｅｎｉｓ显色剂：１０ｇ磷钼酸，５０ｇ钨酸钠
溶于７５０ｍＬ蒸馏水中，再加入５０ｍＬ ８５％的磷酸，
煮沸后回流２ｈ，冷却定容至１ ０００ｍＬ，保存于棕色
瓶中。
饱和 Ｎａ２ＣＯ３ 溶液：３５ｇ无水 Ｎａ２ＣＯ３ 加热溶
解于１００ｍＬ水中，冷却晶体后用快速滤纸过滤，溶
液备用。
１．１．３仪器 ７２３ＰＣＳ可见分光光度计（上海欣茂仪
器有限公司）和ＣＨＺ－８２Ａ恒温振荡器（金坛市富华
仪器有限公司）。
１．２方法 标准曲线绘制及单宁提取方法参照字
学娟［１４］的方法。
１．２．１提取剂的选择 选用蒸馏水、５０％（Ｖ／Ｖ）丙
酮、５０％甲醇溶液、５０％乙醇溶液，按液料比为
５０∶１、４０℃、４０ｍｉｎ的条件分别进行提取，测定单
宁的含量。
＊ 收稿日期：２０１１－０５－０３ 接受日期：２０１１－１０－１０
基金项目：中央级公益科研院所基本科研业务专项（ＰＺＳ０６６）；海南省重点科技项目（０９０１０３）；农业科技成果转化资金项目
（２０１０ＧＢ２３２６０５７８）
作者简介：李茂（１９８４－），男，四川绵阳人，硕士，研究实习员，主要从事热带牧草与反刍动物营养研究。
通信作者：周汉林 Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈａｎｌｉｎ８＠１６３．ｃｏｍ
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１．２．２单因素试验 选择丙酮体积分数、浸提时间、
浸提温度和液料比进行单因素试验。丙酮体积分数
分别设置为２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％；浸
提时间为２０、３０、４０、５０、６０和７０ｍｉｎ；浸提温度分
别设置为室温（约２０℃）、３０、４０、５０、６０和７０℃；液
料比分别设置为２０∶１、３０∶１、４０∶１、５０∶１、６０∶１
和７０∶１。
１．２．３正交试验 为了验证各单因素间的相互作用
效果，选用对单宁提取影响较大的提取剂体积分数、
料液比、提取时间、提取温度４个因素进行４因素３
水平Ｌ９（３４）正交试验，确定提取新银合欢中单宁的
最佳工艺参数。
１．２．４回收、重复性试验 称取银合欢２０份各１ｇ，
按正交试验结果中最佳工艺制备浸提液，其中１０份
样品浸提液中加入不等量的单宁，对加入单宁的量
进行回收试验。回收率＝（加单宁后测得单宁含
量－未加单宁测得单宁含量）／加入单宁含量×
１００％。根据两种处理试验结果进行重复性比较。
１．２．５数据处理 采用ＳＡＳ软件和Ｅｘｃｅｌ软件进行
数据处理和统计分析，方差分析（ＡＮＯＶＡ）过程中
均值的多重比较采用Ｄｕｎｃａｎ法进行。
２ 结果与分析
２．１提取条件对单宁提取的影响性
２．１．１提取溶剂对新银合欢中单宁提取的影响 选
用去离子水、５０％（Ｖ／Ｖ）丙酮、５０％甲醇溶液、５０％
乙醇溶液，按液料比为５０∶１、４０℃、４０ｍｉｎ的条件
进行提取，测定单宁的含量（图１）。
图１ 不同提取溶剂对新银合欢中单宁的提取量
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｎ ｔａｎｎｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍＬｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ
丙酮溶液提取效果最好，甲醇和乙醇提取单宁
含量相近，去离子水提取效果最差。甲醇是有毒试
剂，使用时易造成安全隐患。在使用乙醇溶液提取
的过程中发现，浸提溶液较混浊，过滤十分困难，不
利于后续处理。所以选择对单宁溶解性好、提取率
高的丙酮溶液作为提取剂。
２．１．２提取溶剂体积分数对新银合欢中单宁提取的
影响 分别用２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％丙
酮溶液提取，提取温度４０℃，液料比为５０∶１，提取
４０ｍｉｎ，过滤、定容，测定单宁含量（图２）。
图２ 提取溶剂浓度对新银合欢中单宁提取的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔａｎｎｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍＬｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ
４０％丙酮溶液对单宁的溶解能力最强，丙酮体
积分数高于或低于４０％时提取率有所下降。这与
丙酮的理化性质有关，加入适量的水比纯丙酮溶液
对单宁的提取量要高，可显著改善单宁提取效
果［１５］。
２．１．３提取时间对新银合欢中单宁提取的影响 提
取时间分别为２０、３０、４０、５０、６０和７０ｍｉｎ，用５０％
丙酮溶液、在温度４０℃、液料比为５０∶１提取、过
滤、定容，测定单宁含量（图３）。
图３ 提取时间对新银合欢中单宁提取的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔａｎｎｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍＬｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ
２０３
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随着提取时间的增加，新银合欢中单宁含量也
有所增加，５０ｍｉｎ处理单宁含量最高，而后逐渐下
降）。说明经过一段时间（约５０ｍｉｎ）的提取后样品
与浸提溶液中单宁含量趋于平衡，即已达到浸提最
大值。单宁是多酚类物质，丙酮具有一定的氧化性，
时间过长可能使单宁部分氧化，导致单宁含量下降。
２．１．４提取温度对新银合欢中单宁提取的影响 在
相同条件下（５０％丙酮、４０ｍｉｎ、５０∶１液料比），分
别在室温（约２０℃）、３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０
℃下提取，过滤定容后，测定单宁含量（图４）。
图４ 提取温度对新银合欢中单宁提取的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｔａｎｎｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍＬｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ
随着提取温度的增加，新银合欢中单宁含量也
有所增加，５０℃时单宁含量最高，当温度继续增高
时单宁含量逐渐降低。这是由于温度较低时，温度
的增高促进单宁在丙酮中的溶解，提取的单宁含量
逐渐增加。但是过高温度单宁易发生降解、缩合、氧
化等化学反应，导致提取的单宁含量下降。另外高
温会加快丙酮的挥发，增加了成本。
２．１．５液料比对新银合欢中单宁提取的影响 在相
同条件下（５０％丙酮、４０ｍｉｎ、４０℃），分别在液料比
为２０∶１、３０∶１、４０∶１、５０∶１、６０∶１和７０∶１下提
取，过滤定容后，测定单宁含量，得单宁含量与液料
比的关系（图５）。
图５ 液料比对新银合欢中单宁提取的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ－ｍａｔｅｒｉａｌ ｒａｔｉｏ ｏｎ ｔａｎｎｉｎ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍＬｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ
随着液料比的增加，新银合欢中单宁含量也有
所增加，液料比为５０∶１时单宁含量最高（略高于液
料比４０∶１的单宁含量），当液料比大于５０∶１时，
单宁含量逐渐减少。可能是由于液料比过低时样品
与提取液搅拌不均匀，影响了单宁的提取；而液料比
过高（即丙酮溶液较多）则增加了单宁的氧化机会，
也可能造成提取的单宁含量低。
２．２新银合欢中单宁提取的正交试验 通过
单因素试验确定了单宁提取率的主要影响因素为丙
酮体积分数、提取时间、提取温度和液料比，进行正
交试验探讨提取的最佳工艺条件，试验因素和水平
见表１。
极差分析可知，４个因素的极差大小为Ｄ＞Ｃ＞
Ｂ＞Ａ（表２），液料比对单宁的提取影响最大，提取
时间的影响较小。通过极差分析最优组合为
Ａ３Ｂ３Ｃ２Ｄ１，即液料比为４０∶１、温度为５０℃、提取时
间为６０ｍｉｎ、丙酮浓度为５０％，此时提取的单宁为
２．５６６ １％。
表１ 正交试验因素及水平
Ｔａｂｌｅ １ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
水平
Ｌｅｖｅｌ
因素Ｆａｃｔｏｒ
丙酮浓度（Ａ）
Ａｃｅｔｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／％
提取时间（Ｂ）
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ／ｍｉｎ
提取温度（Ｃ）
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ／℃
液料比（Ｄ）
Ａｃｅｔｏｎｅ－ｐｌａｎｔ ｒａｔｉｏ
１ ３０ ４０ ４０ ４０
２ ４０ ５０ ５０ ５０
３ ５０ ６０ ６０ ６０
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表２ 正交试验结果
Ｔａｂｌｅ ２ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
试验号
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｎｏ．
试验因素Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ
Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
单宁含量
Ｔａｎｎｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ／％
１ １ １ １ １ ２．５１０ ０
２ １ ２ ２ ２ ２．４７２ ９
３ １ ３ ３ ３ ２．４５７ ６
４ ２ １ ２ ３ ２．５１２ ０
５ ２ ２ ３ １ ２．５３６ ４
６ ２ ３ １ ２ ２．４０３ ７
７ ３ １ ３ ２ ２．４６４ ９
８ ３ ２ １ ３ ２．４８４ ９
９ ３ ３ ２ １ ２．５６６ １
Ｔ１ ７．４４０ ６ ７．４８７ ０ ７．３９８ ８ ７．６１２ ７
Ｔ２ ７．４５２ ２ ７．４９４ ３ ７．５５１ ０ ７．３４１ ６
Ｔ３ ７．５１６ ０ ７．４２７ ６ ７．４５９ ０ ７．４５４ ６
Ｒ ０．０４０ ５ ０．０３６ ６ ０．０７６ ６ ０．１３６ １
表３ 单宁回收和重复性测定结果
Ｔａｂｌｅ ３ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔａｎｎｉｎ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ
样品号
Ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ．
测得单宁含量
Ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔａｎｎｉｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ／％
加入单宁含量
Ａｄｄｅｄ ｔａｎｎｉｎ／
ｍｇ
测得单宁总量
Ｍｅａｓｕｒｅｄ ｔａｎｎｉｎ
ｃｏｎｔｅｎｔ／％
回收单宁含量
Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｔａｎｎｉｎ／
ｍｇ
回收率
Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｒａｔｅ
１ ２．５７ ０．５０ ３．０９ ０．５２ １．０５
２ ２．５２ ０．５０ ３．０２ ０．５０ １．００
３ ２．５３ ０．５０ ３．０３ ０．５０ １．００
４ ２．５４ ０．５０ ３．０４ ０．５０ １．００
５ ２．５０ ０．５０ ３．０７ ０．５６ １．１３
６ ２．５０ ０．５０ ３．０２ ０．５２ １．０４
７ ２．５３ ０．５０ ３．０６ ０．５３ １．０７
８ ２．５５ ０．５０ ３．０５ ０．５０ １．００
９ ２．５６ ０．５０ ３．０３ ０．４７ ０．９３
１０ ２．５７ ０．５０ ３．０４ ０．４７ ０．９４
平均值Ａｖｅｒａｇｅ ２．５４ ０．５０ ３．０５ ０．５１ １．０２
标准差Ｓ．Ｄ ０．０３ ０．００ ０．０２ ０．０３ ０．０６
２．３新银合欢中单宁提取最优组合的重复性
和回收分析 通过最优组合测得单宁含量平均值
为２．５４％，标准差为０．０３，表明该方法重复性较高；
单宁回收率在０．９３～１．１３，标准差为０．０６，回收率
较高。
３ 讨论与结论
单宁类化合物多采用有机溶剂或水提取，但各
有优缺点，纯有机溶剂提取单宁，可能导致组分不完
全［１６］；而水的极性较大，溶液杂质多，不利于下一步
分离，故一般很少单独使用有机溶剂或水。前人研
究［１７］结果表明，单宁在有机溶剂的水溶液中溶解度
更大，例如丙酮、乙醇、甲醇等的水溶液。本试验中
使用甲醇、乙醇、丙酮水溶液提取单宁，发现甲醇、乙
醇提取单宁的量相当，丙酮水溶液提取单宁含量最
高。由于甲醇为有毒试剂，乙醇为易燃易爆化学品，
应用前景受限。而丙酮水溶液对单宁的溶解能力很
强，能打开单宁―蛋白质的连接键，使单宁的提取率
提高［１８］，综合各方面因素考虑，最终选用丙酮作为
提取剂。
由单因素试验和正交试验结果，新银合欢中单
宁的最佳提取条件为液料比４０∶１、提取温度５０
℃、提取时间６０ｍｉｎ、丙酮体积分数５０％的单宁提
４０３
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取结果最佳，通过重复性和回收试验，新银合欢单宁
平均含量为２．５４％。
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ＬＩ Ｍａｏ１，２，ＺＩ Ｘｕｅ－ｊｕａｎ１，２，３，ＺＨＯＵ Ｈａｎ－ｌｉｎ１，２，ＬＩＵ Ｇｕｏ－ｄａｏ１，２
（１．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｃｒｏｐｓ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，
Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；２．Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｎｚｈｏｕ ５７１７３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｆｏｕｒ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ：ｒａｔｉｏ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｔｏ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍ－
ｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｆｏｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔａｎｎｉｎｓ ｆｒｏｍ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｏｆ
Ｌｅｕｃａｅｎａｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔａｎｎｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｗｅｒｅ：ｒａｔｉｏ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｔｏ ｍａｔｅｒｉａｌ ４０∶１，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５０℃，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ４０ｍｉｎ ａｎｄ ａｃｅｔｏｎｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ５０％．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｎｎｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｌ．ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ ｗａｓ
２．５４％．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｕｃａｅｎａ ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ；ｔａｎｎｉｎｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＺＨＯＵ Ｈａｎ－ｌｉｎ Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈａｎｌｉｎ８＠１６３．ｃｏｍ
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