全 文 ：农杆菌介导 AFT基因转入四季桔的研究
陆荣生1， 韩美丽1， 吴耀军2， 杜晓莉1， 杨玉霞1， 马跃峰1
（1.广西农科院植物保护研究所/广西作物病虫害生物学重点实验室，广西 南宁 530007；
2.广西林业科学院，广西 南宁 530001）
摘 要：以四季桔上胚轴为外植体，研究农杆菌介导转化过程中的影响因素。 结果显示，转化研究所用抑菌剂抗菌素中，替门
的汀杀菌效果较好，且对外植体出芽无明显抑制作用。转化芽选择初期，2~3 d 的预培养及选择培养初期 3~5 d 的暗培养有利于卡
那霉素抗性芽的发生。 PCR 扩增检测结果显示，AFT 基因已转化至四季桔，转基因植株-4℃处理 6 d 时，SOD 酶与脯氨酸含量均高
于对照。 该试验建立了四季桔上胚轴遗传转化再生系统，其再生条件为：MT 基本培养基附加 TDZ0.5~1.0 mg/L，替门汀 300 mg/L，
卡那霉素 100 mg/L；预培养时间为 2~3 d，共培养后 3~5 d 的暗培养有利于转化率的提高。
关键词：四季桔； 不定芽； 转化
中图分类号：Q789 文献标识码：A 文章编号：1004-874X（2013）11-0145-04
Studies on ATF gene transformation mediated
by Agrobacterium in Citrus mitis
LU Rong-sheng1, HAN Mei-li1, WU Yiao-jun2, Du Xiao-li21, YANG Yu-xia1, MA Yue-fen1
(1.Institute of Plant Protection, Guangxi Academy Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Biology for Crop Diseases and
Insect Pests, Nanning 530007, China; 2. Guangxi Forestry Research Institute, Nanning 530002, China)
Abstract：Epicotyls from Citrus mitis seedling were used as explants to investigate the factors which had an influence on
differentiation and regeneration of anti-Kan adventitious buds in transformation mediated by Agrobacterium. Among antibiotics, Timentin
was the best for differentiation of adventitious buds and growth control of agrobacterium. Growing in darkness for 3~5 days after explants
co-culture with agrobacterium was help to anti -Kan buds developing. It was better for anti -Kan adventitious buds developing when
explants were cultured in differentiation medium for 2~3 days before infected by agrobacterium. Transgenic plants were obtained by PCR
assay, and SOD enzyme activity and content of proline were raised in transgenic plant treated by -4℃ for 4~6 days. The result showed
that transformation system was established for epicotyls in Citrus mitis. The transgenic plant could be obtain in medium with TDZ 0.5~1.0
mg/L, Timentin 300 mg/L, Km 100 mg/L. Frequency of transformation would be increased as explants precultured for 2~3 d and dark
culture for 3~5 d after co-culture.
Key words: citrus mitis; adventitious bud; transformation
四季桔（Citrus mitis）为芸香科柑桔属常绿植物，树性
直立，枝叶稠密，花洁白芳香，1 年开花多次，果实桔黄色，
是南方很受欢迎的观赏植物， 四季桔还有明显的医效价
值，具有化痰止咳、消食理气的功能。 研究发现，四季桔叶
片挥发油中含有大量可以抑制革兰氏阳性、 阴性细菌的
抗菌活性物质 [1]，不仅可以净化空气，还具有开发新药品
的潜力。 四季桔耐寒能力低是限制其种植区域的主要因
素。 自然情况下，由于柑桔抗寒资源有限及多胚现象，导
致杂交育种效率较低。 遗传转化技术的出现为四季桔品
种改良及抗源增加提供了新途径。 利用遗传转化技术可
以跨跃物种，将新的基因转入目标植物，而不改变其遗传
背景。 目前尚无抗寒基因转化四季桔的研究报道，因此开
展这方面的研究，将抗寒基因 AFT 转入四季桔，对扩大其
种植区域很有意义。
柑桔遗传转化技术开展较早， 至今已取得了较大
进展。 早期转入柑桔的基因主要是选择基因与报告基
因 [2-4]，近年转化具有某种特定功能的目的基因也逐渐
增多。 Shawkat 等 [5]将 HAL2 基因转入糙皮柠檬以提高柠
檬的抗盐能力 ； Janaynna 等 [ 6 ]采用农杆菌介导法将
HRPN 基因转入哈姆林甜橙，所得转化植株对柑橘溃疡
病提高了 70%；还有一些衰退病外壳蛋白相关基因、马
玲薯病原相关蛋白基因、 抗菌肽基因等目的基因转化
转入柑桔的报道 [7-8]。 而目前国内外还没有四季桔转化
研究方面的相关报道， 也尚未有 AFT 基因转入四季桔
的公开报道。
以四季桔组培苗上的胚轴为研究对象，从抗菌素种类
与浓度的选择、预培养时间的确定、选择初期光照条件的
变化等方面着手，建立高效转化系统，将 AFT 基因转入四
季桔，并测定低温条件下转基因苗抗寒相关生理指标的变
化情况。
四季桔胚轴转化的主要问题是外植体对农杆菌转化
中常用的抗菌素较为敏感， 从而影响转化植株的再生；上
胚轴切割后的材料在新培养基上的早期死亡率高。本研究
通过新型抑菌抗生素替门汀（Timentin）的应用，并结合材
料预培养及转化细胞选择初期一定时间的暗培养，最大限
度地提高抗性不定芽发生率，从而提高转化效率。
收稿日期：2013-03-29
基金项目：广西农业科学院基本科技业务专项〔200808Z(基)〕
作者简介：陆荣生（1962-），男，硕士，高级工程师，E-mail:hmlii@
126.com
广东农业科学 2013 年第 11 期 145
C M Y K
DOI:10.16768/j.issn.1004-874x.2013.11.050
抑菌率
(%)
0dC
19.6cB
72.5bA
94.8abA
97.1aA
0cC
96.4bB
100.0aA
100.0aA
100.0aA
0cB
0cB
19.4bB
63.5aA
74.8aA
不定芽发生率
(%)
93.4aA
91.8aA
81.7abAB
73.8bB
69.4dB
95.1aA
93.4aA
91.9aA
90.5aA
90.2aA
93.4aA
86.9aAB
79.0bB
74.4cC
64.0dC
抗生素浓度
(mg/L)
0
200
300
400
500
0
200
300
400
500
0
200
300
400
500
抗生素种类
头孢噻肟钠
替门汀
氨苄青霉素
表 1 不同浓度抗菌素对四季桔上胚轴不定芽发生率
及对农杆菌抑菌率的影响
注：抑菌率指外植体与农杆菌共培养 3 d 后的，在添加抗生素
的培养基上培养 7 d，农杆菌生长得到控制的外植体数占总感染外
植体数的百分比例。 试验结果采用邓肯氏新复极差法进行分析，表
中同列数据后小写英文字母不同者表示差异显著（P<0.05）大写英
文字母不同者表示差异极显著（P<0.01），。
图 1 质粒 pAR-27 图谱
1 材料与方法
1.1 试验材料
取四季桔种子，用清水冲洗干净，然后在无菌条件下用
0.1%HgCI2消毒 5 min，无菌水冲洗 3次，随后播种于 MS固
体培养基中，25~30℃黑暗下萌发，苗龄 20 d待用。 农杆菌菌
株为 EHA105，含双质粒表达载体 pAR-27，由新西兰食品园
艺所遗传实验室提供。载体 pAR-27上插有 35s启动子驱动
的 AFT基因及筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因（NTP-
Ⅱ），AFT基因全长约 1.1 kb。 该质粒图谱如下：
1.2 试验方法
1.2.1 农杆菌培养 农杆菌固体平板培养基为 LB 附加
卡那霉素（Kan）50 μg/mL。 转化前挑单菌落接种于 50 mL
液体培养基中， 黑暗条件下 28℃ 120 r/min 振荡培养至
OD600达到 0.8～1.0，然后 3 000 r/min 离心 10 min，除去上
清液，用再悬浮液悬浮待用。
1.2.2 转化方法 切实生苗上胚轴 0.5 cm，在农杆菌悬浮
液中浸泡 15~20 min， 除去多余的菌液， 放共培养基上，
26～28℃黑暗下共培养 2～3 d，转至选择培养基上，水平放
置。每两周更换 1次培养基，诱导抗性芽的产生。转化所用
悬浮培养液、共培养基、分化培养基的基本成分均为 MT，
上胚轴分化选择培养基附加成分为 BA1.0 mg/L+NAA0.2
mg/L+Kan100 mg/L+Timentin300 mg/L， 生根培养基附加
IBA0.1 mg/L，Km100 mg/L。 培养过程均在 26~28℃光照下
进行，光照强度 1 400 lx，光照时间 12 h/d。
1.2.3 测定方法 (1)抗性芽发生率测定：上胚轴在分化选
择培养基上连续选择 60 d， 所获得的具卡那抗性芽的外
植体占感染总外植体的百分率。
(2)PCR 与 Southern blot 测定：参照韩美丽等 [9]的方法
进行， 引物 Primer1：5′-3′TCT AGA ATG AAT ATT GAA
TCA TCT TTC TGC，Primer2：5′ -3′ GAG CTC CTA GCA
CTC TGG CAA TGG AGC。 预期扩增长度为 1.1 kb。
(3) 转基因植株抗寒性测定： 将转基因植株与对照放
于-4℃冰箱，分别处理 2、4、6、8 d，测定其 SOD 酶活性及
脯氨酸含量。 SOD 酶活性的测定采用氯化硝基四氢唑蓝
光化还原法，用 U/mg.protein 表示酶活性，试验采用 4 株
幼苗混合取样，3 次重复。 脯氨酸含量的测定采用酸性茚
三酮法。 试验采用 4株幼苗混合取样，3次重复。
2 结果与分析
2.1 不同种类、 浓度抗菌素对不定芽发生及对农杆菌的
抑菌效果研究
抗菌素在转化研究中的作用是控制外植体上残留农
杆菌生长，以利于转化细胞再生。 抗菌素在抑制农杆菌生
长的同时， 对外植体不定芽形成也会产生一定程度的影
响。以替门汀、头孢噻肟钠、氨苄青霉素 3种抗菌素为调查
对象，观察了抗菌素对四季桔上胚轴不定芽发生的影响及
对农菌杆的抑制效果，结果见表 1。
从表 1可以看出，所用 3种抗菌素对不定芽分化的影
响效果不同。 头孢噻肟钠加入浓度低于 300 mg/L时，对不
定芽发生无明显影响；当加入量达 400~500 mg/L 时，与对
照相比，上胚轴不定芽发生率明显下降，且少量外植体发
黄。替门汀在所用浓度范围内对外植体不定芽发生率无明
显影响。 氨苄青霉素添加浓度在 200 mg/L时，不定芽发生
率与对照无差异；浓度为 300~500 mg/L 时，不定芽发生率
明显低于对照，下降至 64%~79%。
将与农杆菌共培养 3 d 后的外植体继代到含有不同
种类与浓度抗菌素的分化选择培养基上培养 7 d ，调查农
杆菌的控制情况。 结果表明，头孢噻肟钠在 400~500 mg/L
的范围内抑菌效果可达 94%~97%；替门汀在 300~500 mg/
L的范围内抑菌效果最好，达 100%的抑菌效果；氨苄青霉
素最差， 加入量 400~500 mg/L 时， 抑菌效果只有 63%~
74%。
从既有较高的抑菌效果同时又不影响不定芽发生率
这两个方面综合考虑，四季桔转化中所用抗菌素以替门汀
146
C M Y K
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1KB
1~7 为转基因植株样品，8为非转基因植株样品种，
9 为质粒 DNA，10 为 Marker
图 6 转化植株 PCR 检测
为首选，使用浓度为 300~500 mg/L；头孢噻肟钠次之，使
用浓度为 400~500 mg/L，氨苄青霉素不宜采用。
2.2 不同预培养时间对抗性芽再生的影响
四季桔 20 d实生苗上胚轴较为幼嫩，直接切割后立即
在农杆菌再悬浮液中浸泡并进行为期 3 d的共培养后，外
植体死亡率较高，间接地导致抗性芽发生率下降。 为此，我
们尝试将外植体切为长度 0.5 cm左右片段后，先在不定芽
分化培养基上进行一定时间的预培养，然后再进行后续的
转化步骤，四季桔不定芽发生过程见图 2（封三）。
不同预培养时间对抗性芽再生的影响见图 3。 从图 3
可以看出， 一定时间的预培养有助于提高农杆菌感染后
外植体的成活率与抗性芽的发生率。 预培养 1 d 时，外植
体死亡率比对照（0 d）略有下降；预培养 2~3 d 时，外植体
死亡率从对照的 38%降至 12%~14%， 抗性不定芽发生率
分别达到 10.2%、8.7%， 远高于对照的 1.4%； 预培养 4 d
时，外植体死亡率只有 6%，但抗生芽发生率下降；预培养
5 d时，虽然外植体死亡率低到 0.2%，但没有抗性芽产生。
因此，预培养时间以 2~3 d 为宜，时间过长则不利于抗性
芽发生最大化。
2.3 不同暗培养时间对抗性植株再生的影响
为了进一步提高转化效率，将与农杆菌共培养 3 d 的
四季桔上胚轴外植体转至选择分化培养基，先放在黑暗条
件下培养一定时间后移至光下继续选择培养 （图 4，封
三）。 60 d后调查抗性芽产生率及生根率，结果见图 5。
从图 5可以看出，不同暗培养时间对转化抗性芽发生
率有效大的影响。 共培养后直接放于光下的处理，抗性芽
产生率最低，只有 9.8%；暗培养 3 d 与 5 d 处理的抗性芽
产生率最高，分别为 13.5%、16.9%，抗性芽生根率分别达
到 62.1%、77.3%；暗培养 7 d 的处理，抗性芽发生率居第
三，为 10.2 %，抗性芽生根率低于对照及 3、5 d 两个处理，
同时，这一处理的外植体切口表面愈伤生长势比 3、5 d 处
理强，但这些愈伤生长好的外植体在后面的继代选择过程
中很少有芽分化，均逐渐变黄死去；当暗培养时间为 10 d
时，无抗性芽产生。 综上，暗培养时间以 5 d较为适合，3 d
次之，7 d假抗性多。
2.4 抗性芽的 PCR检测
所得到的抗性无性系生根后， 取叶片提取 DNA进行
PCR 检测，结果（图 6）发现，所检测的 7 个抗性植株均有
PCR 扩增带，没有经转化处理的对照则无扩增带出现，可
以确定 PCR检测阳性植株为转化植株。
2.5 转基因植株低温处理后相关抗寒指标的变化
植物体内 SOD酶与脯氨酸含量高低是衡量植株抗低
温能力高低的主要指标。 携带 AFT 的转基因植株在经过
低温处理后，体内 SOD酶与脯氨酸含量变化见图 7、图 8。
从图 7、图 8 可以看出，对照植株在-4℃下处理初期，SOD
酶活性与脯氨酸含量均有一定程度的提高，二者均在处理
后 4 d 达最高数值，但低于同期转基因植株，此后开始下
降，至处理后 10 d，均降到未处理时的水平。 与对照植株
不同，转基因植株未进行低温处理时，体内 SOD 酶活性、
脯氨酸含量与对照相差不大，在-4℃下处理后，二者数值
随着低温处理时间的延长而上升， 至处理后 6 d 达高峰。
处理 6 d以后，二者数值开始下降，但仍高于同期对照。
此外，形态学观察也显示，对照植株在-4℃处理后 4
d，叶片出现水浸状，而转化植株到处理后 8 d 才出现这一
症状，说明转化植株抗耐寒能力强于对照。
3 结论与讨论
抗生素是植物基因转化中常用的抑菌剂，但对不同植
物的影响不同[10]。 农杆菌侵染后，不同树种组培材料对不
同抗生素的敏感性存在明显差异，这种差异直接影响转化
芽的再生[11]，本研究结果也证明了这一观点。
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0 1 2 3 4 5
预培养时间（d）
图 3 预培养时间对抗性芽发生的影响
共培养 3d后外植体死亡率（％）
抗性芽发生率（％）
数
值
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
抗性芽发生率（％） 抗性芽生根率（％）
0 3 5 7 10
暗培养时间（d）
图 5 不同暗培养时间对抗性芽发生的影响
数
值
147
C M Y K
4．5
4．0
3．5
3．0
2．5
2．0
1．5
1．0
0．5
0
0 2 4 6 8 10
超
氧
歧
化
酶
活
性
Um
g-
1 p
ro
te
in
-1
转化无性系 1
转化无性系 2
转化无性系 3
对照
不同低温处理时间（d）
图 7 不同低温处理时间对转基因植株 SOD 酶活性影响
30
25
20
15
10
5
0
转化无性系 1
转化无性系 2
转化无性系 3
对照
0 2 4 6 8 10
低温处理时间（d）
图 8 不同低温处理时间对转基因植株脯氨酸含量的影响
脯
氨
酸
含
量
（ μ
g/
g）
通常认为，农杆菌转化过程中，外植体具有大的新鲜
切口有利于农杆菌浸染及转化的发生。 这种看法忽略一
些植株外植体较为幼嫩的状态下， 刚刚切割的伤口对含
有农杆菌的液体浸泡较为敏感， 易于造成伤口细胞因不
适应而产生死亡现象。 有报道认为，遗传转化前将外植体
预培养一段时间，不仅可以减少杂菌污染，而且可以调整
外植体的生理状态，使它们更适应体外培养条件，提高转
化效率 [12]；也有报道认为，预培养对转化率的提高没有促
进作用，甚至降低转化效率[13]。本研究结果表明，一定时间
的预培养有利于四季桔转化效率的提高， 但预培养时间
不宜过长，2~3 d即可。 这可能因为长时间的预培养，加快
了细胞的老化过程，因而使抗性芽发生率下降。
转化植株选择培养过程中，首先要尽量创造条件使转
化细胞恢复生长。 研究表明，一定时间的暗培养有助于植
物细胞恢复生长 [14-15]，但光线又是细胞形态形成所必需
的，如果暗培养时间过长，愈伤生长过快不利于形态的及
时形成[16]，因此要针对具体植物品种找到二者之间的平衡
点。 在本试验中 5~7 d 的暗培养有助于细胞恢复生长，进
而有益于抗性芽的产生，而暗培养时间过长，假抗性芽形
成率高，间接导致转化率下降。
在低温胁迫下， 植物的许多代谢过程都会产生超氧化
物自由基，破坏细胞膜的脂双层结构，并与膜蛋白以及酶发
生作用，使其产生链式聚合作用，造成蛋白的破坏，从而使得
细胞膜系统产生不可逆变性， 导致植物受损甚至死亡 [17]。
SOD酶是植物防御细胞膜系统受伤害的主要酶之一。 植物
在低温情况下，SOD酶活性逐步升高，以减少低温胁迫产生
的超氧化物自由基的伤害[18]。 本试验测定的-4℃低温对四季
桔 SOD酶活性的影响中， 其 SOD酶活性在低温处理 4~6 d
时逐步上升，说明转基因植株的低温临界点发生变化。 抗寒
植物通过增强渗透调节物质游离脯氨酸的含量， 来保持原
生质体与环境之间的渗透平衡和结构的完整性。 这些结果
与转基因四季桔抗寒性的提高是相对应的。
本研究建立了四季桔上胚轴基因转化系统，该系统具
体条件为： 上胚轴分化选择培养基添加抑菌用抗生素的
种类为替门汀，用量为 300~500 mg/L。 植物外植体与农杆
菌共培养前 2~3 d的预培养及共培养 3 d后 3~5 d的暗培
养有利于提高转化率。 PCR 与 Southern blot 测定均表明，
AFT基因已植入转化植株； 转基因植株低温处理试验中，
SOD 酶与脯氨酸含量测定结果也表明， 转基因无性系抗
寒能力有一定提高。 这一结果对于柑桔抗寒种质创新与
育种具有一定的意义。
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（上接第 148页）
全被阐述， 5 种蛋白质发挥生物学功能的各自的具体机
制也没有详尽介绍。Chen等[16]解析出了参与 Streptomyces
lividans 1326 DNA 硫修饰的 DndA 蛋白的分辨率为 2.4A
的三维结构，发现其是一种半胱氨酸脱硫酶，并且阐明了
DndA的催化活性位点(DndA 蛋白序列中第 327 位半胱氨
酸)位于 DndA 蛋白的 β 折叠片上，而不像其他半胱氨酸
脱硫酶那样位于 α 螺旋上 。 另外 ，Hu 等 [17] 解析出了
Escherichia Coli B7A 中 DndE 蛋白 1~110 片段分辨率为
2.5A 的三维结构，发现其是以四聚体的形式存在，并且可
以和带切口的双链 DNA结合， 从而首次发现 DndE 是一
种 DNA 结合蛋白 。 同时 ，Chen 等获得了 Salmonella
enterica serovar Cerro 87 中 DndE 蛋白 2.7A 分辨率的晶
体 [18]，这为后续 Salmonella enterica serovar Cerro 87 中
DndE蛋白的三维结构解析奠定了基础。相比之下，DndB、
DndC、DndD蛋白的三维结构解析目前还没有文献报道。
本研究利用 Ni2+-NTA 亲和层析、Source Q 阴离子交
换层析和 Superdex 200 分子筛层析方法对 Salmonella
enterica serovar Cerro 87 中的 DndB 蛋白进行了纯化 ，
SDS-PAGE 电泳分析结果显示获得了纯度足够高的
Salmonella enterica serovar Cerro 87 DndB 蛋白，可用于后
续的蛋白质结晶研究和酶学特性研究。 Ni2+-NTA 亲和层
析、Source Q阴离子交换层析和 Superdex 200 分子筛层析
是一套有效的纯化体系，利用这套纯化体系进行 DndB 蛋
白纯化，为 DndB 蛋白的结构生物学研究和酶学特性研究
提供了极大的便利。
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