全 文 ：【基础与预防医学】
小连翘内生真菌种群分布及其抗菌性研究
袁保红 1 ,杜青平 2 ,邓祖军1
(1. 广东药学院 基础学院 , 广东 广州 510006;2. 广东工业大学 环境科学与工程学院 , 广东 广州 510006)
摘要:目的 分析小连翘(Hyperioum s sampsonii Hance)内生真菌的分布特征和抗菌活性。方法 采用内生菌分离法分离菌株 ,双
培养法对峙试验测定其抗菌性。结果 从小连翘的根 、茎 、叶等不同的器官中分离得到 81株内生真菌 , 经形态学分类鉴定分属
于 4个目 , 5个科 , 26个属 ,其中头孢霉属(Cepha losporium sp. )和丝核菌属 (Rhizoctonia sp. )为优势菌群。不同部位内生真菌
的类型 、数量和分布存在差异 , 根部有 31株 ,分属于 12属;茎部有 12株 , 分属于 10属;叶部有 38株 , 分属于 13属。通过平板
对峙实验发现 ,从小连翘所分离的内生真菌中 54. 32%对某些植物病原真菌有拮抗活性。结论 小连翘内生真菌及其代谢产物
中具有潜在活性物质 ,值得深入研究。
关键词:内生真菌;小连翘;拮抗活性
中图分类号:Q 93 　文献标识码:A　文章编号:1006 -8783(2007)03 - 0307 -05
基金项目:广东药学院科研启动基金(43543080)
作者简介:袁保红(1971 -),男 , 讲师 ,硕士 ,主要从事微生物
药物的研究与开发;通讯作者:杜青平 Te l:(020)
39352196, E -m a il:qpdu2008@126. com.
Stud ies on communities of endophytic fung i from Hyperioums sam psoniiHance and their
antipathogenic activ ities in vitro
YUAN Bao-hong1 , DU Q ing-ping2 , DENG Zu-jun1
(1. Guangdong College of Pharm acy , Guangzhou , Guangdong 510006, Ch ina;2. Faculty of Envirom ental Science and Engineering ,
GuangdongUn iversity of Technology ,Guangzhou ,Guangdong 510006 ,China)
Abstract:The endophy tic fung i were isola ted and identifiedm orpho log ically from the roo ts, stem s and leaves o fHyperioum s Sam pson ii
Hance. E igh ty-one strains o f endophy tic fungi were iso lated and be longed to 26 genera, 5 fam ilies and 4 orders. Cepha losporium sp. and
Rhizoctonia sp. w ere the dom inan t genera. Am ong 81 stra ins, 31 strains of 12 generaw ere iso lated in roots, 12 stra ins of 10 genera in
stem s, and 38 stra ins o f 13 genera in leaves. The results showed tha t the quan tity, popula tion , and distribution o f the endophy tic fung i
varied in different positions ofHyperioum s SampsoniiHance. In the dual cu ltu re tests, 53. 48% o f all the iso lated Endophy tic fung i
showed an tagonistic to som e plan t pathogens. These endophy tic fung i inside the plants have in tim ate correla tion w ith the ir hosts. These
endophy tic fung i and theirm etabolites m igh t p lay an im portan t ro le in the p lants aga inst the pathogens.
K ey words:endophy tic fung i;Hyperioum s Sam pson iiHance;antipathogenic activ ities
　　小连翘 (Hyperioum s sampson iiH ance),别名小
翘 、七层兰 、瑞香草 、元宝草等 ,为多年生双子叶植物
药藤黄科植物 ,味苦 、性辛 、平 [ 1] 。全草含鞣质 ,有
光致敏作用 ,动物食后可产生皮炎;含小连翘碱
(hypecorine)和小连翘次碱 (hypecorinine);花含金
丝桃素 (hepericin)[ 2] ,有活血 、止痛 、调经 、止血 、消
肿之效;小连翘或其提取物作为有效药物成分用于
制备治疗睡眠障碍 、老年痴呆 、记忆力减退等病症的
药物[ 3] ;同属植物贯叶连翘 ,在西方国家称圣约翰
草 ,用于治疗忧郁症等疾病已有几百年的历史 [ 4] 。
近年来的研究表明小连翘也具有抗忧郁作用 [ 5] 。
文献报道 ,小连翘中含有聚 (异 )戊二烯二苯甲酮类
衍生物 、萘骈双蒽酮类和黄酮类等多种化学成分 ,这
些成分是小连翘药理作用的主要有效成分 ,但是要
提取和分离这些药物成分还有很多困难 [ 6] 。近来
研究表明 ,某些药用植物中个别内生真菌能够产生
与宿主相同或者相似药理活性的成分 [ 7] ,由此对药
用植物内生真菌的研究引起人们的广泛关注 。如果
在小连翘内生真菌中能够发现类似的活性物质 ,无
疑找到了一种可替代小连翘植物的新型生物资源。
但是至今未见从小连翘中分离及其内生真菌的种群
多样性的研究报道 。本文对小连翘内生真菌进行了
分离和分类鉴定 ,并对其种群多样性及内生真菌拮
抗病原菌的活性的研究报道如下 。
307
第 23卷第 3期 广　东　药　学　院　学　报 Vo.l 23 No. 3
2007年 6月 JOURNAL OFGUANGDONG COLLEGE OF PHARMACY Jun. 2007
1　材料与方法
1. 1　材料
分离所用材料为小连翘的根 、茎 、叶 ,采自中国
科学院华南植物园(广州 )。采集其健康的组织 ,无
其它病虫害 ,根 、茎与叶分开采集 ,放于密封袋中 ,于
4 ℃存放 ,尽快进行内生真菌的分离 。
碘伏:威的牌消毒液 ,主要成份是聚乙烯吡咯烷
酮碘(即碘伏 ),液体剂型 ,有效碘含量为 0. 5 %,是
一种新型的 PVP - I消毒剂 ,深圳市新华鹏消毒剂
有限公司生产。
NS液:0. 9%NaC l;ST液:0. 9%N aC l, 0. 5%吐
温 80;中和剂:0. 9 %N aC l, 0. 5%吐温 80, 0. 5 %硫
代硫酸钠。
PDA培养基:马铃薯 200 g,葡萄糖 20 g,琼脂
20 g,水 1 000mL, pH7. 0。在进行内生真菌的分离
时 ,向培养基中分别加入青霉素 、链霉素至 50 μg /
mL。
1. 2　供试菌株
纹枯病菌 (Rh izoctonia solani)、白叶枯病菌
(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae )、 恶 苗 病 菌
(Fusarium moniliforme)、棉花枯萎病菌 (Fusarium
oxysporium f. sp. vasinfectum )由中山大学生命科学
院微生物和生化教研室提供。
1. 2　方 法
1. 2. 1　植物材料的处理
样品采于 2005年 10月。样品用自来水冲洗干
净后 ,取不同部位的茎或叶若干 ,剪成小块 ,分别放
于三角瓶中;加入碘伏消毒液 (使用时有效碘浓度
为 2 500mg L- 1),不断摇动 ,消毒 5 m in。吸去消
毒液 ,加入无菌 ST液 ,荡洗 1 m in,吸去液体 。重复
一次。经表面消毒后的样品可用于接种。
1. 2. 2　内生真菌的分离 、纯化
茎内内生真菌的接种:用无菌刀片削去茎的皮
及已裸露的切面 ,然后切取约 2 ～ 5 mm 的切片若
干 ,先置于无菌平皿中 。再将样品置于无菌研钵中 ,
加入石英砂和 1mL ST液 ,将样品研成浆 。取适量
的浆液涂布于 PDA平板 。为了保证样品有足够的
代表性 ,每个样品要用若干段茎 ,一段茎仅涂一个平
板 ,共需涂 5 ～ 10个平板 。根叶样品的处理基本同
茎 。
将涂布好的平板置于 28 ℃培养 ,每隔 12 h观
察真菌菌落形成情况 。培养基中一出现菌落 ,立即
将此处的小块琼脂挖出 ,将平板再放回 28 ℃培养
10 d,计数各平板上的菌落总数。挖出的含真菌的
小块 PDA立即置于含 PDA的小试管中培养 ,待真
菌长出后 ,再在 PDA平板上采用菌丝顶端纯化法逐
步纯化。待菌落出现后 ,根据菌落形态 、颜色的差异
以及长出时间的不同 ,分别挑取各平板上的菌落边
缘的菌丝接于新的平板上进行分离培养 。在培养数
日后 ,观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况 ,并
做相应的记录 ,包括影象记录 ,对菌株编号后 ,转至
PDA斜面培养基上 ,于 28 ℃培养箱中培养 5 ～ 7 d,
然后放入 4 ℃冰箱保存。
1. 2. 3　表面消毒效果检测
表面消毒后的样品于 5 mL无菌水中振荡 1
m in,取 0. 3 mL悬液涂布于 PDA平板上 ,在 28℃培
养 ,记录是否有真菌生长 。另外 ,采用存活试验观察
表面消毒效果 ,即将分离的内生真菌菌苔经过各自
表面消毒程序处理后 ,再接种到 PDA平板 28 ℃培
养后 ,观察是否生长 。
1. 2. 4　菌种鉴定
从纯化培养数日的菌落上挑取菌丝并连同分生
孢子制成玻片 ,置于光学显微镜下观察菌丝形态 、孢
子梗形态 、孢子形态以及孢子与营养体之间的着生
关系 ,对照有关资料确定真菌的分类学地位 [ 8] 。
1. 2. 5　对峙试验 　将 4种植物病原菌(纹枯病菌 、
稻瘟病菌 、白叶枯病菌 、恶苗病菌 )接种于平板中
央 ,内生真菌接种于平板边缘 , 28 ℃培养 ,观察病原
菌菌落周围的变化 。
2　结 果
2. 1　表面消毒效果
表面消毒后的样品振荡液 0. 3 mL分别涂布于
PDA平板培养基上 , 28 ℃培养 2周后无菌落长出 ,
同时 10株分离的代表性真菌菌苔分别经过消毒过
程处理后接种到 PDA平板上 , 28 ℃培养 2周后 ,没
有观察到菌落生长。表明经过样品消毒处理过程 ,
样品表面附生菌的影响已消除 ,分离的菌株来自于
样品内部 ,与植物组织结合紧密。
2. 2　小连翘内生真菌种群组成
从植物小连翘分离获得内生真菌共 81株。经
显微形态观察鉴定为 4个目 , 5个科 , 26个属 (见表
1)。从表 1可以看出 ,植物小连翘内生真菌中 ,从
目的分类水平上以丛梗孢目 (M oniliales)和无孢菌
群(Myce lia ste rilia)为优势菌群 ,分别为 50株和 23
株占总菌株数的 61. 7%和 28. 4%;在属的分类水平
上以头孢霉属 (Cepha losporium sp. )和丝核菌属
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广东药学院学报 , 2007, 23(3)
(Rh izocton ia sp. )为优势菌群 , 分别为 20株和 16
株 ,占总菌数的 24. 7%和 19. 7%。
2. 3　植物小连翘不同部位内生真菌的分布
对小连翘根茎叶内生真菌的种类 ,数目和分布
部位进行统计分析 ,结果见表 2。
表 1　小连翘植物内生真菌种群组成
Tab. 1 The composing of endophytic fung i in Hyperioums sampson ii Hance
目 科 属 数量 /株
丛梗孢目(M oniliales) 丛梗孢科(Moniliaceae)
暗梗孢科(Dem atiaceae)
瘤痤孢科(Tube rculariaceae)
串珠孢霉属(Monilia sp. )
拟青霉属(Penicilliopsis sp. )
曲霉属(Asperg illus sp. )
木霉属(Trichoderma sp. )
头孢霉属(Cepha losporium sp. )
汉斯霉属(Hansfcord ia sp. )
粘帚霉属(Glioclad ium sp. )
膝节霉属(Gonatophragm ium sp. )
黑孢霉属(N igrospora sp. )
短梗霉属(Aureobasid ium sp. )
芽枝霉属(Cladosporium sp. )
孔球霉属(Gilm aniella sp. )
色串孢属(Tolura sp. )
鞘孢霉属(Chalara sp. )
痕格霉属(S irosporium sp. )
镰刀菌属(F usarium sp. )
弯孢霉属(Curvu laria sp. )
1
2
1
1
20
3
1
2
1
1
1
2
3
1
16
3
1
毛霉目(M uco ra le s) 毛霉科(Mucoraceae) 根霉属(Rhizopus sp. )
毛霉属(Mucor sp. )
2
4
球壳孢目(Sphae ropsida les) 球壳孢科(Sphaeropsidaceae) 毛壳菌属(Chaetonium sp. )
直毛壳菌属(Ascotricha sp. )
1
1
无孢菌群(M yce lia ste rilia) 小菌核属(Sclerotium sp. )
丝核菌属(Rhizoctonia sp. )
束丝菌属(Ozonium sp. )
茎叶核菌属(Ectostrom a sp. )
疏毛核菌霉属(Dactuliophora sp. )
2
16
1
3
1
　　从表 2中看出 ,从小连翘植株内分离的 81株内
生真菌的分布各有特点 ,根部分布有 31株内生真菌
(占总数的 38. 2%),隶属于 12个属 (占 26个属的
46. 2 %);茎部分布有 12株内生真菌 (占总数的
14. 9%),分属于 10个属 (占 26个属的 38. 5 %);
从叶部分离 出的 38 株内生真菌 (占总数的
46.9%),分属于 13个属 (占 26个属的 50%)。由
此可知 ,小连翘的内生真菌主要存在于植株的叶和
根中 ,茎部组织中分离到的内生真菌相对较少 。
从根茎叶中分离到的内生真菌的种属分布来
看 ,头孢霉属 (Cepha losporium sp. )在叶部 、根部和茎
部都有分布 ,说明头孢霉属 (Cepha losporium sp. )不
仅是叶部的优势种群 ,而且也是整株小连翘植物内
生真菌的优势种群 。丝核菌属 (Rhizocton ia sp. )仅
在根部分布 ,是根部的优势种群 ,占根部所有分离到
的内生真菌的 51%。另外 ,短梗霉属 (Aureobasidium
sp. )、鞘孢霉属 (Cha lara sp. )、束丝菌属 (Ozonium
sp. )也只在根部分布;而串珠孢霉属 (Monilia sp. )、
曲霉属 (Aspergillus sp. )、粘帚霉属 (Gliocladium
sp. )、痕格 霉 属 (S irosporium sp. )、弯孢 霉 属
(Curvu laria sp. )、毛壳菌属(Chaetonium sp. )和直毛
壳菌属(Ascotricha sp. )的内生真菌只在叶部分布 ,
而叶组织内生真菌的优势种也和根部不同 ,头孢霉
属和痕格霉属内生真菌是叶部的优势菌群;从茎部
分离的内生真菌的优势菌群不明显 ,其中分离到的
木霉属 (Trichoderma sp. )、黑孢霉属 (N igrospora
309
第 3期　袁保红 ,等.小连翘内生真菌种群分布及其抗菌性研究
sp. )、芽枝霉属(Cladosporium sp. )内生真菌只在茎
部分布 。结果表明 ,小连翘根茎叶组织的不同部位
所分离到的内生真菌的数量不同 ,所分离到内生真
菌的分布和优势种群也存有差异。
表 2　小连翘植物内生真菌数量与分布
Tab. 2　The number and d istr ibut ion of endophytic fungi
species inHyperioums sam pson ii Hance
分离
部位
　分离到的菌
　所在的属
数量
/株
每个
部位
合计
/株
占总
分离
菌数
的比
例 /%
根 汉斯霉属(Hansfcord ia sp. )
膝节霉属(Gonatophragm ium sp. )
短梗霉属(Aureobasid ium sp. )
孔球霉属(Gilman iella sp. )
色串孢属(Tolura sp. )
鞘孢霉属(Cha lara sp. )
毛霉属(Mucor sp. )
小菌核属(Sclerotium sp. )
丝核菌属(Rhizoctonia sp. )
束丝菌属(Ozonium sp. )
茎叶核菌属(Ectostroma sp. )
头孢霉属(Cepha losporium sp. )
1
2
1
1
3
1
1
1
16
1
1
2
31 38. 2
茎 镰刀菌属(Fusarium sp. )
根霉属(Rhizopus sp. )
小菌核属(Sclerotium sp. )
孔球霉属(Gilman iella sp. )
芽枝霉属(Cladosporium sp. )
黑孢霉属(Nigrospora sp. )
木霉属(Trichoderma sp. )
拟青霉属(Pen icilliopsis sp. )
头孢霉属(Cepha losporium sp. )
茎叶核菌属(Ectostroma sp. )
1
1
1
1
1
1
1
2
1
2
12 14. 9
叶 镰刀菌属(Fusarium sp. )
根霉属(Rhizopus sp. )
疏毛核菌霉属(Dactuliophora sp.
汉斯霉属(Hansfcord ia sp. )
毛霉属(Mucor sp. )
毛壳菌属(Chaeton ium sp. )
直毛壳菌属(Ascotricha sp. )
粘帚霉属(Gliocladium sp. )
头孢霉属(Cepha losporium sp. )
弯孢霉属(Curvularia sp. )
痕格霉属(S irosporium sp. )
串珠孢霉属(Mon ilia sp. )
曲霉属(Asperg illus sp. )
2
1
1
2
3
1
1
1
17
1
6
1
1
38 46. 9
合计 81 81 100
2. 4　内生真菌对植物病原菌的拮抗作用
通过平板对峙试验分别对从小连翘中所分离的
81株菌对植物病原菌纹枯病菌 (立枯丝核菌 )
(Rhizoctonia solani)、白叶 枯病菌 (Xanthomonas
oryzae pv. Oryzae)、恶苗病菌 (Fusarium moniliforme)
、棉 花枯 萎 病 菌 (Fusarium oxysporium f. sp.
vasinfectum)的抑菌活性进行测定 (图 1)。结果发
现 ,从小连翘中分离的 81株内生真菌中共有 53株
对一种或多种病原菌有拮抗作用 (占总分离株数的
52. 48%)。其中对恶苗病菌有抑菌作用的有 23株 ,
对白叶枯病菌有抑菌作用的 18株 ,对纹枯病菌有抑
菌作用的有 12株 ,对棉花枯萎病菌有抑菌作用的有
4株。这表明多数小连翘内生真菌具有抗植物病原
菌的功能 ,在小连翘中存在着广泛的抗菌生物活性
资源 。
A.内生真菌 J - 53拮抗纹枯病菌;
B. 内生真菌 f - 55和 f - 166拮抗恶苗病
　图 1　内生真菌与植物病原菌平板对峙试验
　Fig. 1　Dua l cu lture be tween endophytes and pa thogens
3　讨 论
从近年来的研究看 ,植物体中存在内生真菌是
普遍的。内生菌系统地分布于植物体根 、茎 、叶 、花 、
果实和种子等器官 、组织的细胞或细胞间隙。有报
道说 ,内生真菌菌丝在宿主植物的叶鞘和种子中含
量最多 ,而叶片和根中含量极少 [ 9] 。但是也有报
道 ,根和叶内生真菌含量较多[ 10] 。不同的植物可能
具有的内生真菌的种类和数目相差很大 。我们从中
药植物小连翘的根 、茎 、叶共分离出 81株内生真菌 ,
分属于 4 个目 , 5 个科 , 26 个属。头 孢霉属
(Cepha losporium sp. )在小连翘根 、茎 、叶内生真菌的
分离过程中都得到 ,它既是叶内的优势菌群也是整
个植物的优势菌群;丝核菌属 (Rh izocton ia sp. )分离
获得的数量比较多 ,但是它仅仅是根内的优势菌群。
植物内生真菌生活在活体植物组织中 ,其生长
代谢受多方面因素制约 ,不仅受到宿主植物的影响 ,
外界环境因子也是其重要影响因素。外界环境变化
直接影响植物生长代谢 ,间接影响到植物内生菌生
物多样性与生长代谢。从小连翘的根 、茎 、叶不同部
位分离的内生真菌在数量 、种类有很大的差异。小
连翘的大部分内生真菌主要存在于叶和根部 ,而茎
中相对很少 ,这表明不同的内生菌在植物不同器官
310
广东药学院学报 , 2007, 23(3)
和组织中占据不同的生态位。其原因可能是由于不
同部位的微环境如通气状况 、生物酶和其他化学成
分的不同 ,从而适合不同种属的内生真菌类群的侵
入和生长。
迄今的研究表明 ,植物内生菌与宿主发生联系
时 ,对宿主有以下影响:可增强宿主的抗病性 、提高
植物的生产力[ 11] 、抗逆抗虫 [ 12] 、具有除草剂活性[ 13]
等 。内生真菌对宿主的作用机制可能是由于内生菌
在植物体内繁殖和生长 ,并产生丰富多样具有生物
活性的次生代谢产物 ,从而在一定程度上调节植物
的生长和代谢。通过对峙试验研究小连翘内生真菌
对纹枯病菌 、白叶枯病菌 、恶苗病菌和棉花枯萎病菌
等植物病原菌的拮抗性 ,结果发现 ,小连翘内生真菌
中多数种类 (约 52. 48%)能够抑制一种或者多种病
原菌的生长 ,这表明小连翘内生真菌中存在着广泛
的抗菌生物活性资源 ,这些内生真菌及其代谢产物
在植物对抗病原菌的过程中占有一定的地位。由此
可见 ,药用植物内存在着广泛的内生真菌 ,这些内生
真菌可能成为生物防治中有潜力的生物因子 ,在生
态农业和生物农药研制方面具有重要的用途。研究
内生真菌的各种次生代谢产物及其作用机制 ,在农
业和(或 )医药业中具有重要的应用潜力。研究和
开发植物内生真菌 ,从而为寻找植物病害的抗菌药
用资源提供了一条新的途径。
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(上接 306页 )
提示岗梅水提取物具有显著的抗炎作用 ,且其抗炎
机制之一可能与减少炎症组织中 PGE2合成有关 。
本研究对岗梅清热解毒的功效进行了有益的探索 ,
其实验结果为岗梅及相关凉茶的应用提供了一定的
实验依据 ,但岗梅水提取物抗炎的作用机制及水提
取物中发挥抗炎的物质基础尚需进一步研究。
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