全 文 ：西北农业学报　2011 , 20(1):98-101
Acta A griculturae Boreali-occidentalis Sinica
红叶甜菜的直接生芽和茎伸长组培苗内源激素的检测＊
罗鑫娟 ,徐全乐
(西北农林科技大学 生命科学学院 ,陕西杨凌　712100)
摘　要:红叶甜菜的茎尖外植体在含有 BA15.0 mg· L-1的 MS 培养基上生长约 45 d 时 ,在膨大叶片的边缘
可见不定芽的直接产生。石蜡切片观察结果显示 ,该过程为典型的器官发生途径。将不定芽切割后在相同配
方的培养基上继续培养 ,绝大部分组培苗表现出和野生型一致的表型 , 呈莲座叶;个别组培苗的茎伸长 ,呈螺
旋叶序。HPLC 检测结果显示 , 正常组培苗和茎伸长组培苗的内源生长素和赤霉素含量基本无差异。
关键词:红叶甜菜;离体微繁殖;直接生芽;茎伸长
中图分类号:S681.9;Q943.1　　　　文献标志码:A　　　　　文章编号:1004-1389(2011)01-0098-04
Direct Shoot Formation of Beta vulgaris L.var cicla L.and Endogenous
Hormones Analysis of Regenerated Plantlet with Stem Elongation
LUO Xinjuan and XU Quanle
(College of Life Sciences , Northw es t A&F University , Yanglin g S haanxi　712100 , Chin a)
Abstract:Adventi tious shoots w ere di rect ly fo rmed from expanded leaf of shoo t tip explants of red leaf
beet(Beta vulgaris L.var cicla L .)when these explants w ere cul tured on M urashige and Skoog
(MS)medium with 15.0 mg ·L-1 6-benzy laminopurine(BA)for about 45 days.The results of paraf-
f in sections demonst rated that the adventi tious shoo ts w ere formed through org anogenesis.When the
adventitious shoots w ere subcultured on the same medium as the above , the most regenerated plant-
lets show ed the same pheno types like rosette leaves as the w ild type.While the stem w as elongated in
several regenerated plant lets and show ed spiral phy llo taxis.The resul ts of high-performance liquid
chromatog raphy (HPLC)analy sis show ed that the lev el of endogenous IAA and GA in regenerated
plant le ts w ith no rmal pheno types and elongated stem respectively w as very low er and shared li t tle
dif ference.
Key words:Beta vulgaris L.var cicla L;In vi tro micropropagat ion;Direct shoot forma tion;Stem
elongation
　　到目前为止 ,甜菜属作物仍然是难以进行组
织培养的作物之一[ 1] ;对该属作物进行组织培养
的研究主要集中在糖用甜菜上[ 1-6] ,对于叶用甜菜
的相关研究较少[ 6] 。而叶用甜菜作为中国仅有的
甜菜种质资源 ,对其进行保护和开发利用具有十
分重要的意义[ 7] 。
红叶甜菜(Beta vulgaris L.var cicla L .)属
于藜科甜菜属 ,是叶用甜菜的一个变种 ,为 2 a生
草本植物 。因其叶色红褐而常作为观叶植物用于
花坛布置[ 8] 。同时 ,由于其耐盐[ 9] 、耐低温[ 7] 而被
认为是甜菜的潜在育种资源。目前 ,对于红叶甜
菜的研究主要集中于天然红色素的相关研究及其
在食品工业中的应用[ 10-13] ;对其进行组织培养的
相关研究较少 。Xu 等[ 6] 以茎尖 、叶柄 、叶片和下
＊ 收稿日期:2010-04-13　　修回日期:2010-05-20
基金项目:西北农林科技大学人才专项资金(Z111020912, Z111020831)资助。
第一作者:罗鑫娟 ,女 ,博士 , 讲师。从事植物细胞结构与功能研究。
通讯作者:徐全乐。 E-m ail:x uql03@163.com
胚轴为外植体建立了红叶甜菜的离体再生体系。
该体系以 BA(6-苄基嘌呤)作为单一诱导激素 ,采
用无菌苗预培养 、愈伤组织诱导和不定芽分化的
培养步骤 ,取得了较高的分化频率;但实验步骤较
为繁琐 ,体细胞突变概率增大。本文首次报道了
红叶甜菜在无菌苗预培养后茎尖外植体的直接生
芽和再生过程中茎伸长组培苗的产生 。目前 ,已
知茎的伸长和赤霉素与生长素的含量相关[ 14] ,因
此 ,对正常组培苗和茎伸长组培苗的内源生长素
和赤霉素含量进行了 HPLC检测。
1　材料与方法
1.1　植物材料及无菌苗的获得
试验用红叶甜菜种球由西安市园林研究所提
供。
将红叶甜菜种球用浓硫酸浸泡(w=98.3%)
15 min后 ,流水冲洗 5 min;再依次用乙醇(φ=
70%)浸泡 1 min ,1 g · L-1升汞浸泡 8 min ,无菌
蒸馏水冲洗 3次后 ,接种于无激素 MS培养基上 ,
25 ℃培养。照度 2 000 lx ,光照时间 16 h·d-1 。
1.2　不定芽的分化和根的形成
参考 Xu等[ 6] 的方法 ,待无菌苗萌发一周后
取茎尖为外植体 ,转移至含有 BA15.0 mg ·L-1
的 MS 培养基上于 16 ℃下进行不定芽的诱导。
“1.1”和“1.2”中所有培养基均添加 30 g ·L -1蔗
糖和 7 g ·L-1琼脂 ,pH 调为 5.8 ,并于 120 ℃灭
菌 20 min 。待不定芽高约 2 cm 时 ,将其转入无
激素 1/2M S 固体培养基 , 蔗糖质量浓度为 10
g ·L-1 ,于 16 ℃下进行生根培养 。
1.3　组织学观察
将茎尖外植体上形成的不定芽于 FAA(V
(甲醛)∶V(乙酸)∶V(乙醇)=5∶5∶90)固定液
中固定 24 h。按照郑国锠等[ 15] 方法 ,梯度酒精脱
水后 ,用石蜡进行包埋 。旋转式切片机切片后
(AO 820 , USA),用 0.5%苏木精染色。于显微
镜(motic B5 pro fessional series)下观察照相 。
1.4　内源激素的提取和 HPLC检测
取红叶甜菜正常组培苗和茎伸长组培苗各
1 g ,参考 Xu等[ 16] 方法进行内源 IAA(生长素)和
GA(赤霉素)的提取 。
采用 Agilent 1100 series 反向高效液相色谱
检测植株内源激素含量 。检测条件为 varian C18
反向分析柱(250 mm ×4.6 mm ×5 μm), 波长
274 nm ,流动相(V(水)∶V(甲醇)∶V(乙腈)=
60∶16∶24)流速 1 mL ·min-1 ,柱压约 260 ,柱
温为室温(15 ℃左右),进样量 20 μL。
2　结果与分析
在含有 BA2.0 mg ·L-1或 15.0 mg · L-1的
MS 培养基上预培养后再转至含有 BA15.0
mg ·L -1的 MS 培养基上时 ,红叶甜菜的茎尖外
植体先形成颗粒状的愈伤组织 ,继而分化出不定
芽[ 6] 。实际上 ,茎尖外植体在相同的培养条件下
可不经愈伤组织阶段而直接分化出不定芽。当茎
尖外植体在含 BA15.0 mg ·L-1的 MS 培养基上
培养 45 d左右时 ,明显可见叶片的膨大;在叶柄
的一侧 ,可见直接分化的不定芽(图 1-A ,-B)。将
不定芽切割后在生根培养基上生长约 30 d时 ,可
见有不定根的形成(图 1-D)。石蜡切片的分析结
果显示 ,叶柄上具有多处分生组织(图 1-G),该过
程是典型的器官再生途径 。
将上述不定芽切割后在相同配方的培养基上
进一步培养 ,绝大部分不定芽可形成与野生型表
型一致的组培苗 ,呈莲座叶。但个别组培苗表现
为茎伸长 ,呈螺旋叶序(图 1-E),类似于红叶甜菜
的抽薹。将该种组培苗生根移栽后发现并未表现
出和抽薹开花一致的性状(图 1-F)。因而推测是
茎的伸长导致螺旋叶序的产生 。
为了研究红叶甜菜茎伸长与内源激素水平之
间的关系 ,笔者利用高效液相色谱对正常组培苗
和茎伸长组培苗的内源 IA A 与 GA 含量进行了
比较 。结果显示:两种组培苗的第一个峰出峰时
间分别为 3.993和 3.980 ,根据标样的出峰时间
判断为 GA;第二个峰的出峰时间分别为 5.020
和 4.997 ,根据标样的出峰时间判断为 IAA 。可
以发现 ,内源赤霉素与生长素峰的峰高和峰宽在
两种组培苗中基本相当(图 1-H ,-I),说明在两种
组培苗中的内源GA 和 IAA 水平相当。
3　讨论
不定芽在甜菜外植体上直接发生的现象已有
报道[ 4 , 17] 。卫群和张剑锋[ 17]用预培养 、诱导分化
培养两步法 ,在附加 BA1.0 mg ·L-1和 NAA0.3
mg ·L -1的 MS 培养基上使甜菜叶柄外植体直接
分化出芽;段肖霞等[ 4] 以甜菜子叶节和茎节为外
植体 ,在含有 BA0.2 ～ 1.2 mg · L-1和 NAA 0.2
～ 1.0 mg ·L-1的 MS 培养基上诱导不定芽的直
接发生 。这些研究 中所用的 BA 质量浓度
·99·1 期　　　　　　　　罗鑫娟等:红叶甜菜的直接生芽和茎伸长组培苗内源激素的检测
　　A.茎尖外植体上的叶片直接生芽 Direct shoots formation f rom expanded leaf of s hoot tip explant;B.分化出的较大的不定芽 Larger
adventi tiou s shoots;C.从外植体上分割下来的不定芽 S eparated adventi ti ou s shoots f rom explant;D.再生苗 Regenerated plant let;E.茎
伸长的红叶甜菜组培苗 Regenerated plant let s w ith elongated s tem;F.移栽后的茎伸长组培苗 Regenerated plan tlet w as t ransplanted into
soi l;G.不定芽分化处形成的分生组织(箭头所示)Meristem s appeared f rom paraf fin sections(arrow s);H.正常组培苗的内源 IAA 和
GA 含量检测 Endogen ou s IAA and GA analysi s of regenerated plant lets wi th norm al phenotypes;I.茎伸长组培苗的内源 IA A和 GA 含
量检测 Endogenous IAA and GA analy sis of regenerated plan tlet s wi th elongated stem.
图 1　红叶甜菜茎尖外植体的直接生芽及茎伸长组培苗的内源激素检测
Fig.1　Direct shoots formation of red leaf beet and endogenous
hormone analysis of regenerated plantlets with elongated stem
均较低 ,并且在诱导芽分化时采用了 BA 和 NAA
的复合激素配比 。而本研究单独添加高质量浓度
的 BA ,使红叶甜菜茎尖外植体上膨大叶片的边
缘直接生芽 ,这可能与红叶甜菜本身的内源生长
素水平较高有关[ 6] ;而且采用单一激素进行芽分
化的诱导 ,已在甜菜[ 18] 、大豆[ 19] 、甜瓜[ 20] 、红叶甜
菜[ 6]等多种植物中有过报道 。石蜡切片观察结果
说明 ,这一过程为典型的器官再生途径。 Todi
等[ 21]也认为 ,甜菜组织离体培养中再生植株真正
有效的途径是通过直接的器官发生 ,其优势在于
降低了体细胞突变的概率 。
本研究得到的不定芽在进一步的培养中发现
有茎伸长现象。目前的研究表明 , GA 和 IAA 的
含量变化均与茎的伸长有关[ 14] 。实际上 ,赤霉素
信号通路与细胞分裂素信号通路可以发生交
迭[ 22] ;生长素也可以调控细胞分裂素信号[ 23] 。本
研究中 ,只是在培养基中添加了外源的 BA 就可
以引起茎的伸长;这可能是外源 BA 的添加引起
了内源 GA 和 IAA 水平的改变。正常组培苗和
茎伸长组培苗的内源生长素与赤霉素含量比较显
示:内源 IAA与 GA 在两种组培苗中的含量均较
低且基本相当;推测是由于高质量浓度 BA 对
GA 与 IAA 的拮抗作用造成的 。在这种状况下 ,
可能是顶端分生组织区域内的激素平衡决定了茎
的伸长。
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