全 文 ：第 45卷　增刊　　　　　　　　　　　厦门大学学报 (自然科学版 )　　　　　　　　　　　　Vo.l 45　Sup.
2006年 5月　　　　　　　　　　 Journal ofX iam en Un iversity (Natural Science)　　　　　　　　　　May 2006
　　收稿日期:2005-12-20
　　作者简介:李东霄(1968 -),男 ,博士研究生.
　　*通讯作者:chen lg@ xm u. edu. cn
南方菟丝子 18S rRNA基因片段的
克隆与序列分析
李东霄　陈　亮*
(厦门大学生命科学学院 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,福建 厦门 361005)
摘要:根据拟南芥光敏色素 B基因序列设计引物 , RT-PCR扩增南方菟丝子同一基因相应片段 , 扩增使用了 TD PCR技
术 , 同时获得 3个特异基因片段 , 对长约 300 bp的片段克隆后进行序列分析 , 显示该片段与沼泽菟丝子和拟南芥 18S
rRNA基因相应片段的一致性分别为 98. 9%和 97%, 结果表明 ,该片段为南方菟丝子 18S rRNA基因片段.
关键词:南方菟丝子;TD(Touch Down)PCR;18S rRNA;序列分析
中图分类号:Q 949　　　　　　文献标识码:A　　　　　　文章编号:0438-0479(2006)S-0060-03
　　菟丝子属 (Cuscuta spp)隶属于旋花科 (Convolvu-
laceae),为寄生草本植物成熟菟丝子的根 、叶已退化 ,
大多数种类的植株呈黄色.有些种类尽管含有叶绿素 ,
但不能维持其自养生活 ,而必须通过吸器从寄主体内
吸取养分.生长一段时间后 ,菟丝子即可自下而上边开
花边结实成熟 ,持续时间长达 40余天.种子越冬后 ,有
些可在第 2年的春天萌发 ,并侵染寄主.
在我国 ,一些菟丝子种类常作为补益中药 ,多次药
材调查表明 , 南方菟丝子 (Cuscu ta austra lis R. B r. )已
成为商品药材的主流品种 ,具有滋补肝肾 、固精缩尿 、
安胎 、明目等功效 [ 1] .而且 ,近年来 ,利用菟丝子寄主
范围广泛 、寄生后大量吸收寄主养分 、生长迅速且大量
蔓延最终导致寄主因养分不足而生长受到抑制甚至死
亡的生物学特性 ,成功将其应用于防治一些外来物种
的入侵 ,如对薇甘菊的生物防治 [ 2] .
本研究为在使用特异引物运用 TD PCR技术扩增
南方菟丝子光敏色素 B基因时 ,同时扩增出其 18S
rRNA的基因片段 ,并进行了序列分析. 18S rRNA基因
是一类编码核糖体小亚基 RNA的 DNA序列 ,约有 1
800 bp,因为在进化中非常保守 ,因而在分子进化系统
研究中得到广泛的应用.
1　材料与方法
1. 1　材　料
南方菟丝子种子由河南中医院陈新惠赠.
1. 2　南方菟丝子总 RNA的提取
总 RNA由接种 8 d后的萌发幼苗中提取 ,试剂为
Trizo l Reagent(Ca.t No. 15596-026, Inv itrogen),方法
参照其说明书.
1. 3　南方菟丝子 cDNA的合成
使用试剂 Ready-To-Go You-Prime First Strand
Beads (product code:27-9264-01, Amersham B iosci-
ences )合成 cDNA第一链 ,方法参照其说明书进行.
1. 4　南方菟丝子 18S rRNA基因片段克隆的
分离及测序
(1)PCR扩增及产物的检测:扩增引物为:Sense :
5′-CTTTCTATTGCTGGTGCTGT-3′;An tisense:5′-AGC-
CTAACCATCTCTCTTGC-3′.引物通过已报道的多种植
物光敏色素 B蛋白质及核苷酸序列的排列比对 ,根据
拟南芥相应基因序列上的两个保守区设计合成. RT
PCR采用合成的菟丝子 cDNA第一链 ,应用热启动结
合 TD PCR进行. PCR反应条件为:94℃ 5 m in;暂停 ,
加入 Taq酶;94℃ 45 s;退火温度由 59℃开始 ,每降
1℃, 2个循环 ,共进行 30个循环 ,最后于 43℃进行 10
个循环 ,每个循环均于 72℃延伸 90 s;72℃ 7m in. PCR
产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 ,得到特异性扩增片段. 引
物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 , PCR
仪为 T-G rad ient(德国 B iome tra公司 ), PCR所用试剂
购于宝生物 (大连 )生物工程有限公司.
(2)PCR扩增产物的回收和纯化:按照小量胶回
收试剂盒的说明书进行 ,试剂盒购于上海华舜生物工
程有限公司.
(3)PCR产物与载体的连接:按 pMD-18T载体使
增刊 李东霄等:南方菟丝子 18S rRNA基因片段的克隆与序列分析 61　
用说明书进行 , pMD-18T载体购于宝生物 (大连 )生物
工程有限公司.
(4)质粒转化 、筛选及 PCR检测质:粒转化和筛选
参照《分子克隆实验指南》[ 3] , PCR检测使用常规 PCR
方法.
(5)目的片段测序:由 Inv itrogen B iotechno logy
Co. , L td提供测序.
2　实验结果
2. 1　PCR扩增结果
将上述引物同提取的南方菟丝子 cDNA进行 TD
PCR扩增后 ,得到 3条扩增片段 ,长度分别约为 1 500、
650及 300 bp左右 ,如图 1.
　图 1　TD PCR扩增产物电泳分析
　F ig. 1　Agro se gel e lec tropho resis ana ly sis of TD PCR p roduct
2. 2　重组质粒的筛选和 PCR鉴定
将含有约 300 bp目的片段的重组质粒转化大肠
杆菌 DH5α,涂 Ampr抗性平板 , 37℃培养 12 h后 ,随
机挑取 6个生长正常的菌斑 ,分别加入 1 mL Ampr抗
性的 LB培养基中 ,培养过夜后 ,分别取 1 μL菌液作
模板 ,进行常规 PCR,结果如图 2.
2. 3　目的片段的测序分析
对 PCR结果呈阳性的上述克隆测序 ,结果显示:
包括引物序列 ,目的片段长 303 bp.将序列在 NCBI上
进行核苷酸比对 ,显示序列 4 ～ 289之间与沼泽菟丝子
(Cuscuta gronoviiW illd, gi:532575)693 ～ 978片段间有
98%的核甘酸相同. 将去除两端引物序列的目的片段
与沼泽菟丝子和拟南芥 (Arabidopsis thaliana , G eneID:
3767991)于 DNAMAN(V erson 5. 2. 2)中进行比对 ,显
示其与上述两种植物的同源性分别为 98. 9%和 97%,
如图 3. 因而可确定该序列为南方菟丝子编码 18S
rRNA的 DNA片段.
　图 2　PCR检测结果
　F ig. 2　Agro se gel e lec tropho resis ana ly sis of PCR product
3　讨　论
在 PCR扩增过程中采用的 TD PCR技术 , 适用的
范围很宽 ,如:欲依据氨基酸序列推算出的 DNA序列
为据扩增多基因家族某特定成员 ,或根据已有序列扩
增另一物种的同一基因序列.极端的情况下 ,甚至可以
用与模板碱基不完全匹配 、有时甚至是靠近引物 3′端
碱基不匹配的引物自基因组 DNA扩增出强阳性带 [ 4] .
本研究所属情况为上述例举的根据已有序列扩增另一
物种的同一基因序列.因而 ,引物与目的片段间存在非
匹配碱基 ,这可能也是其产生非特异性扩增产物的原
因之一 ,但同时 ,采用 TD PCR技术 ,与采用常规 PCR
方法无法获得明显可分辨的扩增条带相比 ,则表现出
了高度的特异性.
在分子进化系统研究中 , 18S rRNA基因序列得到
了广泛地应用 ,如:K ranz和 Huss[ 5]由此探讨了蕨类植
物的分子进化及其与种子植物的关系 , Chaw等[ 6]探
讨了裸子植物的分子系统发育及种子植物的进化 ,
N ickrent和 So ltis[ 7]利用 rbcL序列和 18S rRNA序列构
建了被子植物的系统树. V an der Koo ij等[ 8]在研究了
6种菟丝子属植物质体的结构 、功能以及基因 rbcL及
其转录特性后认为 ,在菟丝子属植物的进化过程中 ,存
在光合作用能力衰退演化的各个不同阶段.因而 ,不同
种类菟丝子的 18S rRNA基因的克隆以及系统学研
究 ,将有助于进一步揭示寄生植物菟丝子这类特殊被
子植物的进化历程.
参考文献:
[ 1] 　叶敏 , 阎玉凝. 菟丝子药理研究进展 (综述) [ J] . 北京
中医药大学学报 , 2000, 23(5):52 -53.
[ 2] 　廖文波 , 凡强 , 王伯荪 , 等. 侵染薇甘菊的菟丝子属植物
及其分类学鉴定 [ J] . 中山大学学报:自然科学版 , 2002,
41(6):54 - 56.
[ 3] 　萨姆布鲁克 J , 拉塞尔 DW. 分子克隆实验指南 [ M ] .
62　 厦门大学学报(自然科学版) 2006年
　图 3　南方菟丝子 、沼泽菟丝子及拟南芥 18S rRNA基因片段比较
　F ig. 3　A lignm ent of nuc leo tide sequences ofCuscuta australis, Cuscuta gronovii and Arabidopsis thaliana
　　3版. 黄培堂 , 王嘉玺 , 米厚础 , 等译. 北京:科学出版社 ,
2002.
[ 4] 　 Roux K H. Using m ism a tched prim er-temp la te pairs in TD
PCR[ J] . B ioTechnique s, 1994, 16:812 - 814.
[ 5] 　K ranz H D, Huss V A R. Mo lecu lar evo lution of pte rido-
phytes and the ir rela tionship to seed plan ts:ev idence from
com ple te 18S rRNA gene sequence s[ J] . P .l Sys.t Evo .l ,
1996, 202:1 - 11.
[ 6] 　Chaw SM , Zha rkikh A, Sung H M , e t a .l Mo lecu lar phy-
logeny of ex tant gymnospe rm s and seed plant evo lution:ana l-
y sis of nuc lea r18S rRNA sequences[ J] . Mo .l Bio.l Evo.l ,
1997, 14(1):56 -68.
[ 7] 　N ickrent D L, So ltis D E. A com parison o f ang iospe rm phy-
logen ie s from nuclear 18s r DNA and rbcL sequence s[ J] .
Ann. M issour.i Bo.t G ard, 1995, 82:208 - 234.
[ 8] 　Van derKoo ij T A W , Krause K, Do^ rr I, e t a.l Mo lecu la r,
func tiona l and ultrastruc tural cha racte rization of plastids from
six spec ies of the pa rasitic flow ering plant g enus Cuscu ta
[ J] . P lan ta, 2000, 210:701 -707.
Cloning and Sequence Analysis of 18S R ibosomalRNA Gene
Fragment from Cuscuta australis R. Br.
LIDong-xiao, CHEN L iang*
(Key Laboratory of theM in istry of Educa tion for Cell B iology and Tumor Cell Eng ineering,
Schoo l of Life Sc iences, X iam en Un iv. , X iamen 361005, China)
Abstract:The prim er was designed accord ing to two conserved regions of Phytochrom e. B ofArabidopsis tha liana to amplify the same
gene fragment from Cuscu ta australis R. B r. cDNA by Touch Dow n PCR. Three gene fragments w ere obta ined. One of the fragments a-
bout 300 bp w as cloned and sequenced, and the sequence ana lysis result showed the nucleotide sequence of this gene fragmentw as cons ist-
ent w ith the sequence of the correspondent segments of 18S ribosoma lRNA gene inCuscuta gronoviiW illd and Arab idopsis thaliana at the
un iform ity ra tes of 98. 9% and 97% respective ly. The result reveals that it is 18S rRNA gene fragment ofCuscu ta australis.
Key words:Cuscu ta australis R. B r. ;Touch Dow n PCR;18S rRNA;sequence analysis