全 文 ：书收稿日期:2014-01-10; 修订日期:2014-06-30
基金项目:广东省科技计划项目(No． 2011B031700072);
广东省自然科学基金(No． S2013010013484、
9151063201000036);
广东省中医药局重点项目(No． 2008435);
广东食品药品职业学院院级项目(No． 2013YZ008)
作者简介:方春生(1978-)，男(汉族)，安徽无为人，广东食品药品职业学
院讲师，硕士学位，主要从事天然药物研发工作．
* 通讯作者简介:杨燕军(1963-)，女(汉族)，江西南昌人，广东省中药研
究所教授，主任药师，硕士学位，主要从事天然产物化学工作．
竹节蓼不同提取部位体外抗肿瘤活性的研究
方春生，杨燕军* ，宋 卉，付晓春
(广东食品药品职业学院，广东 广州 510520)
摘要:目的 研究竹节蓼体外抗肿瘤活性及确定其活性部位。方法 采用 MTT法和细胞形态观察法研究竹节蓼醇提物及
醇提物的 4 个不同提取部位对 4 种肿瘤细胞株 A549、PC － 3、SGC － 7901、HepG2 增殖的抑制作用及形态的影响，确定抗
肿瘤活性部位;采用 DAPI染色法研究乙酸乙酯部位对 A549 细胞凋亡形态学的影响。结果 竹节蓼醇提物、竹节蓼乙酸
乙酯和石油醚提取部位对上述 4 种肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制作用且具有剂量依赖关系，且均能显著改变细
胞形态;DAPI染色结果显示乙酸乙酯部位促进了 A549 细胞凋亡。结论 竹节蓼中具有抗肿瘤作用的活性物质，有效成
分集中在乙酸乙酯和石油醚提取部位。
关键词:竹节蓼; 抗肿瘤活性; 提取; MTT; 细胞凋亡
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 12． 019
中图分类号:Ｒ285． 6 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2014)12-2865-04
竹节蓼 Homalocladium platycladum，潮汕地区称为飞天蜈蚣、
蜈蚣竹、鸡爪蜈蚣、蜈蚣草，外地别名称为百足草等，为蓼科竹节
蓼属植物，分布于福建、广东、广西等地。竹节蓼药用历史悠久，
生物活性较强，具清热解毒，祛瘀消肿之功效，主治痈疽肿毒，民
间应用十分广泛［1］。虽然民间也常作为草方用于肿瘤治疗，并
且效果显著，然而迄今为止，对该植物几乎还没有进行有效的开
发和利用。据国内外文献检索，关于其药效活性仅有少量关于抗
菌的活性报道［2］，其化学成分研究至今未见报道。为此，我们对
产于广东澄海的竹节蓼干燥全草经过初步的提取分离后进行了
体外抗肿瘤活性实验研究，对不同浓度的竹节蓼醇提物及其乙酸
乙酯、石油醚、正丁醇和萃取残留 4 个不同部位采用 MTT 法和细
胞形态观察法考察其体外抗肿瘤作用并确定出活性部位，在此基
础上采用 DAPI荧光染色法研究了乙酸乙酯部位对肺癌细胞株
A549的细胞凋亡影响，为阐明竹节蓼的抗肿瘤作用，分离提取有
效成分和药用价值开发提供了理论依据。
1 材料与仪器
1． 1 药材 竹节蓼采自广东澄海，经广东食品药品职业学院刘晓
春副教授鉴定为蓼科竹节蓼属植物竹节蓼的干燥全草。
1． 2 药品与试剂 DMEM 液体培养基(已加抗生素)、标准胎牛
血清和胰蛋白酶为北京 Solarbio公司产品，MTT为碧云天生物技
术研究所产品，细胞级二甲基亚砜(DMSO)为 Biosharp 生物科
技公司产品，DAPI为广州威佳科技有限公司产品，乙醇、石油醚、
乙酸乙酯、正丁醇等其它试剂均为分析纯。
1． 3 细胞株 人肺癌细胞株 A549、人前列腺癌细胞株 PC － 3、人
胃癌细胞株 SGC － 7901 和人肝癌细胞株 HepG2 细胞株购自中山
大学实验动物中心。
1． 4 仪器 N －1001 旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司产品;
MK3 型酶标仪、MSC1． 2 超净工作台、Model 311CO2培养箱，美国
Thermo Forma 公司产品;Leica 倒置相差显微镜、Leica 荧光显微
镜，德国莱卡公司产品;BP211D 电子分析天平，德国 sartorius 公
司产品。
2 方法
2． 1 竹节蓼提取物的制备 取竹节蓼药材 1kg 粉碎至 20 ～ 30
目，加 5 倍量 95%乙醇浸泡 24h 再超声提取 30min(40kHz)，过
滤，药渣继续加 5 倍量 75%乙醇热回流一次 l h。过滤，药渣弃
掉，合并药液减压浓缩(温度不超过 60℃)药膏挥至无醇味，得醇
提物。醇提物加水分散后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，
与萃取残留物一并分别浓缩回收，真空干燥温度均不超过 60℃。
准确称取竹节蓼醇提物及 4 个不同部位的浸膏，以少量 DMSO溶
解后，加入 DMEM培养基配制成浓度为 20． 0 mg /ml 的竹节蓼醇
提物和浓度为 1． 0 mg /ml的各萃取部位药液的储备液，紫外照射
灭菌后 4℃冰箱保存，使用时以完全培养基稀释至所需浓度。
2． 2 MTT 法 将 DMEM培养基培养的 A549、HepG2、SGC － 7901
和 PC － 3 四种细胞株处于对数生长期时用胰酶消化成细胞悬
液，按每空 5 × 103 个细胞接种于 96 孔板中，待细胞完全贴壁后，
弃去原培养基，加入配置好的含不同药物浓度的新鲜完全培养
基，药物终浓度见图 1 ～ 3，空白对照组只加入完全培养基。设 5
个平行孔，细胞给药后培养 24 h，结束前 4h 每孔加入 MTT (5． 0
mg /ml)溶液 20μl，继续培养 4 h，弃去培养基，每孔加入 150μl
DMSO ，待完全溶解后，酶标仪测定 492 nm 处的吸光度(A )值。
以 5 个复孔的平均值代入下列公式计算:细胞抑制率(%)= (1
－ A加药 /A对照) × 100%。
2． 3 细胞形态学观察 分别取浓度为 5 × 104 /ml 的 A549、
HepG2、SGC － 7901 和 PC － 3 细胞株于 6 孔板中培养，待细胞完
全贴壁后，弃去培养基，分别加入浓度为 2 mg /ml 和 4 mg /ml 醇
提物与浓度为 250μg /ml 各提取部位的含药培养基，作用 24 h
后，在倒置相差显微镜下观察各组细胞形态的变化。
2． 4 DAPI染色法 取消化后的对数生长期 A549 细胞，按照 5 ×
103 细胞每孔接种到 96 孔板中，100μl /孔。待细胞贴壁后换液，
加入不同浓度的竹节蓼乙酸乙酯萃取物，组别:空白、50，100，
250μg /ml，每种药物设置 5 个复孔，每次培养 24h。24h后吸除孔
中液体，PBS轻轻洗 3 次，每孔加入甲醇配置的 DAPI 染液 50μl，
孵育 20min后，弃染液，甲醇轻轻洗 2 次，立即置于荧光显微镜下
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 12 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 12 期
观察。
2． 5 统计学处理 结果以 珋x ± s表示，用 SPSS 17． 0 统计学软件进
行 IC50计算。
3 结果
3． 1 竹节蓼醇提物对肿瘤细胞株增殖的影响 MTT 实验结果显
示竹节蓼醇提物可显著抑制人肺癌细胞 A549、人前列腺癌细胞
PC － 3、人胃癌细胞 SGC － 7901、人肝癌细胞 HepG2 的增殖，且具
有剂量依赖关系。竹节蓼醇提物对上述 4 种细胞的最大抑制率
分别为 68． 43% 、78． 73% 、71． 91% 和 46． 46%，其中前三种肿瘤
细胞的 IC50分别为 4． 89、4． 28、4． 81 mg /ml，如图 1。HepG2 在醇
提物低浓度时反而显示促进了生长，在浓度较高时才显示出细胞
生长抑制性，显示了具有多种成分的植物提取物作用的复杂性。
3． 2 竹节蓼醇提物对肿瘤细胞株细胞形态的影响 在倒置显微
镜下观察各组细胞形态，可见对照组的 A549、、PC － 3、SGC －
7901和 HepG2 细胞贴壁生长，大小均匀，胞质透亮，折光性好，增
殖旺盛。经不同浓度的竹节蓼醇提物处理 24 h 后，前 3 种肿瘤
细胞密度均明显减小，大部分细胞形态发生变化，细胞变圆，体积
缩小，细胞间距增大;HepG2 细胞在药物浓度达到 4 mg /ml 才表
现出上述现象，在 2 mg /ml时，细胞透明度虽有变化，但细胞数量
却见增多，见图 2。实验结果显示竹节蓼醇提物可显著改变
A549、PC － 3、SGC － 7901 细胞株形态，降低细胞密度，引起癌细
胞发生凋亡或坏死。HepG2 细胞在浓度为 2 mg /ml 给药组还表
现出生长旺盛，与 MTT结果吻合，而在高浓度时则显示出了抑制
细胞生长、改变细胞形态的作用。
图 1 竹节蓼醇提物对 4 种肿瘤细胞株增殖的抑制作用(n = 5)
(a)A549 对照组;(b)A549 醇提物(2 mg /ml)给药组;(c)A549 醇提物(4 mg /ml)给药组;
(d)PC － 3 对照组;(e)PC － 3 醇提物(2 mg /ml)给药组;(f)PC － 3 醇提物(4 mg /ml)给药组;
(g)SGC － 7901 对照组;(h)SGC － 7901 醇提物(2 mg /ml)给药组;(i)SGC － 7901 醇提物(4 mg /ml)给药组;
(j)HepG2 对照组;(k)HepG2 醇提物(2 mg / ml)给药组;(l)HepG2 醇提物(4 mg /ml)给药组;
图 2 竹节蓼醇提物对 4 种肿瘤细胞株形态的影响
3． 3 竹节蓼不同提取部位对肿瘤细胞株增殖的影响 MTT 实验
结果显示竹节蓼乙酸乙酯相与石油醚提取物可显著抑制 A549、、
PC － 3、SGC － 7901 和 HepG2 的增殖，且具有剂量依赖关系。竹
节蓼乙酸乙酯提取物对上述 4 种细胞的最大抑制率分别达到
90． 47%、93． 22%、74． 47% 和 84． 34%%，IC50分别为 71． 88、
94． 41、296． 14 和 207． 66μg /ml。见图 3。竹节蓼石油醚提取物
对上述 4 种细胞的最大抑制率分别达到 92． 26%、89． 99%、87． 69
和 70． 99%，IC50分别为 101． 29、271． 57、226． 57 和 275． 60μg /ml
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(见图 3)。正丁醇相提取物和萃取残留物对上述 4 种细胞株生
长均无抑制作用，萃取残留部位反而促进了 SGC － 7901 肿瘤细
胞的明显生长。实验结果显示竹节蓼乙酸乙酯与石油醚提取部
位对上述 4 种肿瘤细胞的生长均显示显著的抑制作用，为竹节蓼
体外抗肿瘤的活性部位;乙酸乙酯部位的抗肿瘤活性最强，4 种
肿瘤细胞中 A549 对活性物质最为敏感。
3． 4 竹节蓼不同提取部位对肿瘤细胞株形态的影响 倒置显微
镜下各对照组细胞贴壁生长良好，形态大小均匀，胞质透亮，增殖
旺盛。如图 4 所示，4 种肿瘤细胞经过浓度为 250μg /ml 的乙酸
乙酯部位、石油醚部位给药处理 24h 后，均显著改变了细胞的形
态，表现为细胞密度明显减小，细胞收缩变圆，细胞间距变大，贴
壁作用减弱。正丁醇部位和萃取残留部位给药组对 4 种细胞株
密度影响不明显，SGC － 7901 细胞株经萃取残留部位处理后反而
促进了生长。形态上正丁醇部位和萃取残留部位给药组 A549 细
胞形态几乎没有变化;正丁醇部位 PC － 3 细胞形态有变化，表现
为细胞变圆，体积变小，胞浆内有颗粒物生成，而萃取残留部位给
药组细胞形态则基本无变化;正丁醇部位 SGC － 7901 细胞有部
分皱缩变圆，与邻近细胞分离，但个数不多，而萃取残留部位给药
组细胞形态基本没有变化;萃取残留部位给药组 HepG2 细胞也
有少数部分皱缩变圆，与邻近细胞分离，而正丁醇部位给药组细
胞形态基本没有变化。实验结果表明，竹节蓼乙酸乙酯部位和石
油醚部位可显著改变 4 种肿瘤细胞形态，抑制细胞生长。
3． 5 竹节蓼乙酸乙酯部位对 A549 细胞凋亡形态学的影响 DA-
PI染色结果显示，对照组细胞饱满，胞浆丰富，胞核圆形或椭圆
形，染色质荧光着色均匀。加药组明显看到细胞数量减少，细胞
核体积变小、皱缩，可见致密浓染荧光，染色体 DNA 呈浓染的团
块状、颗粒状分布，提示出现了明显的凋亡特征，且凋亡细胞数目
随着药物浓度的增加而增加，见图 5。
A －人肺腺癌细胞 A549
B －人前列腺癌细胞 PC － 3
C －人胃癌细胞 SGC － 7901
D －人肝癌细胞 HepG2
图 3 竹节蓼不同提取部位对 4 种肿瘤细胞株增殖的影响(n = 5)
4 讨论
近年来，从中草药中提取的抗肿瘤有效成分日益得到人们的
重视，类药物疗效突出、不良反应小等特点，在治疗肿瘤的药物使
用中，植物来源药物占了越来越多的比例［3，4］。据不完全统计，
来源于植物药的抗癌制剂，占总抗癌药的 32． 25%。至 20 世纪
末，世界上仅从高等植物中筛选出的抗肿瘤活性成分就已达 6． 7
万种［5］。我国的药用植物种质资源丰富，如果能将中药中抗肿瘤
有效成分筛选分离出来，明确其抗肿瘤作用及机理，对于抗肿瘤
药物的研制开发以及肿瘤治疗具有非常重要的意义。
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A －人肺腺癌细胞 A549;B －人前列腺癌细胞 PC － 3;C －人胃癌细胞 SGC － 7901;D －人肝癌细胞 HepG2
a － 乙酸乙酯部位(250μg /ml);b － 石油醚部位(250μg /ml)c － 正丁醇部位(250μg /ml);d － 萃取剩余部位(250μg /ml);
图 4 竹节蓼不同提取部位对 4 种肿瘤细胞株形态的影响
1 －对照组;2 ～ 4 － 50、100、250μg /ml竹节蓼乙酸乙酯部位
图 5 DAPI染色法观察竹节蓼乙酸乙酯部位
对 A549 细胞凋亡形态学的影响
MTT法是目前各实验室最常用的体外抗肿瘤药物筛选法，
该法具有不涉及使用放射性元素，所用试剂少，仪器简单，耗时
少，出结果快，结果与同位素掺入法一致等优点，适用于大量抗癌
药物的筛选［6］。本研究以人的肿瘤细胞为筛选模型，采用 MTT
法，以体外抗肿瘤活性为指标，首次对竹节蓼醇提物以及采用系
统溶剂法分离得到的 4 个不同提取部位进行了筛选，实验结果显
示竹节蓼醇提物能够抑制 A549、PC － 3 和 SGC － 7901 肿瘤细胞
的生长，且具有剂量依赖性，在高浓度时也抑制 HepG2 肿瘤细胞
的生长，在抑制肿瘤细胞生长的同时也明显改变了细胞的形态，
显示竹节蓼中具有抗肿瘤活性成分。对各提取部位的实验结果
显示竹节蓼的乙酸乙酯和石油醚提取部位都是其抗肿瘤作用的
活性部位，IC50结果显示乙酸乙酯部位抗肿瘤活性最强，对此部
位最敏感的肿瘤细胞是 A549，显微镜细胞形态观察结果也验证
了 MTT实验的结果。基于此，我们选择了活性最强的乙酸乙酯
部位和对其最敏感的肿瘤细胞 A549 进行了细胞凋亡研究，DAPI
染色结果显示肺癌细胞 A549 呈现出典型的凋亡现象:细胞核固
缩，染色质浓缩，断裂呈致密大小不等的蓝色荧光亮点，结果显示
竹节蓼乙酸乙酯部位的抗肿瘤活性成分诱导了 A549 细胞凋亡。
本实验为今后竹节蓼抗肿瘤有效成分的筛选及抗肿瘤作用
机理的研究提供了一定的理论依据。
参考文献:
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