全 文 ：狭叶四照花茎段的离体培养与植株再生
唐佳佳，刘翠玉，尚旭岚，洑香香
（南京林业大学森林资源与环境学院，南京 210037）
摘 要：建立高效的狭叶四照花组培快繁体系。以狭叶四照花茎段腋芽为外植体，研究基本培养基和植
物生长调节剂对不定芽诱导、不定芽增殖及生根诱导的影响。不定芽诱导过程中，9个组合处理对不定
芽诱导均有促进作用，其中WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA为最佳组合，萌发率达
到86.29%；最适宜不定芽增殖培养基为WPM+1.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA，增殖系数4.07；最适宜芽
苗生根培养基WPM+1.0 mg/L IBA，生根率达78.94%，生长状态优于其他处理。本实验建立的组培快繁
体系，适合狭叶四照花的植株再生。
关键词：狭叶四照花；不定芽；增殖系数；生根诱导
中图分类号：S722.3 文献标志码：A 论文编号：2014-0397
In vitro Culture and Plant Regeneration from Stem Segments of Dendrobenthamia angustata
Tang Jiajia, Liu Cuiyu, Shang Xulan, Fu Xiangxiang
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)
Abstract: The study aims to establish an efficient tissue culture system for rapid propagation of
Dendrobenthamia angustata. Using stem segments of Dendrobenthamia angustata as explants, effects of the
basic culture medium, different types and the concentrations of plant growth regulators on the germination of
axillary buds, proliferation of adventitious bud and rooting induction were examined. All nine hormone
combinations promoted germination of axillary buds to some extent and the most suitable hormone combination
was WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L KT+ 0.1 mg/L NAA, the germination rate achieved 86.29% at the
aforesaid conditions. The combination of WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA was the best treatment for the
culture of shoot induction, and the multiplication coefficient could reach 4.07. The treatment of WPM+1.0 mg/L
IBA had the best effect on rooting induction, and its rooting rate was 78.94% with superior growth performance.
The system of organization culture was suitable for regeneration of Dendrobenthamia angustata.
Key words: Dendrobenthamia angustata; adventitious bud; multiplication coefficient; rooting induction
0 引言
狭叶四照花 [(Dendrobenthamia angustata (Chun)
Fang)]为山茱萸科四照花属常绿灌木或小乔木，集观
叶、观花、观果于一身，具有较高推广和应用价值的观
赏树种[1-3]。大部分四照花属植物种子具深休眠的特
点，播种2年后才能发芽，严重影响了优良观赏种质资
源的繁殖和推广。无性繁殖能保持繁殖体的优良特
性，是种群扩繁的常用方法。尤其通过组织培养方法
对珍稀植物进行快繁研究，不仅可以克服有性繁殖中
存在的诸多问题，而且可以克服扦插繁殖速度慢、难生
根、繁殖率低的缺点，再加上组织培养具有繁殖快、不
受场地、季节和环境条件限制等诸多优点[4]。因此利
基金项目：“948”国家林业局引进项目“观赏性北美四照花种质资源及繁殖技术引进”(2012-04-60)；江苏高校优势学科建设工程；江苏高校协同创新
中心资助项目。
第一作者简介：唐佳佳，女，1990年出生，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事林木种苗科学与技术研究。通信地址：210037江苏省南京市玄武区龙蟠
路159号南京林业大学森林资源与环境学院，E-mail：tang900622@163.com。
通讯作者：洑香香，女，1969年出生，江苏南京人，教授，博士，主要研究方向：森林培育。通信地址：210037江苏省南京市玄武区龙蟠路159号南京林
业大学森林资源与环境学院，Tel：025-85427403，E-mail：xxfu@njfu.edu.cn。
收稿日期：2014-02-20，修回日期：2014-04-20。
中国农学通报 2014,30(22):79-83
Chinese Agricultural Science Bulletin
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
用组织培养技术，建立完整的四照花组培快繁体系显
得尤为重要。目前四照花属植物组织培养的研究主要
集中在大花四照花[5-9]和峨眉四照花[10-11]上，对于狭叶四
照花的研究主要集中在其分布[2]、种子萌发[12-13]、生长
规律[14]、扦插繁殖[15]、果实营养测定[16-17]，而有关狭叶四
照花组织培养的研究还未见报道。
本试验以狭叶四照花茎段为材料，探讨外植体消
毒方法、基本培养基、植物生长调节剂的种类及浓度等
对不定芽的诱导、增殖和生根培养的影响，为建立完整
高效实用的四照花组培快繁体系提供基础，也为四照
花优良无性系品种繁育及其资源开发利用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
狭叶四照花种子于 2011年采集于湖北五峰土家
族自治县渔阳关镇沙淌村。种子用 500 mg/L的GA3
在25℃连续浸泡3天后，与湿沙混合（种子:沙=1:3），置
于 0~5℃条件下低温层积 50天，待种子露白后播种具
基质的容器中，待幼苗长至20 cm高（约6~8片叶）时，
即可取样。
1.2 方法
1.2.1 材料预处理和消毒处理 连续放晴3天以上的天
气采集嫩枝条，剪去叶片，流水冲洗表面脏物后用洗衣
粉溶液润洗3 min，流水冲洗2 h。沥水后，在超净工作
台上进行消毒处理。消毒处理采用3因子2水平L4(23)
正交试验设计，分别为 70%酒精 (10、15 s)、吐温 -80
（加、不加 2滴）和 3%次氯酸钠(10、15 min)，分别标记
为A、B、C。各处理后均用无菌水冲洗 5遍，切去茎段
与消毒液接触的伤口部位，在无菌滤纸上将其切成
1.0~1.5 cm带腋芽的小段。每处理接种 30个外植体，
重复3次。
1.2.2 不定芽的诱导与增殖 不定芽的诱导试验首先以
MS、1/2MS和WPM为基本培养基，均添加 1.0 mg/L
6-BA +0.2 mg/L NAA进行适宜基本培养基的筛选试
验。再以WPM为基本培养基，附加 6-BA(0.5、1.0、
2.0 mg/L)、KT(0.05、0.5、1.0 mg/L)和 NAA(0.05、0.1、
0.5 mg/L)进行植物生长调节剂组合试验。然后将茎段
诱导的不定芽进行继代增殖培养，以WPM为基本培
养基，附加植物生长调节剂 6-BA(0.5、1.0 mg/L)、NAA
(0.1、0.2、0.5 mg/L)。每个处理接种15个外植体，重复
3次。
1.2.3 不定根的诱导 将生长健壮的狭叶四照花组培苗
接种到生根培养基（1）WPM；（2）WPM+0.5 mg/L IBA；
（3）WPM + 1.0 mg/L IBA；（4）WPM + 1.5 mg/L IBA；
（5）WPM+0.5 mg/LNAA；（6）WPM+1.0 mg/L NAA；
（7）WPM+1.5 mg/L NAA。每个处理接种 15个外植
体，重复3次。定期观察、统计。
1.2.4 培养条件 培养基内琼脂浓度为 6.0 g/L，蔗糖浓
度为 30 g/L，pH 5.8，培养温度(25±2)℃，光照强度为
1500~2000 μmol/(m2· s)，光照时间为12 h/d。
1.2.5 数据统计与处理 污染率=（污染数/接种数）×
100%，诱导率=诱导数/(接种数-污染数)。试验获得的
数据采用DPSv7.05进行数据的方差分析和多重比较。
2 结果与分析
2.1 无菌体系的建立
选择适当的消毒剂组合并确定合适的消毒处理时
间是建立外植体无菌体系的重要基础。此试验对狭叶
四照花茎段外植体用70%酒精进行表面消毒10~15 s，
无菌水冲洗5次，然后用3%次氯酸钠10~15 min（加或
不加吐温-80）进行体表消毒，用无菌水冲洗5次后，接
种到不定芽诱导培养基上，消毒剂组合的消毒效果见
表1。
方差分析结果表明，处理3效果最佳，污染开始的
处理
1
2
3
4
K1
K2
R
优水平
70%酒精/s
10
10
15
15
38.05
23.97
14.08
A2
吐温-80
加
不加
加
不加
20.35
41.67
21.32
B1
3%NaClO/min
10
15
15
10
39.71
22.30
17.41
C2
污染开始时间/d
3
4
6
4
k1
k2
R
优水平
污染率/%
36.09 A
40.00 A
4.60 B
43.33 A
65.65
73.31
7.66
A2
诱导率/%
60.74 B
70.56 AB
87.55 A
63.06 B
74.15
66.81
7.34
B1
新芽生长情况
++
++
+++
+
61.9
79.06
17.16
C2
表1 不同消毒组合的消毒效果
注：表中下左列为污染率的极差分析，右列为诱导率的极差分析。+++为芽茎干粗壮，叶片舒展；++为芽茎干细弱，叶片舒展；+为芽茎干细弱，叶
片卷缩。表中同一列字母表示不同处理差异极显著(P＜0.01)，下同。
··80
时间最晚6天，该处理的污染率最低4.6%，与其他各处
理间的差异达极显著；诱导率最高 87.55%，与处理 1、
处理4的诱导率间存在极显著差异。对污染率极差分
析结果表明，吐温-80对消毒效果的影响最大，其次是
次氯酸钠。吐温-80可增加消毒液的溶解度使消毒液
能充分与植物材料接触，不会造成材料的损伤，还容易
去除，提高灭菌效果。对诱导率极差分析结果表明次
氯酸钠对消毒效果的影响最大，其次是酒精、吐温-80。
2.2 基本培养基对不定芽诱导的影响
将消毒的茎段接种在不定芽诱导培养基（基本培
养基+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）上进行初代培养
后发现（表2），3种基本培养基均能诱导新芽，WPM培
养基上的诱导率高(89.92%)、芽生长健壮且无褐化现
象，1/2MS培养基上诱导率低(60.61%)、芽长势较差且
出现轻度的褐化现象，不利于进行继代培养，2种培养
基上的诱导率差异达极显著。综合不定芽的诱导率和
新芽的生长情况筛选适宜不定芽诱导的基本培养基为
WPM。
2.3 不同植物生长调节剂组合对不定芽诱导的影响
将消毒后的茎段接种在由不同植物生长调节剂组
合的培养基中，接种 10天左右茎段基部开始膨大增
粗，节部有腋芽萌动，15天左右腋芽开始长出新叶。
表3结果显示，在设计的9处理中，处理4效果最佳，与
其他各处理间存在极显著差异(P＜0.01)，诱导率最高
(86.29%)，且芽长势最好，新芽叶片舒展，颜色深绿，茎
干粗壮（图版Ⅰ-1）。极差和方差分析结果表明：植物
生长调节剂6-BA、KT和NAA浓度对不定芽诱导率均
存在极显著差异。6-BA对不定芽的萌发率影响最大，
是诱导不定芽的主要因素，其次是NAA，KT对不定芽
的诱导率影响最小。考虑不定芽诱导率及新芽的生长
情况筛选适宜的茎段不定芽诱导培养基为WPM+
1.0 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L KT + 0.1 mg/L NAA。
2.4 不同植物生长调节剂组合对不定芽增殖的影响
试验结果表明，不同激素及浓度配比对狭叶四照
花不定芽的增殖有不同程度的影响作用。其中处理5
效果最佳，增殖系数最大4.07，与其他处理相比均达极
显著差异(P＜0.01)，同时芽苗生长茁壮，叶伸展宽大，
深绿色（图版Ⅰ-2）。综合各组合测定结果发现，不定
芽增殖与植物生长激素的绝对量有关，还与细胞分裂
素和生长素的比例有关。当细胞分裂素/生长素为5:1
左右时（如组合 WPM + 1.0 mg/L 6- BA + 0.2 mg/L
NAA），丛生芽的增殖系数最大(4.07)；当细胞分裂素/
生长素为 1:1左右时（如组合WPM +0.5 mg/L 6-BA+
0.5 mg/L NAA），不定芽增殖系数最小(1.56)。综合不
定芽的增殖系数和生长情况筛选适宜的增殖培养基为
WPM +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。
2.5 生根培养
将生长良好的组培苗接种到生根诱导的培养基
试验号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
R
优水平
A. 6-BA/(mg/L)
0.5
0.5
0.5
1
1
1
2
2
2
44.95 B
64.54 A
27.33 C
37.21
A2
B. KT/(mg/L)
0.05
0.5
1
0.05
0.5
1
0.05
0.5
1
53.07 A
45.19 B
38.55 B
14.53
B1
C. NAA/(mg/L)
0.05
0.1
0.5
0.1
0.5
0.05
0.5
0.05
0.1
34.92 B
51.74 A
50.16 A
16.82
C2
萌发率/%
28.11 E
60.39 B
46.34 D
86.29 A
57.32 BC
50.00 CD
44.82 D
17.86 F
19.31 EF
开始时间/d
9
10
11
10
10
11
13
12
14
表3 不定芽诱导激素水平选择正交试验结果及直观分析
培养基
MS
1/2MS
WPM
萌发率/%
81.21 AB
60.61 C
89.92 A
新芽生长情况
叶深绿色，叶片伸展，茎细弱
叶黄绿色，叶片蜷缩，茎细弱
叶深绿色，叶片伸展，茎粗壮
表2 不同基本培养基对不定芽诱导的影响
唐佳佳等：狭叶四照花茎段的离体培养与植株再生 ··81
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中，结果见表 5。表 5表明，除了不添加激素的培养基
其他的培养基上都有生根现象，IBA比NAA较容易诱
导不定根，且根生长健壮，一级根数量较多。随着 IBA
浓度的增大生根率增大，附加 1.0 mg/L IBA的培养基
上生根率达 78.94%（图版Ⅰ-3），不定根生长健壮，与
其他各处理间存在极显著差异。综合不定根的诱导率
和生长情况筛选适宜的生根培养基为WPM+1.0 mg/L
IBA。
当不定根长至 2 cm左右时，炼苗 7天后移栽至混
合基质（草炭土:蛭石=1:1）中培养（图版Ⅰ-4），30天后
处理
1
2
3
4
5
6
6-BA/(mg/L)
0.5
0.5
0.5
1
1
1
NAA/(mg/L)
0.1
0.2
0.5
0.1
0.2
0.5
增殖系数
3.01 B
2.20 C
1.56 D
1.95 C
4.07 A
2.29 C
生长状况
茎干长粗，基部有愈伤，叶伸展，黄绿色
茎干长细，叶伸展但小，淡绿色
茎干短细，基部有愈伤，叶皱缩，淡绿色
茎干短细，基部有愈伤，叶卷曲，淡绿色
茎干长粗，叶伸展宽大，深绿色
茎干长细，叶伸展但小，淡绿色
培养基
WPM
WPM+0.5 mg/L IBA
WPM+1.0 mg/L IBA
WPM+1.5 mg/L IBA
WPM+ 0.5 mg/L NAA
WPM+1.0 mg/L NAA
WPM+1.5 mg/L NAA
生根率/%
0.00 D
46.97 B
78.94 A
19.81 C
42.37 B
45.71 B
17.17 C
生长情况
—
根生长健壮，一级根较多
根生长健壮，一级根较多且粗壮
根较短，一级根较多
根细长弱，一级根较少须根较多
根细长，一级根较少
根短，一级根较少
表4 不同激素组合对不定芽增殖的影响
表5 不同培养基对不定根诱导的影响
移栽成活的植株见图版Ⅰ-5。
3 结论与讨论
四照花属植物为木本植物，进行组织培养的困难
之一是建立无菌材料。本试验将酒精、吐温-80和次氯
酸钠联用，污染率低，存活率和萌芽率高。目前，木本
植物组织培养中选用的培养基有WPM、MS、1/2MS、
B5等，本试验研究认为WPM效果最好，可能因为
WPM培养基是一种低浓度的培养基，适合于多种木
本植物的培养。这与赵建萍等[18]在北高丛越桔中的研
究一致。
研究发现，在植物组织培养中，外源激素对外植体的
形态建成及其调控起着十分重要的作用，其种类的选择
和浓度的配比影响着植株的再生方式和再生频率[19-21]。
因此，该试验在各阶段配方筛选中，着重对外源激素浓
度在外植体不定芽的诱导、增殖及生根等过程中的重
要调节作用进行研究。本研究采用了 6-BA和KT双
激素诱导狭叶四照花腋芽，在合适浓度下诱导率达到
86.29%，说明 2种激素对狭叶四照花的芽分化中协调
1：消毒茎段萌发的腋芽；2：不定芽的增殖；3：组培生根苗；4：生根苗的移栽；5：生长健壮的移栽苗
图版Ⅰ
··82
性比较好，这与大别山冬青组织培养中的研究是一致
的[22]。余晓丽[23]在野生木香、薛会雯等[24]在金叶大叶黄
杨、马均等[25]在曼地亚红豆杉的研究中发现在不定芽
增殖培养时将 6-BA和NAA配合使用，芽苗增殖系数
大且生长势强，本试验也得到相同的结论。
IBA和NAA作为诱导不定芽生根的主要植物生
长调节剂，被广泛地用于植物的无性繁殖。他们单个
或配比使用，均视植物材料的不同而不同[26-28]。本试验
发现，IBA更适合狭叶四照花不定根的诱导。
该试验首次以狭叶四照花茎段为培养材料，通过
直接途径实现离体再生，筛选出了比较容易离体培养
的最适培养基，建立了一种稳定而高效的组织培养与
快繁技术体系，从而为狭叶四照花工厂化育苗及遗传
改良提供了技术支持，能够更加有效地开发利用。
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