全 文 ：第 2 3卷 增刊 l
19 9 3年 , 月
厦门大 学学报 ( 自然科学版 )
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甜菊叶片离体培养酸性磷酸酶
的电镜细胞化学定位 ①
余迪求② 洪维康 陈睦传 江德耀
( 细胞生物学研究室 )
摘要 应用 电镜细胞化学方法 , 研究了甜菊叶肉细胞脱分化过程中酸性磷酸酶 在细胞超
微结构水平的定位和分布状态 . 结果表明 ,细胞处于脱分化的起动状态时 ,其酸性磷酸酶活性定位
于细胞质膜 ; 当处于脱分化的中间演变状态时 . 其酸性磷酸酶活性主要定位于液泡膜和核仁上 ,而
质膜上的酶活性基本消失 , 当脱分化完成后 , 质膜上的酶活性又重新出现并表现出高活性 , 而液泡
膜和核仁上酶活性荃本消失 .
关键词 甜菊 , 酸性磷酸酶 , 电镜细胞化学定位 , 细胞脱分化
植物细胞酸性磷酸酶活性的细胞化学定位的研究已有一些报道 〔`一 s , . 揭示它在碳水化合
物代谢 、 种子萌发 、 筛管拼服体沉淀以及植物抗寒性等生理生化过程中起着一定作用 . 然而 , 在
离体培养条件下 , 植物细胞脱分化过程中有关酸性磷酸酶的定位分布及变化动态尚未见报道 .
我们采用电镜技术 , 已观察了甜菊叶肉细胞回复成胚性分生细胞的动态过程 (待发表 ) . 在此基
础上 . 利用经典的铅沉淀法 , 对其脱分化期间酸性磷酸酶活性及其变化动态进行了电镜细胞化
学定位研究 , 以期了解酸性磷酸酶活性与植物细胞脱分化的相关性 .
1 材料与方法
供试材料为盆栽甜菊 〔tS 。 故 er ab “ d ia ` B er t on i) , 采取植株中成叶 , 经表面消春后切成 众
2~ 0
.
5 e m Z 的小块 (切去主脉 ) ,接种于附加 N A A 1 m l / l和 6一 B A O . 5 m g / l的 M S 固体培养基
上 . 置龄 26 ℃光照强度为 工 50 L x 的光照恒温培养室内 ,每天光照 1 6 h . 从不同培养时间的
叶片中切取小于 。 . s m m , 的小块 . 用 50 m m l/ 二 甲肿酸钠缓冲液 ( p H 7 . 2) 配制的 3%戊二 醛
和 4%甲醛混合液 、 于室温下固定 l 、 s h 经二甲肿酸钠缓冲板充分洗涤后 ,再用醋酸缓冲液
( pH S
.
0) 洗 2 次 , 每次 30 m in , 然后将材料转移到 酶反应液中 . 酶反应液是 :含 8 m ol I/ 件甘油
磷酸钠 . 2 . 4 m m ol l/ 硝酸铅的 0 . 05 m ol l/ 醋酸缓冲液 (P H S . 0) . 在 2 2 ℃ 水溶锅中温育 2 . 5 h .
采用两种对照实验 ; l) 反应液中不加各甘油磷酸钠 ,劝反应液中加入 O, 01 m ol l/ 氟化钠 . 反应
完毕后 , 用二 甲肺酸钠缓冲液 (P H 7 . 2 )洗涤 3 次 , 每次 30 m in . 再用同样的缓冲液配制的 1%饿
本文 19 9 3一 04一肠 收到
现在工作单位 : 巾山大学生物工程研究中心 , 广州 5 1 0 27 5
①幼
厦门大学学报 (自然科学版 ) 1 99 3 年
酸后固定 2}、 , 经缓冲液 充分洗涤后 , 按常规用各级酒精脱水 . 环氧丙烷过渡 , E p o n 8 1 2 包埋 ,用
L K B
一
8 8。 。 , 型超薄切片机切片 , 醋酸铀染色 , 在 J EM 一 1。。 CX . 型透射电镜下观察与照相 .
2 结 果
成熟的甜菊叶肉细胞经脱分化过程 回复变成胚性分生细胞需经历 3 个主要阶段 ( I )起动
阶段 、 〔 I )中间演变阶段和 ( , )终结分裂阶段等 . 采用经典的铅沉淀法定位 ,我们系统地观察
了处于不同脱分化阶段的叶肉细胞的酸性磷酸酶活性的定位和分布情况 . 其结果如下 :
起动阶段 :离体培养 o d 的甜菊叶肉细胞 , 其酸性磷酸酶主要定位于细胞质膜上 (图版 工 ,
l )
, 而液泡膜和高尔基小泡上尚未表现酸性磷酸酶活性 (图版 工 , 1) . 离体堵养 2~ 3 d 后 , 甜菊
叶肉细胞 〔特别是靠近切 口处 )和维管束周围的薄壁细胞出现脱分化迹象 , 细胞处于脱分化起
动阶段 , 此 期酸性磷酸酶主要位干细胞质膜上 (图版 I , 2) . 仔细观察铅沉淀物沉积情况 , 可以
发现酸性磷酸酶是分布于质膜的外侧 . 因为所有的反应产物都是向细胞间隙部位聚积 . 值得注
意是 , 铅沉淀物是不规则地分布于质膜上 (图版 1 . 2 ) . 说明在细胞质膜的不同部位表现出不同
强度的酸性磷酸酶活性 . 另外 , 液泡膜同样表现酸性磷酸酶活性 (图版 工 , 2) .
中间演变阶段 :离体培养 4一 6 d 后 , 外植体演变成绿色 , 且明显增厚 . 有些叶绿体出现脱
分 !七迹象 ; 有些叶绿体以出芽方式繁殖 〔图版 I , 4) . 细胞内粗面内质网发达 ,其上附着大量核
艳体 (图版 1 . 3 、 5 ) . 细胞核体积增大 , 具核仁小泡 (图版 I , 5) . 此期细胞的酸性磷酸酶活性主
要定位于液泡膜上 (图版 工 , 3 、 4) 和核仁上 (图版 I , 5 ) ` 在细胞核基质 (图版 l , 5) 和细胞质膜
上 (图版 I , 幻偶尔表现该酶活性 但高尔基小泡 、 叶绿体 、 线粒体 、粗面内质网均未发现铅沉淀
物 (图版 工 , 4 、 5) . 最引人注目的变化是 ,在质膜上酸性磷酸酶活性基本消失 , 而在液泡膜和核
仁上出现该酶的高活性反应 .
终结分裂阶段 : 叶肉细胞脱分化完成 , 细胞分裂即将开始 ,细胞处于胚性分生状态 . 此期酸
性磷酸酶主要定位于质膜 〔图版 1 , 7 、 8) ,并表现高活性的酶反应 . 在液泡膜上 ,酸性磷酸酶活
性基本上消失 , 只是偶尔在局部表现了微弱的该酶活性 (图版 1 . 6) . 在连接质膜的部分内质网
上表现该酶活性 (图版 工 , 8) . 另外 , 在细胞核基质和核仁的酸性磷酸酶活性完全消失 (图版 I ,
7 )
. 上述电镜观察结果显示 . 由酸性磷酸酶活性反应形成的磷酸铅沉淀在细胞内的定位界限
清晰分明 , 没有出现反应产物扩散的现象 . 在无底物和加入酶抑制剂的对照样品中没有磷酸铅
沉淀物分布 (图版 工 , 9 ) .
3 讨 论
许多研究工作 已证实 , 植物细胞在脱分化期间 , 细胞形态结构发生深刻变化卿 ,同时伴随
着急剧的生理生化变化` 7 、 , 二` 一般认为生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成时 , m RN A 和蛋
白质代谢 (包括酶活性 )发生深刻的变化厂” ,
采用电镜细胞化学定位技术 , 直接地显示甜菊叶肉细胞内的酸性磷酸酶活性在亚细胞水
上的定位区域和分布情况 , 随着脱分化的进展 . 处 于动态变化状态 . 甜菊叶肉细胞从脱分化的
起动状态 , 中间演变状态过渡到脱分化的终结分裂状态 , 其酸性磷酸酶活性及分布以细胞质膜
转移至液泡膜和核仁上 , 而最后重新在细胞质膜上出现 . 这些结果表明酸性磷酸酶活性随着细
胞结构和生理状态 的变化而变化 , 也表明酸性磷酸酶活性与细胞脱分期间的生理动能密切相
关 .
增刊 1 余迪水等 :甜菊叶片离体培养酸性磷酸酶的电镜细胞化学定位
·
1 3 5
·
许多有关酸性磷酸酶细胞化学定位的研究指出 , 它主要定位于液泡 、 核仁 、 核内染色质以
及细胞质膜和细胞间隙中“ 一 3 .6 1“ 一 ` ZJ我们在脱分化的甜菊叶肉细胞中的观察结果也证实了这
一点 ,但它的定位区域和分布状态随着细胞脱分化的结构和生理状态的不同而异 ,表现出动态
变化状态 (图版 1 . 2一 8) . Ben t w o d 等` , ,曾报道烟草韧皮部的薄壁细胞和伴胞的线粒体内膜 、
高尔基小泡表现很高的酸性磷酸酶活性 在甜菊叶肉细胞内 ,无论细胞处于脱分化何种状态 ,
线粒体内膜和高尔基小泡上始终不显示酸性磷酸酶活性反应 (图版 I , 1 , 5 , 6) ·
参 考 文 献
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13 G 厦门大学学报 ( 自然科学版 ) 19 9 3年
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。 。 1 iv , t y a `〕p e a r e d a 只 a i n o n t l、 e p h a s m a m e m 卜r a n e a n d d i s a p p e a r e d o n t h e v a e u o la r m e m r a n e o a n d
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刃。故 ;丫乃a u J 触 ,: 。 B o r t o n i , A e id p h o o p l, a t a s e , E l e e t r o n rn ie r o s e o p l e e y r ,
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图版说明
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. 细胞壁 , :(l 飞. 叶绿体 . G . 高尔基体 , M . 线粒体 . E R 内质网 . N . 细胞核 , N u . 核仁 , v . 液泡
图 l 培养 。 d 的甜菊叶肉细胞 . 酸性磷酸酶反应产物主要定位于细胞质膜上 . x s 0 0
图 2 培 养 4 ~ s d 的叶肉细胞 . 酶反应产物定位于细胞质膜上 x 巧 0 0
图 3一 5 酶反应产物沉积的最显著位置是液泡膜 (图 3一 4) 和细胞核仁 ( 图 的 . 注意 , 质膜 、高尔基体和内质
网未见酶反应沉淀 . 图 3火 3 00 0 0 图 . 4 义 1 5 0 00 图 , 5又 20 0 0 0
圈 6一 8 培养 7一 10 d 的叶肉细胞 . 酶反应产物主要定位于细胞质膜〔图 7一 8) ,但液泡膜上仍有微弱 !酶反
应产物 (图 6 ) . 图 6 水 3 0 00 0 , 图 7 x l o 0 00 , 图 8 K 1 5 0 0 0
图 9 在未加 卜甘油瞬酸钠的反应混合物温育的样品 ,在叶肉细胞各部位未观察到酶反应产物 . x 30 0 0 0
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