全 文 ：第 43 卷第 2 期
2014 年 2 月
应 用 化 工
Applied Chemical Industry
Vol． 43 No． 2
Feb． 2014
收稿日期:2013-11-18 修改稿日期:2013-12-19
基金项目:国家自然科学基金(81202492) ;陕西省大学生创新创业计划项目(201211840009)
作者简介:张寒(1975 －) ，女，陕西礼泉人，西安医学院讲师，硕士，主要从事中药有效成分的提取和药效研究。电话:
15319430255，E － mail:zhanghan11nini@ 163． com
通讯联系人:李锋丽(1990 －) ，女，从事中药有效成分的提取和检测。电话:18710880145，E － mail:1070364976@ qq． com
正交设计优化青荚叶中植物甾醇
的提取工艺
张寒，李锋丽，马亚荣，刘文娟，杨光华，谭汗青，文和，张蓉，杜强
(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)
摘 要:运用皂化法提取青荚叶中植物甾醇化合物(以豆甾醇的含量为指标) ，考察料液比、碱浓度、皂化时间、萃取
剂用量对提取工艺的影响。结果表明，最佳提取工艺条件为:料液比 1 ∶ 6(g /mL) ，碱浓度 10%，皂化时间 90 min，
萃取剂用量 60 mL。建立的青荚叶甾醇皂化提取物的提取方法稳定可靠，具有快速、精密度高及重现性好且操作简
单等优点，可作为青荚叶中植物甾醇提取的最佳工艺。
关键词:青荚叶;植物甾醇;正交设计;提取
中图分类号:TQ 464． 2;Ｒ 917 文献标识码:A 文章编号:1671 － 3206(2014)02 － 0212 － 03
Optimizing process of saponification extraction of sterol in
Helwingia japonica by orthogonal design
ZHANG Han，LI Feng-li，MA Ya-rong，LIU Wen-juan，YANG Guang-hua，
TAN Han-qing，WEN He，ZHANG Ｒong，DU Qiang
(College of Pharmacy，Xi’an Medical University，Xi’an 710021，China)
Abstract:Using saponification to extracted phytosterol compound from Helwingia japonica，stigmasterol
content as index． Effects of different solid-liquid ratio，alkaline concentration，saponification and the dos-
age of extracting agent on extraction were investigated． Ｒesults show that the optimal conditions extraction
of sterol are as following:solid-liquid ratio 1 ∶ 6(g /mL) ，alkaline concentration 10%，saponification for
90 min and petroleum ether 60 mL． The established saponification extracts of stable and reliable extraction
method can be used as Helwingia japonica the best extraction． This method is easy and rapid with high
precision and excellent reproducibility．
Key words:Helwingia japonica;phytosterol;orthogonal design;extraction
青荚叶(Helwingia japonica)为山茱萸科青荚叶
属，因花着生于叶上面的中脉(近于基部) ，又称叶
上珠、叶上花。其根茎叶入药，具有舒筋活络、调经、
清热除湿、解毒消肿、凉血止血、清肺止咳等功效，并
具有清热利尿、下乳等功能［1］。青荚叶中含有的植
物甾醇类成分是植物中的一种活性成分，在结构上
与动物性甾醇如胆甾醇相似，是一种类似于环状醇
结构的物质，有降低胆固醇的作用［2］，然而针对青
荚叶中植物甾醇的研究在国内却是很少见的。
植物甾醇提取及定量分析方法的研究报道［3-5］
很多，本实验采用磷硫铁作为显色剂［5］测定青荚叶
中植物甾醇的含量，采用正交实验法，以豆甾醇的含
量为指标，通过紫外分光光度法对青荚叶中植物甾
醇的含量进行测定，优化青荚叶中皂化提取物的提
取工艺。
1 实验部分
1． 1 材料与仪器
青荚叶，陕西眉县太白山采用;豆甾醇(纯度≥
95%) ;乙醇、石油醚、氢氧化钾、三氯甲烷、三氯化
铁、浓磷酸、浓硫酸等均为分析纯。
UC-2102C /PC /PCS 型紫外可见分光光度计;
GＲ202 微量天平;SENCOＲ 系列旋转蒸发器;SXKW
数显控温电热套;SHZ-D(III)循环水式真空泵;KQ-
300B型超声波清洗器;503N型恒温水浴锅。
第 2 期 张寒等:正交设计优化青荚叶中植物甾醇的提取工艺
1． 2 溶液配制
1． 2． 1 豆甾醇标准溶液配制 准确称取豆甾醇标
样 5 mg，溶于无水乙醇中，定容至 10 mL，豆甾醇含
量为 0． 500 mg /mL，贮于棕色瓶中，低温保存备用。
使用时吸取上述储备液 2． 5 mL，用无水乙醇定容至
25 mL，得豆甾醇使用液，含量为 50 μg /mL。
1． 2． 2 磷硫铁显色剂配制 称取 10 g FeCl3·
6H2O溶于 85%浓磷酸中，用磷酸定容至 100 mL。
贮于棕色瓶中，冷藏，可保存 1 年。再取上述配好的
10% FeCl3 液 1． 5 mL 于 100 mL 棕色瓶中，用浓硫
酸定容至刻度。
1． 3 标准曲线的绘制［6-7］
取 20 mL干燥试管 6 支编号，分别按表 1 添加
试剂。而后在室温下显色 15 min，在 445 nm下用分
光光度计分别测定吸光度，以豆甾醇量为横坐标，吸
光度为纵坐标，绘制标准曲线。线性回归，得回归方
程:Y = 0． 001 2X － 0． 007 1，相关系数 Ｒ2 = 0． 998 3，
说明该方法线性良好。
表 1 标准曲线试剂绘制参数
Table 1 Stigmatization parameters of standard curve
编号
豆甾醇使用液
(50 μg·mL －1)/mL
无水乙醇
/mL
磷硫铁显色剂
/mL
相应豆甾
醇量 /μg
0 0 8 4 0． 0
1 3 5 4 150
2 4 4 4 200
3 5 3 4 250
4 6 2 4 300
5 7 1 4 350
紫外-可见分光光度计以标准曲线空白调基准，
在 350 ～ 700 nm范围内扫描，结果见图 1。
图 1 紫外吸收波谱
Fig． 1 Ultraviolet absorption spectrum
由图 1 可知，在 445 nm 和 550 nm 处有 2 个吸
收峰，根据峰高我们选择 445 nm 作为测定吸收波
长。
1． 4 青荚叶提取［8］
称取青荚叶细粉(过 40 目筛)约 10 g，精密称
定，置 100 mL圆底烧瓶中，加入氯仿 60 mL，加热回
流提取 2 h，放冷，过滤，残渣中再加氯仿 60 mL，回
流提取 2 h，放冷，过滤。合并滤液，减压浓缩至干。
残渣加入 10%的氢氧化钾乙醇溶液 60 mL，于 80 ℃
回流皂化 90 min，以石油醚萃取 4 次，每次 60 mL，
合并有机相，挥干溶剂，得青荚叶提取物。
1． 5 青荚叶中植物甾醇含量测定［9］
准确称取提取物 0． 4 ～ 0． 45 g，用无水乙醇溶解
后定容至 50 mL。取样品液 4 mL，加入无水乙醇
4 mL，磷硫铁显色剂 4 mL，摇匀，15 min后用分光光
度计在波长 445 nm处测定其吸光度。
2 结果与讨论
2． 1 青荚叶中甾醇最佳提取条件的确定
单因素实验表明，料液比、KOH-乙醇浓度、皂化
时间和萃取剂用量对甾醇的提取工艺影响最大。选
用 L9(3
4)正交表进行正交实验，以确定提取甾醇的
最佳工艺参数，因素水平见表 2，结果见表 3。
表 2 因素水平
Table 2 Factors and levels
水平
A B C D
料液比
/(g·mL －1)
KOH-醇浓度
/%
皂化时间
/min
萃取剂用量
/mL
1 1 ∶ 4 10 60 20
2 1 ∶ 5 13 90 40
3 1 ∶ 6 16 120 60
表 3 正交实验结果
Table 3 Ｒesults of orthogonal test
序号 A B C D 吸光度
1 1 1 1 1 0． 268
2 1 2 2 2 0． 175
3 1 3 3 3 0． 198
4 2 1 2 3 0． 400
5 2 2 3 1 0． 178
6 2 3 1 2 0． 183
7 3 1 3 2 0． 322
8 3 2 1 3 0． 243
9 3 3 2 1 0． 200
k1 0． 214 0． 330 0． 235 0． 215
k2 0． 254 0． 199 0． 258 0． 227
k3 0． 255 0． 193 0． 233 0． 280
Ｒ 0． 041 0． 137 0． 025 0． 065
由表 3 可知，碱浓度对粗甾醇的提取率影响最
大。最佳因素组合为 A3B1C2D3，即提取不皂化物
时，加入提取剂 60 mL，料液比 1 ∶ 6(g /mL) ，氢氧化
钾-乙醇溶液浓度为 10%，在温度 80 ℃ 下皂化
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应用化工 第 43 卷
90 min，此时甾醇的提取率最高。
2． 2 正交实验结果验证
精密称取 3 份青荚叶药材，在最佳条件下操作，
平行制备 3 份样品溶液，每份测定 3 次，取其平均
值，结果见表 4。
表 4 青荚叶中植物甾醇的吸光度(n =3)
Table 4 Absorbance of sterol from Helwingia japonica
青荚叶样品 植物甾醇的吸光度
样品 1 0． 408
样品 2 0． 410
样品 3 0． 409
由表 4 可知，正交实验优选出的最佳提取工艺
提取的甾醇吸光度值高于正交表中 9 次实验的任一
值。故可以确定此条件为最佳条件。
2． 3 稳定性测定
精密吸取样品溶液 4 mL，分别显色 5，10，15，
20，25，30 min后，在 445 nm 测定吸光度，结果 ＲSD
=1． 24%，表明样品溶液显色后较稳定，在 30 min
内均可进行测定。
2． 4 精密度的测定
准确吸取样品溶液 3． 00 mL 分别置于 9 支
20 mL试管中，测定吸光度，结果平均吸光度为
0． 342，标准偏差 S = 0． 000 432 8，相对标准偏差
ＲSD =0． 126 5%，说明此方法的精密度高或重现性
好。
2． 5 回收率的测定
准确吸取样品溶液 3． 00 mL 分别置于 6 只
20 mL试管中，其 中 3 管 中 加 入 豆 甾 醇 标 样
3． 00 mL，另 3 管加入豆甾醇标样 4． 00 mL，测定吸
光度。结果样品回收率为 98． 5% ～ 103． 7%，平均
回收率为 101． 6%，可以满足分析测定的需要。
3 结论
(1)湿法皂化提取植物甾醇的优化工艺为:将
10 g青荚叶粉末溶于 60 mL氯仿中，50 ℃回流 2 h，
并减压蒸干，重复 2 次，残渣加入 10%的氢氧化钾-
乙醇饱和溶液在沸水浴中皂化反应 90 min，用石油
醚 60 mL 萃取 4 次，合并有机相，挥干溶剂。此时
植物甾醇的提取率最高。
(2)利用甾醇类化合物与酸作用时，经脱水生
成双键而产生颜色物质的原理，采用磷硫铁试剂作
为显色剂，与甾醇发生显色反应，建立了青荚叶粉末
中植物甾醇的分光光度测定方法。该法测定植物甾
醇，有较好的稳定性、精密度和回收率，操作方法简
便，并且灵敏度较高，可用于植物甾醇的生产管理和
产品质量的分析工作中。
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