全 文 ：腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建
成 瑜 ,刘昭军 ,刘丽艳 ,李铁 ,赵曦　(黑龙江省农业科学院 ,黑龙江哈尔滨 150086)
摘要　 [目的 ] 构建以甘露糖为筛选剂的抗旱、抗盐碱植物表达载体 ,进一步选育无标记的抗逆作物品种。 [方法]利用腊梅花水通道
蛋白CpTIPcDNA和大肠杆菌pmi基因构建植物表达载体 ,将抗逆基因与甘露糖正向选择系统结合。 [结果 ]成功构建了腊梅花水通道
蛋白CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体pPMI∶∶CpTIP。 [结论]所构建的载体结合了抗逆基因和甘露糖正向选择系统的优点 ,将
抗逆基因与环境友好型筛选体系很好的结合起来。
关键词　水通道蛋白;甘露糖筛选体系;TIP
中图分类号　S188　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)01-00068-02
ConstructionofChimonanthuspraecox(L.)LinkAquaporinCpTIPPlantExpressionVectorwithMannoseSelectionSystem
CHENGYuetal　(HeilongjiangAcademyofAgriculturalSciences, Harbin, Heilongjiang150086)
Abstract　[ Objective] Theaimwastoconstructdroughtandsaline-alkalineresistanceplantexpressionvectorwithmannoseasselectivea-
gent, andfurtherbreedunmarkedresilientvarieties.[ Method] TheplantexpressionvectorwasconstructedbyusingChimonanthuspraecox
(L.)LinkaquaporinCpTIPcDNAandEscherichiacolipmigene, combinedstressresistancegenewithmannosepositiveselectionsystem.
[ Result] ThetestsuccessfulyconstructedtheplantexpressionvectorpPMI∶∶CpTIP.[ Conclusion] Theconstructedvectorlinkedadvantages
ofstressresistancegeneandmannosepositiveselectionsystem.
Keywords　Aquaporin;Mannoseselectionsystem;TIP
基金项目　农业部转基因植物专项 “抗逆转基因大豆新品种的培育 ”子
课题(2008ZX08004-2)。
作者简介　成瑜(1980-), 女 ,黑龙江哈尔滨人 ,硕士 , 助理研究员 ,从
事大豆分子育种研究。
收稿日期　 2009-08-25
　　烟草悬浮细胞的 NtTIPa在爪蟾卵母细胞中表达时 ,除
可通透水分外 ,也可通透甘油和尿素 ,并且尿素的通透能力
非常强 ,其通透尿素的能力是对照的 3.9倍 , TIP的强通透能
力可以快速平衡单个细胞内的胞质渗透势 ,而 NtTIPa强的
通透尿素的能力可加速这一渗透平衡过程 ,使胞质中的酶免
受伤害 [ 1] 。花椰菜液泡膜 BobTIP1;1基因在酿酒酵母渗透
敏感突变体 fpsl■中表达的结果表明 ,表达的蛋白定位于所
补偿的酵母的液泡膜上 ,且表达 BobTIP1;1的突变体细胞的
液泡的甘油含量比胞浆中高 ,并能在低渗振荡时存活。即酵
母的质膜甘油通道的缺失能被编码 BobTIP1;1的 cDNA补
偿 。因此 ,有可能是 BobTIP1;1通道蛋白通过使渗透剂进入
液泡内而把甘油输出胞浆 [ 2] 。表明 TIP在植物的渗透振荡
中发挥了作用 。
随着重组 DNA技术的广泛应用和迅速发展 , 基因工程
方法既能更直接 、更有效 、更快捷地提高植物的抗病 、抗虫能
力 ,又能提高植物的抗逆性和营养价值。目前 , 在植物转基
因中应用的筛选体系有很多种 ,根据其对转化体细胞新陈代
谢活动的利弊 ,可分为正向筛选体系和负向筛选体系。负向
筛选体系如目前在植物的遗传转化中广泛使用的抗生素和
除草剂标记 ,其对转化再生及安全和生态等的不利影响受到
了广泛争论。近年来 ,针对这些不利影响 ,人们开始采用一
种新型的正向筛选方法———甘露糖筛选体系。该体系以大
肠杆菌磷酸甘露糖异构酶基因(mannose-6-phosphateisomer-
ase,称为 pmi基因)为标记基因 ,甘露糖为筛选剂进行筛选 ,
称为 PMI/甘露糖筛选体系。在该体系中甘露糖由植物细胞
内源的己糖激酶催化转变为 6-磷酸甘露糖 ,并消耗 ATP,转
化细胞通过 pmi基因表达 ,将 6-磷酸甘露糖转变为细胞可代
谢的 6-磷酸果糖。而未转化的细胞中 6-磷酸甘露糖不能被
代谢并持续消耗能量和磷酸根离子 ,从而使未转化的细胞生
长受到抑制 ,以此来达到区分转化和未转化细胞的目的 ,同
时也可提高转化率和再生率 [ 3] 。目前 , PMI/甘露糖筛选体系
已成功用于甜菜 、辣椒 、黄瓜 、拟南芥 、玉米 、小麦 、水稻 、木
薯 、苹果等植物 ,在木本植物甜橙和葡萄中也有报道 [ 4-6] 。
水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)是普遍存在于动植物和
微生物生物膜上的专一型 、高效性水分跨膜运输通道 [ 7] 。通
过调控水通道蛋白在生物膜上的数量和相对丰度能够影响
甚至改变细胞对水分的吸收和外排 ,在提高植物抗旱和抗盐
碱能力方面可能发挥着重要的作用。根据水通道蛋白的分
布以及其氨基酸序列的相似性可以将其分为 4种类型:质膜
内在蛋白 PIPs(plasmamembraneintrinsicproteins)、液泡膜内
在蛋白 TIPs(tonoplastintrinsicproteins)、根瘤菌周膜上的
NOD26类似的内在蛋白 NIPs(NOD26-likeintrinsicproteins)
以及一类小分子碱性内在蛋白 SIPs(smalbasicntrinsicpro-
teins)[8] 。其中 TIPs分为 α、β、γ、δ和 ε5个亚类 [ 9] ,植物细
胞中不同类型的液泡膜上存在不同的 TIPs。
笔者利用吉林大学张世宏教授课题组克隆出的腊梅花
水通道蛋白 CpTIPcDNA和大肠杆菌 pmi基因构建了植物表
达载体 ,将抗逆基因与甘露糖正向选择系统结合起来 ,旨在
为下一步选育无标记的抗逆作物品种奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料　植物表达载体 pTEV7∶∶CpTIP由吉林大学张世
宏教授提供 ,大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α和植物表达载
体 pCAMBIA2301由黑龙江省农业科学院提供 。
1.2　方法
1.2.1　大肠杆菌 DNA的提取。参照 Sambrook等 [ 10]的方法
进行。
1.2.2　大肠杆菌 pmi基因的克隆。根据 GenBank(accesion
M15380)中 pmi的序列设计 1对引物:P1, 5′-CCGCTCGAG-
CGGTTACTGCCTGGTTTGGT-3′;P2, 5′-CCGCTCGAGCGGAG-
GCTCTTACAGCTTGTT-3′。
为便于构建载体 ,在 2个引物前都设计了 XhoⅠ的酶切
责任编辑　李婷婷　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(1):68-69, 71
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.01.105
位点。以大肠杆菌 DNA为模板进行 PCR反应。反应条件为
94℃预变性 5min, 94℃ 45s, 55℃ 45 s, 72℃ 1.5min35个
循环 , 72 ℃延伸 10 min。
1.2.3　pmi基因植物表达载体(pPMI)的构建。用 XhoⅠ酶
切植物表达载体 pCAMBIA2301,切除 Kan基因 ,并用 CIP酶
进行去磷酸化 ,然后与 XhoⅠ酶切后 PCR产物连接转化 。转
化鉴定按 Sambrook等 [ 10]的方法进行。序列测定由北京华大
公司进行。
1.2.4　腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因的克隆 。根据吉林大
学张世宏教授提供的腊梅花水通道蛋白 CpTIP的 cDNA序
列设 计 PCR引 物。 P3: 5′-CGGGGTACCCCGCGGATTG-
CAGTGGGG-3′;P4: 5′-GCTCTAGAGCTGCTCAGTAGTCAG-
TAGAGGC-3′。
为便于载体构建 ,在 2个引物前分别设计了 KpnⅠ和 Xba
Ⅰ酶切位点。以 pTEV7∶∶CpTIP质粒为模板进行 PCR反应 。
反应条件为 94 ℃预变性 5min, 94℃ 45s, 52℃ 45 s, 72℃ 1
min35个循环 , 72 ℃延伸 10 min。
1.2.5　PCR产物的克隆及测序 。PCR产物的克隆按 Sam-
brook等 [ 10]的方法进行 ,序列测定由北京华大公司进行。
1.2.6　腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因甘露糖筛选体系植物
表达载体(pPMI∶∶CpTIP)的构建。
用 KpnⅠ和 XbaⅠ酶切 pPMI植物表达载体和克隆载体 ,
并将酶切后 pmi植物表达载体与腊梅花水通道蛋白 CpTIP
基因连接转化 ,转化鉴定按 Sambrook等 [ 10]的方法进行。
2　结果与分析
2.1　pmi基因植物表达载体(pPMI)的构建　PCR产物经
0.8%琼脂糖凝胶电泳分析为长约 1.2 kb的片段 ,将酶切后
的 PCR产物与 pCAMBIA2301载体连接 ,通过 kan筛选获得
转化子。重组质粒用酶切鉴定得到 1.2 kb左右插入片断 。
重组质粒测序结果显示核苷酸序列与报道的同源性为 99%,
推导的氨基酸序列与报道的同源性为 100%。表明该重组质
粒为正向的植物表达载体 pPMI。
注:M.DNAMakerDL2000;1.酶切回收后载体;2.酶切回收后
PCR产物。
Note:M.DNAmarkerDL2000;1.pCAMBIA2301 afterdigestion;
2.PCRproductsafterdigestion.
图 1　连接前PCR产物
Fig.1　PCRproductsbeforeconnection
2.2　腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因甘露糖筛选体系植物
表达载体(pPMI∶∶CpTIP)的构建　PCR产物经 0.8%琼脂
糖凝胶电泳分析为长约 770 bp的片段 ,将其克隆到 pMD18-T
载体 。测序结果显示 ,片段长为 778 bp,包含 CpTIP全部 cD-
注:M.DNAmakerDL2000;1～ 8.酶切重组质粒。下图同。
Note:M.DNAmarkerDL2000;1-8.Digestedrecombinantplas-
mid.Thesameasfolows.
图 2　pPMI载体酶切结果
Fig.2　DigestedresultsofpPMIvector
NA序列 ORF,与张世宏教授提供的该基因序列完全一致。
用 KpnⅠ和 XbaⅠ酶切 pPMI植物表达载体和克隆载体 ,并将
酶切后 pmi植物表达载体与腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因
连接转化获得重组子 ,经酶切鉴定为 pPMI∶∶CpTIP载体。
图 3　pPMI∷CpTIP载体酶切结果
Fig.3　pPMI∷CpTIPvectordigestedresults
图 4　植物表达载体 pPMI∶∶CpTIP的构建
Fig.4　TheconstructionofplantexpressionvectorpPMI∶∶CpTIP
3　讨论
甘露糖选择体系相比卡那霉素选择体系具有很多优越
性。甘露糖选择体系的转化频率是卡那霉素选择体系的 10
倍多 , 而且带有目的基因的再生芽发生频率和转基因的再
生不定芽生根频率也能大大提高 , 而卡那霉素有可能阻碍
根的形成 [ 11] 。前人对该体系进行了潜在的过敏原研究 ,结
果表明纯化的 PMI蛋白可在模拟胃环境下被降解 ,且不含与
已知过敏原同源的序列 、多硫键及 N端糖基化序列 。在 PMI
转基因和非转基因植株中并未发现糖蛋白结构的变化。由
此可知 PMI并不具有很多口服过敏原的特性 ,因此 ,其具有
较大的商业应用前景 [ 12] 。
干旱和高盐对植物产生渗透胁迫 、离子毒害 ,并导致一
系列次级伤害。轻则使植物生长受到抑制 ,光和速率下降 ,
　 (下转第 71页)
6938卷 1期　　　　　　　　　　　　　　成 瑜等　腊梅花水通道蛋白 CpTIP基因甘露糖筛选体系植物表达载体的构建
2.2　琼脂糖电泳检测结果　由图 1可知 , ①常规 CTAB法 、
②高盐 CTAB法 、③改良 SDS法 、⑦常规 SDS法 、⑧改进
CTAB法 、 1CTAB法 、 12改良 CTAB法所提 DNA的电泳带很
清晰 ,基本无降解拖尾现象 ,加样孔附近滞留的物质很少;④
5×CTAB法 、⑤CTAB法 、⑥CTAB法 、⑨改进 SDS法 、⑩
CTAB法所提 DNA的电泳带不明显 ,可能是存在污染物的
缘故。
注:1.常规 CTAB法;2.高盐CTAB法;3.改良 SDS法;4.5×CTAB
法;5.CTAB法;6.CTAB法;7.常规 SDS法;8.改进 CTAB法;
9.改进 SDS法;10.CTAB法;11.CTAB法;12.改良 CTAB法。
Note:1.RoutineCTABmethod;2.High-concentration-saltCTAB
method;3.ImprovedCTABmethod;4.5×CTABmethod;5.
CTABmethod;6.CTABmethod;7.RoutineSDSmethod;8.Im-
provedCTABmethod;9.ImprovedSDSmethod;10.CTAB
method;11.CTABmethod;12.ImprovedCTABmethod.
图 1　不同提取方法枸杞叶片 DNA电泳
Fig.1　ElectrophotogramofDNAextractedfromLyciumbarba-
rumL.leafbydiferentmethods
3　结论与讨论
5×CTAB法利用提高 CTAB浓度的办法提取枸杞干果
DNA,未能获得满意的效果 。其原因可能是 CTAB具有一定
的黏性 ,若其浓度过高 ,保温时材料与 CTAB缓冲液难以充
分混匀 ,造成材料发泡不均匀 ,需延长保温时间 ,从而增加
DNA降解。
在分子生物学研究中 ,所提 DNA的质量是试验成败的
关键。目前 ,植物基因组 DNA的提取方法主要有 CTAB法 、
SDS法以及试剂盒提取法等 。枸杞干果组织中含有较多的
糖和酚类物质 ,试验中应选用合适的基因组 DNA提取方法 ,
以满足 RAPD分析的要求 。
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(上接第 69页)
能量消耗增加 ,重则加速植物衰老 ,直至死亡。质膜和液泡
膜水通道蛋白协同一些离子转运子及渗透调节物质快速调
节并保持适当细胞质渗透压 ,避免胞外突发渗透压变化造成
胞质的渗透振荡。
该研究将抗逆基因与环境友好型筛选体系结合起来 ,为
选育抗逆作物新品种和植物抗逆机理研究提供了参考和
依据。
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