全 文 ：植 物 学 报 1 , 9 2 , 3 4 ( 5 ) : 3 3 9一 3 4 5
A e t口 B o t口 n 亡e a 5 1月 f e a
甘蓝型油菜和紫菜苔花粉
原生质体的大量分离 *
李仕琼 杨弘远 周 嫦
(武汉大学生物系 , 武汉 43 。。 7 2 )
摘 要
第一次由两种芸苔属作物甘蓝型油菜 ( B r a , ; , c a o J 户u s L . ) 和紫菜苔 ( B . e a 。 户 , , : r `: , a r .
妇 rP 。 “ )的成熟花粉中成功地分离出大量原生质体 。 分离率最高分别达 6 6 . 7% 与 7 0 4汤 。
绝大多数花粉原生质体是生活的 。 在分离技术上 , 改进了原来在几种单子叶植物中所用的水
合与酶解同时进行的“ 一步法” , 建立了适于油菜和紫菜苔的“ 二步法” , 即 : 首先将花粉经长时
间水合吸胀 , 脱去外壁获得仅有内壁的花粉 ;然后通过酶解除去内壁获得花粉原生质体 。 研究
了影响水合与酶解两个过程的各种因素 。
关键词 花粉原生质体 ;甘蓝型油菜 ;紫菜苔
R E L E A S E O F P O L L E N P R O T O P L A S T S I N
T I T I E S I N B R A S S I C A N A P U S A N D B
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A b s t r a c t
P r ot o p l a st s w e r e r e l e a s e d in l a r g e q u a n t i t ie s f r o m m a t
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` e d a n d w a s d e t a e h e d f r帅 : h e P ol le n g r a i n s w h i e h w e r e th e n e o v e r ed by i n t i n e a l o n e . S ec o n d ,
本文于 1 991 年 5 月收到 , 同年 8 月收到修改稿 。
. 国家自然科学基金和高等学校博士学科点专项科研基金资助的课题 。
植 物 学 3 4 卷
t h e h v d r at e d P oll e nw as t r a ns f e r r e d i nt a one nz ym e s ol u r i n o
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P多产r P l l r e a
近几年来 , 花粉原生质体的研究有很大的进展 4[] , 不仅从好几种值物的花粉中分离出
大量原生质体 ,而且开展了有关培养 it, 幼 ’ 、 融合叼 、 超微结构 〔王 .9l 、 微丝骨架口等多方面的研
究工作 。但是 , 迄今能够大量分离花粉原生质体的 , 主要是几种单子叶植物 , 如百合科的罄
香百合 L, ,lJ 、 聋草 2[] 、 黄花菜「14] , 石蒜科的风雨花 ` , , , 莺尾科的莺尾 〔, ’ 、 朱顶红【, ` , 等。 至于双
子叶植物 (例如烟草 )花粉原生质沐的分离 , 虽然早期曾有报道 , 但并不能获得大量生活的
花粉原生质体 汇6] 。 从另一角度看 ,上述几种植物均为花卉植物 , 而在主要农作物中 , 无论
双子叶或单子叶植物 , 至今没有一 种能够获得大量的花粉原生质体 。 这种现状对于本项
技术的进一步应用有所 限制。 甘蓝型油菜和紫菜苔既属于双子叶植物中的十字花科芸苔
属 , 又是重要的油料或蔬菜作物 。 我们改进了原有技术 , 建立了一种新的分离方法 , 成功
地 由这两种植物的花粉中分离出大量原生质体 。
材 料 与 方 法
(一 ) 材料 甘蓝型油菜 ( B r a : : i c a n u 户二 5 L . ) 和紫菜苔 ( B · c a幼户e 了` r i ` v a r · 户u r -
P , r e a )
。
(二 ) 花粉原生质体分离 第一步 : 水合 。 由刚刚开放的花朵中摘取花药 , 置于水合
液 (成分见后文 )中 , 用平头玻漓棒轻压挤出花粉 。 花粉悬浮液经 4 0 目不锈钢 网过滤除
去药壁残渣 , 盛于培养皿中 , 在 28 一 30 ℃ 下保温 。 定时取样观察计数 。 第二步 : 酶解 。将
水合后的花粉悬浮液离心沉淀 , 除去上清液 。 将 沉淀物转人含 1外 纤维素酶 ( o n oz u ka
R
一 1 0) 和 l 肠 果胶酶的介质 (成分见后文 )中 , 在 28 一 30 ℃ 下酶解 。 定时取样观察计数 。
(三 ) 观察与计数 用 A O 18 2 0 B i o s t a : 型倒置显微镜和 O l y m p u s B H 一 2 型显微
镜观察花粉原生质体的分离过程并摄影 。 用荧光素二醋酸醋 ( F D A , 5 0邵 g /m l) 鉴定生活
力 ,在 A O H 1 10 F l u o r e s t a r 型荧光显微镜 (滤光组合为 2 0 7 3 , 即激发滤光片 4 3 6 , 分色
镜 4 5 0 , 阻挡滤光片 4 7 , )下观察与摄影 。 计算通过水合所获得的去外壁花粉分离率 (去外
壁花粉数 /观察花粉总数 x 1 0 多 )和通过酶解后所获得的花粉原生质体分离率 (花粉原生
质体数 /观察花粉总数 x 1 0 呢 )。
结 果
实验初期 , 采用原有的水合与酶解同时进行的方法 (简称 “ 一步法 ” ) 『幻 尝试分离甘蓝
型油菜和紫菜苔花粉原生质体 。 结果只有极少数花粉能够释放原生质体 。 多数花粉不能
释放原生质体 , 在酶液中最终破裂。 以后经过改进 ,建立了 “ 二步法 ” , 在两种植物中均分
离出大量花粉原生质体 。 此法的特点是 : 首先将花粉经过一段时间水合 , 通过吸胀作用
促使外壁脱离 , 得到仅有内壁复盖的花粉 (简称 “ 去外壁花粉 ” ) , 然后再将后者酶解除去内
, 期 李什琼等 : 甘蓝型油菜和紫唯苔花粉原生质休的大量分禽
壁 , 得到原生质体 。 分别讲究了这两个步骤中影响分离效果的关键因素 。 照片仅以油菜
为例 。
(一 ) 第一步 : 水合脱去外壁
油菜与紫菜苔花粉均为三沟型 。 干燥的花粉呈长椭球形 。 置人水合液后很快膨胀为
椭球形 (图版 I , 1 ) 。 水合 1 小时 以后 , 部分花粉 ,」勺夕卜壁沿萌发沟一瑞开裂 , 露出内壁的一
部分 (图版 I , 2 ) 。 水合继续进行 ,外壁完全脱离 , 仅由内壁包围的花粉游离出来 , 此种去外
壁的花粉仍保持椭球形 (图版 I , 3一 5 ) 。 F D A 检测表明它们是生活的。
去外壁花粉的分离率 , 因下列因素的变化而异 :
1
. 水合液成分 比较了 。 . s m ol / L 的蔗糖水沱液 、 甘露醇水溶液 以及在二者中分别
加人 K 3培养基的无机盐的效果 。 结果表明 , 在加有 K , 培养基的水合液中花粉难以脱去
外壁 , 而在单独的蔗糖或甘露醇水溶液中脱壁 良好 , 其中甘露醇比蔗糖效果更好 (表 1 ) 。
但是进一步酶解的结果 , 来源于甘露醇液的去外壁花粉很少产生原生质体 ;而来源于蔗塘
液的去外壁花粉则易于产生原生质体。 因此以后的实验均采用蔗糖水溶液作为水合介质 。
表 1 水合 介质对去外璧的影响 .
T a b l e 一 E f f e e t o f h y d r a t i o n m e d i a o n r e m o v a l o f e x i n e
水合介质 观察花粉数 天外壁花粉分离率
H y d r a t i o n m e d i a
P o l l e n g r a i n s
P e r c e n t a g e o f P o
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去外壁花粉数
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* 水合 4 小时观察统计 。
o b ` e r v a t i o n a t 斗h o f h y d r a t i o n .
2
. 蔗糖浓度 蔗糖浓度对脱外壁的效果有很大影响 。 浓度过低 ( 0 . s m ol / L ) 或过高
( l
.
Zm ol / L ) 均很难获得去外壁花粉 。 在油菜与紫菜苔两种材料中 , 均以 1 . o m 。 l / L 蔗糖
溶液最为适宜 (表 2 ) 。
3
. 水合时间 花粉的脱外壁过程相 当缓慢 。 在 l m o l/ L 蔗搪水溶液中 , 从水合 2 小
时后开始有少数花粉脱去外壁 。 随着时间延长 , 去外壁花粉数递增 , 至 9小时达最高值
(表 3 )。 以后再延长水合时间作用不大 。 在保温过程中 , 间常轻轻摇动培养皿有利于促
进外壁脱离 。 水合一定时间后加水冲击可加速脱壁过程 ,但 F D A 侧定表明 , 这不利于保
存去外壁花粉的生活力。
(二 ) 第二步 : 酶解获得花粉原生质体
3 4 2 植 物 学 报 3咭 卷
表 2
T a bl e 2
.
E f f e et o f
蔗枪浓度对去外壁的影响 .
s u e or s e eo n e ne t ra t i o n o n r em o
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* 水合 , 小时观察统计。
o b` e r v a t i o n a t s h o f h y d r a t i o n .
表 3 水合时间对去外壁的影响 *
T a b l e 3
.
E f f e e t o f h y d r a t i o n d u r a t i o n o n r e m o v a l o f e x i n e
水合时间 (小时 )
H y d r a r i o n d u r a t i o n
( h r )
观察花粉数 去外壁花粉数
P o l l e n g r a i n s o b s e r
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P o l l e n g r a i n s d e t a e h
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去外壁花粉分离率
P e r e e n t a g e o f P o l l e n
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7斗一 7
. 渗透压调节剂 : l m ol / L 蔗糖。
R e g u l a r o r o f o s m o t i c p r e s s u r e , l m o l / L
s u c r o s e
·
将水合后的花粉转人酶液后 , 由于花粉的内壁暴露于酶液中而降解 , 原来椭球形的去
外壁花粉逐渐变圆 ,成为典型的原生质体 (图版 I , 6 ) 。 酶解的效果与水合时间有关 : 当水
合不充足时即转人酶液 , 由于相当多的花粉尚未完全脱去外壁 , 致使酶解所得原生质体不
是很多 。 充分水合后 ,酶解所得原生质体产量较高 (图版 I , 7 ) , 90 多 以上具有生活力 f图
版 I , 8 ) 。 酶解的时间以 4一 6 小时为宜 。
酶解的效果因下列因素的变化而异 :
1
. 酶浓度 比较了 0 . 5一 2 外范围内不同配比的纤维素酶与果胶酶的浓度 , 结果表明
下 期 李仕琼等 : 甘蓝型油菜和紫菜苔花粉原生质体的大量分离 3 4 3
原生质体分离率没有显著差异 。 单独的纤维素酶亦有效 , 但单独的果胶酶则无效 。 以后
实验均采用 1务纤维素酶与 1并果胶酶的配比 。
2
. 渗透压调节剂 比较了 l m o l / L 蔗糖或甘露醇作为酶液中渗透压调节剂的效果 。
结果表明 ,在油菜与紫菜苔两种材料中均以甘露醇的效果较好 。
3
. 盐离子 在酶液中加人盐离子对原生质体分离率有重要作用 。 加人 K , 培养基的
大量元素与微量元素洲或 C P W 13 M ISJ 均有很好的效果 , 而不加盐离子的酶液中原生质体
分离率很低 (表 4 ) , 原生质体大多破损死亡 。
表 4 酶液中无机盐离子对分离花粉原生质体 的影响 *
T a b l e 4
.
E f f e e r o f i n o r g a n i c s a l t s i n e n
z y m e s o l u r i o n o n 一s o l a t i o n o f
p o l l e n p
r o 盆 o p l a s z s
材 料
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无机盐离子 观察花粉数
I n o r g a n l e s a l t s
P o l l e n g r a i n
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花粉原生质体数
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甘蓝型油菜
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. 在 l m o l / L 蔗塘溶液 中水合 9 小时后酶解。
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.
4
. 保护剂 在酶液中分别添加牛血清 白蛋白 ( B S A ) 、 聚乙烯毗咯烷酮
聚糖硫酸钾 ( PD s ) , 与不含以上保护剂的对照相比 , 没有明显的有利作用 , 唯
改进效果 (表 5 ) 。
( p V p )
、 葡
P D S 略有
表 S 酶液中含保护剂与否对分离花粉原生质体的影响*
T a b l e 5
.
E f r e c t o f p
r o t e e t a n t s i n e n z y m e s o lu t i o n o n i s o l a t i o n o f p o ll e n p r o t o p l a s t s
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花粉原生质体分离率一
P e r c e n t a g e o f P o l l e 。
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t 在 l o ol ZL 蔗糖溶液 中水合 8 小时后酶解 。
E n : 了m a t i c t r e a t m e o t a f t e r 8 h o u r : o f p r e h y d r a t i o n i n 一m o l / L s u c r o s e s o l u t io n .
植 物 学 报 3峪 卷
总结上述实验结果 , “ 二步法 ” 的主要技术要点如下 :
( l) 水合 : 将花粉悬浮于 l m o l/ L 蔗糖水溶液中 , 在 28 一 30 ℃ 下保温 9 小时 , 可有
约 61 多 (油菜 )或 75 外 (紫菜苔 )的花粉脱去外壁 。
( 2 ) 酶解 : 将水合后的花粉悬浮液离心沉淀 , 转人含 1多 纤维素酶 、 l 多果胶酶 、
l m ol / L 甘露醇 、 0 . 5多葡聚糖硫酸钾的 K 3 培养基或 C PW 13 M 中重新悬浮 , 在 2 8一 30 ℃
下酶解 4一 6 小时 , 可获得高达 67 多 (油菜 )或 70 多(紫菜苔 )的花粉原生质体分离率。
讨 论
由花粉分离原生质体的主要困难在于花粉外壁的基本成分抱粉素迄今无法酶解 。 近
年大量分离花粉原生质体的成功事例均是利用花粉水合后的吸胀作用撑破外壁 , 使含果
胶质与纤维素的内壁大面积地处于酶的作用之下而被降解 41[ 。 因此 , 如何促进外壁裂开
是技术的关键所在 。 外壁结构的种属特点具有决定的作用 。 周嫦与杨弘远 ( 1 9 8 9 ) 曾指
出 : 当前取得成功的几种百合科 、 石蒜科与莺尾科植物 , 其外壁较薄 、 萌发沟宽阔等生物
学特点是它容易开裂的重要因素 4[] 。 这类花粉置于酶液 以后很快吸水膨胀 、 外壁开裂 , 可
以说 ,其水合与酶解几乎是同时进行的 , 采用 “ 一步法 ” 即可顺利地分离大量花粉原生质
体 。 本文所研究的两种芸苔属花粉同样具有萌发沟 ,但外壁较厚而坚硬 , 用 “ 一步法 ” 只能
分离出很少的原生质体 。 如将水合与酶解两个步骤分开 , 使花粉先经较长时间水合 , 脱去
外壁而获得仅有内壁的花粉 ;然后再进行酶解 ,除去内壁而获得大量原生质体 。 实验结果
表明 , 在 “ 二步法 ” 中 , 第一步所用的水合液只可含有蔗糖 , 不可含有培养基中的盐离子 , 否
则外壁不能开裂和脱落 ;而第二步所用的酶液则非含有盐离子不可 , 否则原生质体不能保
护完好 。 这种将水合和酶解分为先后两步的方法 , 也许能在更多的植物中应用于分离花
粉原生质体 , 尚需今后试验 。
甘蓝型油菜与紫菜苔是有重要经济价值的作物 。 它们的花粉原生质体大量分离取得
成功 ,使这一技术今后应用于作物改 良的距离更为缩短了 。 周嫦与杨弘远 ( 1 9 8 9 ) 〔叮 、 Y a n g
a n d hz
。
u( l 9 9 2 )
〔` 3 , 曾提出利用花粉原生质体两条发育途径开展遗传工程的设想 。 目前
在配子体途径方面已由唐葛蒲成熟花粉原生质体产生大量花粉管 田 ; 在抱子体途径方面
已由营草幼嫩花粉原生质体培养出多细胞团 〔引 。 u o da 等 ( 19 9 0 ) 用电融合法使廖香百合
的成熟花粉原生质体互相融合 , 经过短期培养后 , 融合体中来自双方的两个生值细胞均可
分裂成精子 i2t] 。 由于花粉原生质体具有单倍性的优点 , 今后在基因转人和转化实验中可
以加以利用 。 下一步可以试验用摄入外源遗传物质的油菜或紫菜苔成熟花粉原生质体进
行授粉 、 受精。 在这两种植物 中 , 幼嫩花粉原生质体的分离尚待突破 。 如亦能成功 , 则借
鉴 目前国际上已经相当成熟的油菜花粉粒培养技术 , 促使幼嫩花粉原生质体细胞分裂以
至再生植株 ,也是很有前途的 。
参 考 文 献
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5 期 李仕琼等 : 甘蓝型油菜和紫菜苔花粉原生质体的大量分离 3 4 5
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图 版 说 明
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甘蓝型油菜花粉原生质体的分离。
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. 水合后的花份粒 。 火 2 0 2一 6 . “ 二步法 ” 分离花粉原生质体的过程。 只 , 0 2一 .5 水合作用使花粉脱去外
壁 , 释放出仅有内壁的花粉。 6 . 酶解后内壁 降解 , 获得花粉原生质体 。 .7 分离得到的花粉原生质体群体 。 只 1 50 8 .
F D A 染色示花粉原生质体生活力。 图中阴影为空花粉外壁 的荧光 。 丫 20 。
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书 讯
由吴兆洪 、 朱家榕 、 杨纯瑜编著的 《 中国现代及化石蔽类植物科属辞典》 将于 1 99 2 年 6 月由中国科学技术出版社
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