全 文 ：� 2942 � 中华中医药杂志(原中国医药学报)2013年 10 月第28卷第10期 CJTCMP , October 2013, Vol .28, No. 10
·论著·
响应面分析南方红豆杉枝条多糖超声提取工艺及其
抗氧化作用研究
李石清1,2，张春椿1，徐磊1，熊耀康1,2
（1浙江中医药大学，杭州 310053；2浙江省食品药品检验研究院，杭州 310053）
摘要：目的：研究南方红豆杉枝条中多糖的超声提取工艺及抗氧化作用。方法：在单因素实验基础上，采
用响应面分析法对影响南方红豆杉枝条中多糖提取率的主要因素进行优化，建立影响因素与响应值之间的数学模
型，确定最佳超声提取工艺条件；通过DPPH自由基清除率、还原力和总的抗氧化活性的测定，分析其抗氧化作
用。结果：最佳超声提取工艺为：料液比26.78（V/W），提取时间42.81min，超声频率为33.88kHz，提取2次；南
方红豆杉多糖对DPPH自由基具有一定的清除作用，总的抗氧化活性和还原能力均随多糖浓度的增加而上升。结
论：采用该方法对提取条件进行优化，合理可靠，能为生产工艺提供理论依据；其多糖具有较强的抗氧化作用。
关键词：南方红豆杉；多糖；超声提取；响应面分析；抗氧化作用
基金资助：浙江省中医药重点项目（No.2011ZZ003），浙江省科技厅项目（No.2012C23109），浙江省大学
生科技创新项目（No.2012R410042，No.2011R410033），浙江省自然科学基金（No.LQ12H28003），浙江省研究
生科研创新项目（No.752214C001）
Study on ultrasonic extraction of polysaccharides from branches of Taxus mairei (Lemee
et Levl.) S. Y. Hu ex Liu by response surface method and its antioxidant activity
LI Shi-qing1,2, ZHANG Chun-chun1, XU Lei1, XIONG Yao-kang1,2
( 1Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2Zhejiang Provincial Food and Drug Inspection Institute,
Hangzhou 310053, China )
Abstract: Objective: The research aimed to optimize the extraction technology of polysaccharides from the branches
of Taxus mairei (Lemee et Levl.) S.Y. Hu ex Liu and study its antioxidant activity in vitro. Methods: Based on the single factor
experiment, the main elements (the ratio between liquid and solid, the extraction time, and the ultrasonic frequency) aff ecting
the extraction rate of polysaccharides from the branches of Taxus mairei (Lemee et Levl.) S. Y. Hu ex Liu were optimized by
using response surface analysis, and the functional relationship between the response value and elements was established. The
antioxidant activity of the polysaccharides in vitro was evaluated by the methods of scavenging DPPH radical, reducing power and
total antioxidant capacity. Results: The result of the experiment showed the optimum extraction condition as follow: 26.78 times
of water, extracting 42.81min by 33.88kHz ultrasonic frequency two times. The scavenging capacity of DPPH, reducing power
and total antioxidant activity increased with the increasing concentration of polysaccharides. Conclusion: It is feasible and reliable
to optimize the conditions of extracting the polysaccharides from the branches of Taxus mairei (Lemee et Levl.) S. Y. Hu ex Liu
by response surface analysis, which lays the theoretical foundation to its production process. The polysaccharides have strong
antioxidant capacity in vitro.
Key words: Taxus mairei (Lemee et Levl.) S. Y. Hu ex Liu; Polysaccharide; Ultrasonic extraction; Response surface
analysis; Antioxidant
Fund assistance: Key Project of Traditional Chinese Medicine of Zhejiang Province (No.2011ZZ003), Science and
Technology Project of Zhejiang Province (No.2012C23109), Science and Technology Project of the College Students of Zhejiang
Province (No.2012R410042, No.2011R410033), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.LQ12H28003), Science
and Technology Project of the Graduate Student of Zhejiang Province (No.752214C001)
通讯作者：熊耀康，杭州市滨江区滨文路548号浙江中医药大学药学院中药资源与鉴定教研室，邮编：310053，电话：0571-86633118
E-mail：xiongyaokang@126.com
南方红豆杉[Taxus mairei （Lemee et Levl.） S.Y.
Hu ex Liu]系裸子植物红豆杉科红豆杉属植物，为我
国特有的传统中药材，素有“植物黄金”之称[1]。其
抗癌活性成分是以紫杉醇为主的二萜类化合物，但
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表1 响应面分析法的因素与水平表
因素 水平 -1 0 1
X1 20 25 30
X2/min 30 40 50
X3/kHz 28 32 36
由于紫杉醇含量低、水溶性差、口服生物利用度差等
特点，限制了其临床应用的有效性。且临床应用中多
以水煎煮入药，煎煮成分中含有大量的多糖物质，因
此，研究红豆杉中所含有的其它活性物质，有着重要
的临床意义和经济价值。多糖为一种非细胞毒物质，
具有多种生物活性，如降血脂及抗氧化作用、免疫调
节活性、抗突变、抗病毒及抗肿瘤等，其作用可能与
多糖的抗氧化活性有关[2-3]。目前关于响应面分析超声
提取南方红豆杉多糖及其抗氧化活性的研究国内未
见报道。因此，本课题采用响应面分析法研究南方红
豆杉多糖提取工艺，以及其抗氧化能力，为红豆杉多
糖的药用奠定基础，为其生产应用提供理论依据。
材料
1. 药材与试剂 南方红豆杉药材购于宁波泰康
红豆杉种植基地，经浙江中医药大学张水利副教授
鉴定为红豆杉科红豆杉属南方红豆杉[Taxus mairei
（Lemee et Levl.） S.Y. Hu ex Liu]枝条。将药材阴干，
粉碎，过60目筛，制成南方红豆杉药材粉末，备用。
葡萄糖标准品（批号：110833-200904，购自中
国药品生物制品鉴定所）、1，1-二苯基-2-苦肼基
（DPPH）、钼酸胺、苯酚、硫酸、磷酸钠、硫酸亚铁、
无水乙醇、BHT、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化
钾、三氯乙酸、氯化铁等（购自杭州康贸五交化有限
公司），均为分析纯。
2. 仪器 AR2140电子天平（上海奥豪斯国际
有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪
器厂）；KQ2200DA型数控超声器（昆山市超声仪器
有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛
津）；SHB-3T循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸
有限公司）。
方法与结果
1. 多糖含量的测定
1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥后的葡
萄糖标准品9.60mg，定容于100mL容量瓶中，摇匀，
得浓度为0.096mg/mL对照品溶液，备用。
1.2 供试品溶液的制备 称取干燥至恒重的南
方红豆杉药材粉末5.0g，置于250mL锥形瓶中，加水
100mL，超声提取40min，提取2次，过滤，合并滤液，
浓缩，醇沉，Sevage法除蛋白后，定容于50mL容量
瓶，作为供试品溶液。
1.3 标准曲线的建立 分别精密移取0.1，0.2，
0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL葡萄糖对照
品溶液，以蒸馏水补至2.0mL，然后加入6％苯酚水
溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，冷却30min
后，以蒸馏水作空白对照，用紫外-可见分光光度法
在490nm波长下测定吸光值，以葡萄糖的含量x为横
坐标，吸光值y为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回
归方程：y=5.9239x+0.0261，r=0.9995，表明芦丁在
0.0096-0.1728mg范围内呈良好的线性关系。
1.4 精密度测定 精密量取“1.1”项下葡萄糖对
照品溶液1.0mL，依“1.3”项中显色方法操作，在波长
490nm处连续测定5次吸光度值。结果RSD=1.08%，精
密度实验符合要求（<3%），表明仪器的精密度良好。
1.5 稳定性试验 精密量取同一供试品溶液
0.5mL，按供试品溶液制备方法制备，依“1.3”中显
色方法操作，在波长490nm处分别测定放置30、60、
120、180、240min后的吸光度值。结果RSD=1.17%，
表明该方法重现性良好。
1.6 加样回收率实验 取已知多糖含量的南方
红豆杉样品6份，分别精密添加已知浓度的葡萄糖对
照品适量。按供试品溶液制备方法制备，按“1.3”项
操作，测定多糖含量，计算回收率，结果平均回收率
为97.53％，RSD为1.43％，表明方法的准确性良好，
方法可行。
2. 超声提取工艺研究 分别称取干燥至恒重
的南方红豆杉药材粉末5.0g，根据Box-Benhnken中
心组合设计原理，结合单因素实验结果，选取料液
比（X1），提取时间（X2），超声频率（X3）3个因素，
每个自变量以-1、0、1进行编码，采用Design expert
7.1.6软件进行设计，并对实验数据进行响应分析。以
南方红豆杉枝条中多糖提取率作为响应值（Y）。方
案及试验结果见表1、表2，按其选择的因素和水平
进行超声提取2次，合并提取液，浓缩，过滤，醇沉，
Sevage法除蛋白后，定容于50mL容量瓶，作为供试品
溶液。取供试品溶液适量，其余操作同“1.3”项，测
定多糖含量。结果见表2。
利用Design expert 7.1.6软件对表2的结果进行
多元线性回归拟合，得到多糖提取率（Y）对料液比
（X1）、提取时间（X2）、超声功率（X3）的二次多项
回归方程：
Y=53.27+3.52X1+1.44X2+1.64X3+1.69X1X2+1.22X1
X3+0.083X2X3-6.44X12-3.70X22-2.23 X32。
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方差来源 平方和 自由度 均方和 F值 P值
模型 354.090 9 39.340 23.490 0.0014
X1 99.190 1 99.190 59.210 0.0006
X2 16.560 1 16.560 9.890 0.0255
X3 21.580 1 21.580 12.880 0.0157
X1 X2 11.360 1 11.360 6.780 0.0480
X1 X3 5.930 1 5.930 3.540 0.1187
X2 X3 0.027 1 0.027 0.016 0.9035
X1
2 152.940 1 152.940 91.290 0.0002
X2
2 50.430 1 50.430 30.110 0.0027
X3
2 18.330 1 18.330 5.350 0.0213
残差 8.380 5 1.680
失拟项 8.170 3 2.720 26.800 0.0362
纯误差 0.200 2 0.100
总计 362.470 14 　 　 　
表3 响应面法对多糖提取量的ANOVA分析结果
频率的二次项（X32）等4个因子的P值<0.05，表明对
多糖提取率影响显著；料液比与超声频率的二次项
（X1X3）、提取时间与超声频率的二次互交项（X2X3）
的P>0.05，说明该因子对提取率的影响不显著。失
拟项检验的P=0.0362（显著），表明模型充分拟合实
验数据，受其他因素的影响不显著，测量的信噪比为
13.152，信噪比>4为合理，说明该模型可靠[4-5]，可作为
南方红豆杉枝条中多糖提取率与提取工艺参数的合
适数学模型。
根据回归方程可以绘制各因素对多糖得率影响
的响应面图和等高线图（见图1-图6）。该拟合方程
的二次项系数均为负数，所以开口向下。等高线图同
一曲线上多糖得率相同，图形中心多糖得率最高，从
中心到边缘得率逐渐降低。等高线图沿某一因素轴
图2 Y=f1（X1，X2）响应面图（X3=0）
B：提取时间（min） A：料液比
图1 Y=f1（X1，X2）的等值线图（X3=0）
B：
提
取
时
间（
mi
n）
A：料液比
图3 Y=f2（X2，X3）的等值线图（X1=0）
A：料液比
C：
超
声
频
率（
kH
z）
实验编号 X1 X2 X3 Y（mg/g）
1 -1 -1 0 39.28
2 1 -1 0 42.51
3 -1 1 0 40.39
4 1 1 0 50.36
5 -1 0 -1 39.86
6 1 0 -1 44.91
7 -1 0 1 41.86
8 1 0 1 51.78
9 0 -1 -1 45.72
10 0 1 -1 46.83
11 0 -1 1 47.69
12 0 1 1 49.13
13 0 0 0 52.98
14 0 0 0 53.21
15 0 0 0 53.61
表2 响应面实验结果
注：共有15个实验，其中12个为析因实验，3个为中心实验以估
计误差。
上述回归模型进行方差分析，其回归方程的有
效性及各因素对提取率的影响程度见表3。
由表3可知，模型P<0.01，回归方程具有显著性。
其中，料液比（X1）、料液比的二次项（X12）、提取时
间的二次项（X22）等3个因子的P值均<0.01，表明对
多糖的提取率影响极显著；提取时间（X2）、超声频
率（X3）、料液比与提取时间的互交项（X1X2）、超声
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方向曲线密度越大，说明多糖得率对该因素的变化
越敏感，其影响因子越高，反映在响应曲面上则是曲
面坡度越陡峭，反之，则其影响因子越小。等高线图
的形状则可反映因素间交互作用的强弱，图形趋向
椭圆且椭圆轴线与坐标轴的角度越大，则交互作用
越明显，反之则交互作用越弱[6-7]。据此分析所得等
高线图与相应曲面，可以得出各因素影响因子的排列
为：超声频率＞提取时间＞料液比。
对实验模型进一步分析，得理论最佳超声提取
条件为：料液比26.78（V/W），提取时间42.81min，超
声频率为33.88kHz。并在料液比为27（V/W）、提取
时间43min、超声频率为34kHz时，进行验证试验，结
果测得多糖提取平均值为52.11mg/g，RSD=0.56%。
与响应预测值相近，证明该工艺稳定，重现性好。
3. 抗氧化作用研究
3.1 DPPH自由基清除率的测定 精密称取DPPH
4.5mg，用无水乙醇溶解并定容至100mL棕色容量
图4 Y=f2（X2，X3）响应面图（X1=0）
A：料液比C：超声频率（kHz）
图5 Y=f3（X1，X3）的等值线图（X2=0）
C：
超
声
频
率（
kH
z）
B：提取时间（min）
图6 Y=f3（X1，X3）响应面图（X2=0）
C：超声频率（kHz） B：提取时间（min）
图8 南方红豆杉枝条多糖的还原力
y=0.7507x+0.2663
R2=0.9982
1.0
瓶中，得浓度为0.08mol/L的DPPH溶液，避光保存，
备用。分别取不同浓度的各样品溶液1.0mL，置10mL
离心管中，加入3.0mL的DPPH溶液，室温避光反应
30min，同时以蒸馏水为空白，于517nm波长处测定吸
光值。计算DPPH自由基清除率[8-9]，二丁基羟基甲苯
（BHT）做为阳性对照。重复3次，求平均值。
由图7可知，南方红豆杉枝条中的多糖对DPPH
自由基具有很强的清除活性，且在0.1-1.0mg的含量
范围内，对DPPH自由基的清除率随着多糖浓度的
升高。对DPPH自由基清除率的IC50为0.18mg。当多
糖含量为1.0mg时，其对DPPH自由基的清除率达到
94.72%。
3.2 还原力的测定 取不同浓度的各样品溶液
1.0mL，加入0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH=6.6）2.5
mL和1%铁氰化钾溶液2.5mL，得混合物于50℃水浴
保温20min，然后加入2.5mL 10%（W/V）三氯乙酸溶
液，混合溶液3 000r/min离心10min，精密吸取上清液
2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%三氯化铁溶
液，在700nm处测吸光度[10]，吸光度代表多糖的还原
能力（吸光度值越大，还原力越强）。重复3次，求平
均值。
由图8可知，南方红豆杉枝条中的多糖具有较强
的还原能力，且还原能力随多糖含量（0.1-1.0mg）的
升高而增强，当多糖含量为1.0mg时，其还原能力在
700nm下的吸光值为1.024；IC50为0.31mg。且还原能
力（y）与多糖含量（x）呈正相关：y=0.7507x+0.2663，
图7 南方红豆杉枝条多糖对DPPH自由基的清除率
南方红豆杉枝条多糖
BHT
1.0
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讨论
本文通过响应面分析法对南方红豆杉枝条多糖
超声提取工艺进行了优化，并得到回归方程。结果表
明，料液比、提取时间和超声频率对多糖提取率影响
显著。最终确定南方红豆杉枝条多糖的最佳提取工
艺条件为：料液比26.78（V/W），提取时间42.81min，
超声频率为33.88kHz。该方法简单，工艺路线清晰，
提取率较高[11]。超声可以强化水与药材的浸渍，达到
省时、高效的目的，可以作为中药提取的新工艺。
从南方红豆杉枝条中提取的多糖具有较强的抗
氧化能力，对体外自由基有较好的清除作用。并且其
清除DPPH自由基能力、总的抗氧化活性和还原力均
随多糖浓度增加而增强，且在一定范围内，多糖浓度
与其抗氧化活性呈显著的线性关系。
参 考 文 献
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（收稿日期：2012年8月20日）
r=0.9982。
3.3 总的抗氧化活性的测定 分别取不同浓度的
样品溶液各1.0mL，置10mL离心管中，加入3.0mL试剂
溶液（试剂溶液中包括0.6mol/L硫酸、28mmol/L磷酸
钠、4mmol/L钼酸铵）。混合液于95℃水浴锅中分别
水浴30、60、90、120、150min。放冷至室温，695nm
处测吸光度值。以蒸馏水为空白，吸光度值越大，表
明抗氧化能力越强。BHT做为阳性对照。重复3次，
求平均值。
由图9可知，南方红豆杉多糖具有较强的抗氧化
能力，且总的抗氧化活性的大小与多糖的浓度成正
比，即随着多糖含量（0.1-1.0mg）的升高而增强，当
多糖含量为1.0mg时，总的抗氧化活性在695nm下的
吸光值达到0.806，表明具有较强的抗氧化能力。
图9 南方红豆杉枝条多糖总的抗氧化能力
南方红豆杉枝条多糖
BHT
1.0