全 文 ：植 物 学 报 1 9 9 1 , 5 3 ( 9 ) : 6斗9一 6 5 7
减c t a B o t o n i e o S犷n 沁 a
紫菜苔精细胞的大量分离和生活力保存 *
莫永胜 杨弘远
(武汉大学生物系 , 武汉 4 3。。 7 2 )
摘 要
木工作改良了原有的渗透压冲击法和研磨法 ,从紫菜苔 ( 刀 r 。 , 了￡c 。 。 。 , 户 , s , r奋r , a r . 户 , ,户, -
r , 。
) 花粉粒中分离出大量生活精细胞 。 根据荧光素二醋酸醋测定 , 上述二法生活精细胞的分
离率分别为 3斗% 和 86 % 。 应用改良的研磨法分离的精细胞在 4 ℃ 低温下最长可存活一 周 。
对影响精细胞分离率和生活力的若干因素进行了比较 。 细胞学观察表明 , 从一粒花粉刚分离
出来的一对姊妹精细胞成对相连 ,其中一个具长尾状延伸物 , 尾部也呈 F D A 荧光反应 。 对倩
细胞分离后的形态变化进行了观察 。
关键词 精细胞 ; 分离 ;紫菜苔
M A S S I S O L A T I O N A N D P R E S E R V A T I O N O F V I A B L E S P E R M
C E L L S I N B R A S S I C A C A则 rP E S T R I S V A R . 尸 U 尺尸口况 E A
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( D e户a护 t仍 己行宕 o f B i口 l o g y , 牙u 孟a ” U 称 i夕 e r ` i不y , W u h a n 43 00 7 2 )
A b s t r a e r
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e t w o 一 s t e p os m o t i e s五o e k a n d g r i n d i n g m e t h od s r e p o r t ed b y Y a n g a n d Z h ou ( 198 9)
w e r e m o d i f ie d f o r is o l a t i o n o f v ia b l e s p e r m e e l l s i n l a r g e q u a n r it i e s f r om P of l
e n g r a i n s o f
B r a s s i c a c a m P e s t r i了 v a r
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P多一r P u r e a
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F a e t o r s a f f e e t i n g th e y i e l d a n d s u r v i v a l o f 认ol a t e d s P e r m
e e l l s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d
.
T h e s e in e l u d e d p h y s i o l o g i e a l s t a t u s o f d o n o r f l o w e r s
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A s a r e s u l t
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F o r os m o t i e s h o e k m
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.
A f t e r r em o
v a l o f P o l le n w a l l d e b r is by f i l t r a t i o n a n d ce n t r i f u g
-
本文于 19 91 年 l 月收到 。
李仕琼同志参加了部分工作 。
* “ 8 63 ” 生物技术项目和高等学校博士学科点专项科研 基金资助的课题 .
植 物 学 报 3 3卷
at i o n
, t h e s p e r m 。 e l l一 r i e h p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n a m e d i u m 。 o n t a i n i n g 20% s u e
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.
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C y o o l o g i e a l o b o e r v a t i o n s r e v e a le d r h a t p a i r s o f e l l i P s o i d a l s p e r m e e l l s i u
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s p e r m e e l l : 15 0一a r i o n : 奋 a , ; i c a c a m P e : z r i: v a r . P u r P“ r e a
精细胞作为植物的雄配子在生殖过程中占有重要地位 。 以往被子植物待细胞的研究
仅局限于体 内原位观察 。 从花粉粒或花粉管中分离精细胞的成功 , 在受精作用基础理论
研究和生物工程应用两方面均具有重要的意义 4[, , ,ls] 。 最近几年 , 精细胞的分离有了长足
进展 。 迄今已从 9 科 16 种植物的花粉粒或花粉管中分离出精细胞 『` , 10, 1, 19 一 24] 。 然而 ,在这
些分离成功的物种中 , 很多缺乏关于分离率的报道 , 并且 , 仅在部分研究中采用 F D A 染
色技术证实分离的精细胞具生活力 , 而在其它研究中仅用了伊凡斯蓝负反应或未作生活
力测定 41[ 。 至于分离的精细胞的离体保存 , 虽有初步尝试比2, 24) , 但至今尚未见到有关保存
条件的准确研究资料 。 因此 , 精细胞分离率的提高和生活力保存仍是急待进一步研究的
重要课题 。
本工作在 以前研究『, 4」 的基础上进一步建立了紫 菜 苔 (刀 r a s s i c a c a 。 户e s t r i , , a r . 户u -
rP 。 。 。 ) 精细胞大量分离及其生活力保存的适宜技术 , 并研究了影响分离率和生活力 的
若干因素。
材 料 与 方 法
(一 ) 试验材料
紫菜苔 9 月播种于武汉大学生物系试验地 , 1 月开花 。
(二 ) 分离和保存方法
将新鲜花粉置于一定浓度 (见后文 )的蔗糖液中制成悬浮液 , 在 28 ℃ 、 黑暗条件下温
育 2 0一 40 分钟 。 然后按下述两种方法释放精细胞 : ( l) 渗透压冲击法 。 参考原有的 “一
步法 ” 〔` 川和 “ 二步法 ” ` 建立了下列改良方法 : 先将经过适时温育的花粉悬浮液离心去上
清液 ,再倾人含保护剂的低渗培养基进行冲击 ,使渗透压骤降 , 导致花粉破裂释放精细胞 。
然后通过离心沉淀 , 将精细胞转移到含保护剂的等渗培养基中 。 所用的保护剂包括葡聚
糖 硫 酸钾 ( p o t a s s i u m d e x t r a n s u l p h a t e , 简 称 p D s ) 、 牛血 清 白 蛋 白 ( b o v i n e s e r u m
a l b u m i n
, 简称 B S A ) 和聚乙娜毗咯烷酮 ( p o l y v i n y l py r r o l i d o n e , 简称 p V p ) 。 ( 2 ) 研磨
9期 莫永胜等 :紫菜苔精细胞的大量分离和生活力保存
法 。 参考以前的方法以加以改进 , 即将温育后的花粉离心沉淀 ,悬浮于含保护剂的培养基
中 , 用玻璃匀浆器轻轻研磨 。 将得到的含大量精细胞的混合物直接置于冰箱 ( 4℃ ) 保存
(便于统计 ) ,或先依次通过 40 。 目不锈钢网和 2 0严 m 、 1 0 那 m 孔径尼龙筛 网过滤 , 以除去
未破裂的花粉和花粉壁残渣 ,收集滤液 ,再置于冰箱 ( 4℃ )保存。 定时敢样检侧生活力 , 统
计保存率变化 。
(三 ) 显微观察
在上述分离和保存试验的每个环节中均按前法 t24, 采用荧光素二醋 酸酣 ( F D A , 20
拼 g /m l ) 测定生活力 ; 采用 D N A 荧光染料 H o e e h s t 3 3 2 5 8 ( 2 0那 g / nr l ) 结合冬青油透
明技术阴 观察花粉粒中的细胞核 。 用 A O lF u or e s t a r 1 10 型落射荧光显微镜的 2 0夕3 滤
光组合 (激发滤光片 4 36 , 分色镜 4 5 0 , 阻挡滤光片 4 7 5 ) 观察与摄影 。
(四 ) 统计方法
在荧光显微镜下随机观察 5 个视野中的花粉与精细胞 ,按下列公式计算各 项 指标 ;
花 ” 破 “ 率一馨;黯 “ ` 。。多
生活精细胞分离率 一圈舌精细胞数总花粉数 X Z
存活精细胞数
x 1 0 0并
破裂花粉数 X Z (保存 t 时间后 )精细胞相对存活率一 生活精细胞数
x 1 0 0外
破裂花粉数 x Z
以刚分离时的精细胞存活率为 1 0 外。
(刚分离时 )
结 果
(一 ) 分离方法的比较
1
. 渗透压冲击法 “ 一步法 ” 〔` 7’ 难以导致花粉破裂释放精细胞 。 应用 “ 二步法 ” ` , 试
验了 10 一 40 多 范围内的起始蔗糖浓度 ,表明 25 多 浓度下的分离效果略好 , 花粉破裂率为
2 7外 , 生活精细胞分离率最高为 1 多 , 分离的精细胞在低渗的蔗糖溶液中存活不到 l 小
时 ; 即使分离后马上转移到下述含保护剂的等渗培养基中低温保存 , 1 0小时后存活 34 多 ,
28 小时后仅为 8多 , 36 小时后全部死亡 。 采用本文的改良方法 , 成熟花粉的破裂率提高
到 39 关 , 生活精细胞分离率提高到 34 多 。 精细胞相对存活率在保存 10 小时后为 82 多 ,
28 小时为 64 多 , 保存时间最长可达 48 小时 。 以上结果表明 ,改良方法中生活精细胞的分
离率和保存率均有明显提高 。
2
. 研磨法 首先比较了三种方法 : 一是花粉不经水合直接研磨 ; 二是花粉在培养基
中水合后研磨 ; 三是花粉先在等渗蔗糖液中水合后再在培养基中研磨。 结果表明生活精
细胞的分离和保存效果均以第三种方法最佳 。 在此基础上 , 应用第三种方 法再 比 较 了
R o b e r t s ( 1 9 83 )
￡` , , 、 B K ’ ` , 和 K 3“ 3 , 等三种基本培养基对精细胞分离和保存 的 影 响。 结
果表明它们之间差异不显著 , 而以不含硼酸的 R ob e r t s 培养基效果略好 , 说明盐离子成
分的差异对精细胞生活力影响不大 。 因此 , 以后的实验均采用 去 硼 酸 的 R ob er t : 培养
植 物 学 报 3 3卷
基 。
(二 )影响精细胞分离和保存的因素
1
.花粉生理状况 花粉生理状况对分离和保存影响很大 。 以盛花期的晴天早晨取即
将开放的新鲜花朵试验效果为好 , 阴雨天取样不利于分离 ;在开花尾期 , 花粉粒生活力降
低 ,精细胞得率亦低 ,其生活力亦易丧失 。 花粉发育时期亦是关键因素 , 充分成熟的花粉
效果好 ,而较幼嫩的花粉较差 。 例如 ,开花前一天的花粉 , 应用前述改良的渗透压冲击法 ,
在 2 , 多 蔗糖液 中需水合 l 小时 , 花粉破裂率最高为 21 多 , 生活精细胞 分离率仅为 13 务 ,
离体保存 10 小时后仅存活 1 多 , 1 , 小时后全部死亡 。 应用改良的研磨法 , 花粉破裂率
最高为 53 外 , 生活精细胞分离率亦仅为 26 多 , 生活力最长只能维持一天 。
2
. 水合液中的蔗糖浓度 水合液中的起始蔗糖浓度对精细胞的分离也有影响 , 尤以
应 用渗透压冲击法时更为明显 。 从表 1 中可看出 ,起始蔗糖浓度过低 (如 10 务 ) , 虽然花粉
破裂率高 , 但生活精细胞分离率却很低。 这可能由于精细胞刚释放时处于过于低渗的溶
液中易于遭受损害之故。 起始蔗糖浓度过高 (如 40 外) , 花粉不易破裂 , 因而释放的精细
胞亦少 。 以 25 多 的起始蔗糖浓度水合效果最佳。 若冲击时蔗糖浓度的骤降幅度低于 一
半 , 则 30 外 的起始蔗糖浓度也有效 , 但过剧的降低浓度对精细胞生活力有不利影响 。 应
用改良研磨法时则以 30 % 蔗糖液水合较理想 。 两种方法的水合时间一般均为 30 分钟 。
T a b l e
表 1
E f f e c t
水合液中蔗箱浓度对精细胞分离效果的影响 (改良渗透压冲击法 ) *
o f s u e r o s e e o n c e n t r a t i o n i n h丫d r a t i o n s o l u t i o n o n i s o l a t i o n Of o P e r退
c e l l` ( m o d i f i e d o s o o t i e s五 o e k m e t h o d ) *
蔗糖浓度
C
o n e e n t r a t i o n o f
s u c r o s e ( % )
观察花粉粒数
N o
.
o f P o l l e n
9 r a i n s o b s e r v e d
一一丽一- { , , `
2 0
1
斗3 2
2 5
}
4 8 8
3 0 】 今` 8斗0 1 4 7 2
破裂花粉粒数
N o
.
o f b u r s t e d
p o l l e n g r a i n s
2 2 8
1 6 2
1 9 2
8 6
4 6
花粉粒破裂率
P o l le n g r a i n
b u r s t r a t e (% )
今3
3 8
3 9
2 1
1 0
生活精细胞数
N o
.
o f v i a b l。
. P e r m s
7 2
2 4 0
3 3 2
15 2
8 4
. 水合 30 分钟后冲击 。 渗透压冲击液除含相应降低一半浓度的蔗糖外 , 尚有 0 . 19 / L K N O , 、 0 . 3 2 9了L C a cl : ·
ZH
:
0
、
0
.
3% PV P
、
0
.
6% B S A 和 0 。 3% P D S .
. T h e p o l l e n w e r e h y d r a t e d f o r 3 0 m i n i n s u e r o s e s o l u t i o o b e f o r e o s m o t i e s h o e k
,
T h e
s h o c k s o l u t i o n c o n t a j n e d h a l f
g / L K N 0
3 ,
0
.
3 2 9 / L C
a C I
: ·
s t r e n g t h s u e r o s e o f th e h y d r a t i o n s o l u t i o n
, s u p P l e m e n t e d
0 s m o t i e
w i t五 0 . 1
Z H
:
0
,
0
.
3% P V P
. 0
。
6% B S A
a n d 0
.
3% P D S
.
3 保护剂 在两种方法中均试验了三种保护剂对分离率和生活力的影响 , 结果大致
相同 。 例如 ,应用改良的渗透压冲击法 (表 2 ) , 添加保护剂对生活精细胞的分离和保存均
有一定的促进作用 。 三种保护剂单独使用时 ,其效果有一定差异 ,依次为 P v P > sB A >
P D S
, 而 以三者混合使用效果最好 。 但如在分离介质中使用三种保护剂而在保存液中去
掉 P V P , 其保存效果比保存液 中含 P V P 者更好 。 添加保护剂的促进作用在改 良研 磨
法中表现更为明显 。 总结表 2 和表 3 结果 , 可 以认为分离紫菜苔生活精细胞 以在研磨介
质中添加 P D S 、 sB A 和 P v P 三种保护剂而保存液中去掉 P v P 效果最好。
4
. 渗透压调节剂 不同渗透压调节剂对生活精细胞分离率和生活力保存的效果有明
, 期 莫永胜等 : 紫菜苔精细胞的大量分离和生活力保存 ` 5 3
表 2 保护剂对精细胞分离率和保存率的影响 (改良渗透压冲击法 *)
T a b l e 2 E f f
e e t s o f p r o 丈 e e t a n t s
( m o d i f i e d
O n 1s o l a t i o n
a n 〔 1 p r e s e r v a t i o n o f s p e r m e e l l s
0 5 111 0 t 1 C
s h o e k m e t h o d )
*
保护剂 观察花粉粒数
N o
.
o f P o l l e n
9 r a i n s o b s e r
-
v e d
生活精细胞数
N o
.
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-
b l e s P e r m s
生活精细胞
分离率
V i a b l
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-
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(% )
精细胞 相对存活率
V i a b l e s P e r m r e l a t i v e s u r v i
v a l (% )
P r o t e e t a n t
保存时 间 (小时 )
5 t o r a g e d u r a t i o n ( h )
46…l,es.es0 10 2 2 2 8 3 6 ,今nùO产O
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对照 1 》
C o n r r o l
0
.
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0
.
6 % B S A
4 4 6
4 5 2
4 7 4
1 6 1
1 8 1
2 4 6
0 0
0 0
0 0
0
.
3% P V P
0
.
3% P D S +
0
.
6 % B S A +
0
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4 6 3 2 6 9
1 0 0
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4 2 9 2 7 5 3 2
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( ;{
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_
4 2
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(斗6夕
( ; }) (
2
{ )
* 25 % 蔗糖液中水合 30 分钟然后冲击 。
l ) 对照组 含 o · 1 9 / L K N o 3 、 0 . 3 6 9 / L C a c l Z · 2 H 2 0 和 1 2 . 5% 蔗糖 (冲击液 )或 3 0% (保存液 ) 。 括号中数
据为保存液中不含 P v P 的结果 。
. T 五e p o l l e n w e r e h y d r o t e d f o r 3 0 m in i n z , % s u c r o s e s o l u t i o n b e f o r e o s m o t i e s h o c k .
1) T h
e c o n , r o l 。 o n t a i n e d 0 . 1 9 / L K N O
, , 0
.
3 6 9 / L C
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:
0 a n d 12
.
5% s u c r o s e ( f o r o s m o t i -
t h o e k ) o r 3 0% s u c r o s e ( f o r p r e s e r v a t i o n )
.
T h e d a t a i n b r a e k e t s w e r e o b t a i n e d w h e n P V P w . c
d e l e t e d f r o m t h e p r e s e r v a t i o n m e d i u m
.
表 3 保护剂对精细胞分离率和保存率的影响 (改良研磨法 .)
T a b l e 3 E f f e c t s o f p r o t e e r a n t s o n i s o l a t i o n
a n d p r e s e r v a 之i o n o f s p e r m e e l l`
( m o d i f i e d g r i n d i n g m e t h o d ) *
保护剂 观察花粉粒数 }生活精细胞数
精细胞相对存 活率
V i a b l e s P e r m r e l a t i v e s u r y : v a l ( % )
N o
.
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N o
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·
P r o t e c t a o t
a b l e s P e r m s
生活精细胞分离率
V i a b l e s P e
-
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( % )
保存天数
s t o r a g e d u r a t i o n ( d a y s )
对照 ’ )
C o n t r o l
0
.
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0
.
6% B S A
0
.
3% P V P
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3% P D S +
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.
3% P V P
4 19
4 3 3
4 7 1
4 4 9
2 2 6
2 9 4
3 6 7
5 2 1
1 0 0
10 0
10 0
1 0 0
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门了,人污声二
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自了门Jù6Q尸月j夕O自11了月才的八月才4Qù,`2丹 曰Z`J月叶JOn
* 3。% 蔗糖液中水合 30 分钟后研磨 。
l ) 对照组含 0 . 19 / L K N O , 、 0 . 3 6 5 / L C a C I: · Z H , o 和 3 0% 蔗搪 。 括号中数据为保存液中不含 p v P 时
的结果 。
* T h e P o l l e n w e r e h y d r a t e d f o r 3 0 m i n i n 30% s u c r o s e s o l u t i o n b e f o r e g r i n d i n g i n t h e m e d i u m
.
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b r a e k e t ` w e r e o b t a i n e d w h e n PV P w a s d e l e t e d f r o m t h e P r e s e r v a t i o n I n e d i u m .
显差异 。在渗透压冲击法和研磨法中结果相近 ,现仅以改良研磨法为例 (表 4) 。在 0 . 6 o m 。 l / L
6 54植 物 学 报 3 3卷
左右的浓度下 , 试验了蔗糖 、 山梨醇 、甘露醇三种成分的 5 种组合 。 结果表明 , 生活精细
胞的分离率高低顺序依次为 21 务蔗糖 > , %蔗糖 + 8多山梨醇 > 1 务山梨醇 > , 多蔗糖 +
8多甘露醇 > H 外 甘露醇 , 生活力保存时间长短顺序为 1 多 山梨醇 > 21 多 蔗糖 > 5外
蔗糖 + 8 % 山梨醇 > 5外 蔗糖 + 8肠 甘露醇 > n 多 甘露醇 。 在 0 . 8 m ol / L 左右的浓度
下 ,试验了上述三种成分的三种组合。 结果表明 , 30 多 蔗糖和 20 多蔗糖 十 5多 山梨醇组
合对生活精细胞的分离和保存效果基本相近 , 以后者略好 , 它们均明显高于 20 肠 蔗糖 +
,呢 甘露醇组合 。 综合上述两种渗透压条件下的对比试验结果 , 说明蔗糖和山梨醇作为
渗透压调节剂既有利于生活精细胞的分离也有利于生活力的保存 , 并以 20 多 蔗糖 + 5多
山梨醇或 30 多 蔗糖两种条件最佳 。 生活精细胞的分离率最高达 86 多 , 生活力保存最长
可达一周 。 甘露醇作为渗透压调节剂不利于紫菜苔生活精细胞 的分离和保存。
表 4 渗透压调节剂对精细胞分离率和生活力保存的影响 (改良研磨法 ) *
T a b l e 4 E f f e e t s o f o s m o t i e a o n i s o l a t i o n a n d P r e s e r v a t i o n o至 s p e r m e e l l s
(m
o d i f i e d g r i n d i n g m e t h o d )
*
观察花粉粒数 !生活精细胞数 精细胞相对存活率R e l a t i v e s u r v i v a l r a t e o f
渗透压调节剂 v i a b l e s p e r m s ( % )
N o
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S t o r a g e d u r a t i o n ( d a y 。 )
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1 1%
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s o r b i t o l
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45 6 5 2 0 5 7 10 0 8 9 7 0 6 3 2 2 0 0
4 0 7 3 4 2
’
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4 , 4 , , q , 7 1 n n 4 1 1 , 4 n n f、10 0 4 1 1 7 4 0 0
5%
5%
5%
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3 0%
3 0%
m a n i t o l
蔗糖十 8% 山梨醇
s u c r o s e + 8%
s o r b i t o l
蔗糖 + 8% 甘露醇
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S U C f O S e
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4 7 8 8 2 2 8 6 8 8 8 4 7 5 6 3 3 9 2 7 2
八曰n甘八七nU,工. .二`几
20 % 蔗糖十 5% 山梨醇
2 0%
s u e r o s e + 5%
s o r b i t o l
20 % 蔗糖十 5% 甘露醇
2 0%
s u e r o s e 十 5% m a n i t o l
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4 3 9 5 5 3 6 3 8 4 7 2 5 1 l 3 0 0
nóU鸽Un,几
. .且
* 3 0% 蔗糖中水合 3 0 分钟后研磨 。 培养 基基本 成分 含 0 . 1 9 / L K N O 。 、 0 . 3 6 9 / L C a C I: · 2 H 2 0 、 0 . 6%
B s A
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0
.
3% P D s 和 0 . 3% P V P , 但保存培养基中不含 P v p 。
* T h e p o l l e n w e r e h了 d r a t e d f o r 3 0 m i n i n 3 0% s u c r o s e s o l u t i o n b e f o r e g r i n d i n g i n t h e m e d i u m
.
飞’ h e b a s i c m e d i u m e o n t a i o e d 0 . 1 9 / L K N 0 3 , 0 . 3 6 9 / L C a C I : · ZH z o , 0 . 6% B S A , 0 . 3% P D S a翩
0
.
3% P V P
,
b u t P V P w a s d e l e : e d f r o m 。 {: e P r e s e r v a t i o n m e d i u m .
通过上述比较研究 , 总结出紫菜苔生活精细胞大量分离和生活力保存的技术流程如
下 :
用含
渗透压冲击法 : 成熟花粉在 25 务 蔗糖液中于 28 ℃ 下水合 30 分钟一离心沉淀一12 · 5外蔗糖 、 0 . 1 9 /石 K N O , 、 0 . 3 6 9 / L C a C I: · ZH ZO 、 0 . 3务 P D s 0 . 6关 B s A 和
莫永胜等: 紫菜苔精细胞的大量分离和生活力保存
0
.
3多 P VP 的低渗液冲击一将释放的精细胞及时转 移 到 含2 0务 蔗 糖 、 , 并 山 梨 醇 、0· 1 9 / L K N O 3 、 0 . 3 6 9 / L C a C I, · ZH Zo 、 0 . 3多 p D S 和 0 . 6并 B S A 的培养基中 , 置于
冰箱 ( 4℃ )冷藏 。
研磨法 : 成熟花粉在 30 多 蔗糖液中于 28 ℃ 下水合 30 分钟一离心沉淀一在含2 0沁蔗 糖 、 5 多 山 梨 醇 、 o一 g / L K N O 3、 0 . 3 6 9 / L e o C x: · ZH ZO 、 0 . 3多 p D S 、 0 石 帕
sB A 和 。 . 3务 P v P 的介质中研磨一将释放的精细胞转移到不含 P v P 的上述培养基中 ,置于冰箱 ( 4℃ )冷藏 。
(三 ) 细胞学观察
成熟花粉经 H o e hc st 3 3 2 5 8 染色和冬青油透明后 ,可 以显示其中一对精核 (图版 I ,
1 )
。 采用 F D A 荧光反应作为生活细胞的标志 , 可 以清楚地观察到生活精细胞从花粉粒
中释放出来的过程及其随后的形态学变化 。 刚 由一粒花粉中分离出来的两个姊妹精细胞
是成对相连的 。 精细胞形状略长 ,其 中一个精细胞的一端具长尾状延伸物 (图版 I , 2 ) 。 经
F D A 处理后 , 分离的精细胞呈均匀的绿色荧光 ,而且直达尾部 ,说明尾部的细胞质亦呈生
活状态 (图版 l , 3 ) 。 以后 , 它们逐渐变为椭圆球形 ,仍维持成对状态 (图版 I , 4 ) 。 然后联系
中断而单个地分散于介质中 (图版 I , 5 ) , 最终变为彼此分开的圆球形 (图版 I , 6 ) 。 图版 I ,
7 示经全部分离程序后的生活精细胞群体 。
讨 论
精细胞分离与保存技术的研究是当今植物生殖生物学和生殖细胞工程的前沿课题之
一 4[, ,1 。 迄今已建立的由三细胞型花粉中分离精细胞的方法包括 渗 透 压冲 击 法 和 研 磨
法 L呼 ,l8] 。 从细胞工程的角度看 ,分离精细胞的关键在于创造一种最佳条件以达到提高分离
率和保存生活力的 目的 。 已有的渗透压冲击法 (无论是 “ 一步法 ” 〔` ”还是 “ 二步法 ” 「2竹中都
使刚释放出来的精细胞处于缺乏保护剂的仅含蔗塘的低渗溶液中 , 看来这不是精细胞在
离体条件下维持生活状态的最佳条件 。 基于上述考虑 , 我们改良了现有的二步渗透压冲
击法 , 即将经过蔗糖液水合的花粉转人含多种保护剂的低渗培养基中冲击 ,再将释放出来
的精细胞及时转移到含保护剂的等渗培养基中保存 。 试验表明 , 分离条件不仅关系到精细
胞分离率的高低 , 而且也关系到以后的生活力保存 。 这一方法具有两个优点 : 一是使精
细胞刚一释放就立即处于含多种保护剂的培养基 中 , 从而减少损伤 ;二是低渗培养基的直
接加人可能比以前加等量蒸馏水的方法能够在花粉群体内造成更均匀的渗透压骤降 。 在
此基础上 , 我们对原先的研磨法 ` 也进行 了适当的改进 , 建立了先在等渗蔗糖液 中水合再
在含保护剂的培养基中研磨的改良方法 。
保护剂的加人对生活精细胞的分离和保存有显著的促进作用 。 s ou ht w or ht 和 K on x
( 19 8 8 )
`18J 曾经指出保护剂在精细胞分离中可能具有重要 的作用 。 他们通过在研磨介质
中加人 P v P 和 B S A 等保护剂成功地分离出非洲菊的精细胞 【, 9] 。 杨弘远与周嫦 ( 19 8 9)
在油菜与玉米精细胞分离和保存中应用 P D s 作为保护剂 『` 。 P D s 在原生质体分离中是
常用的保护剂 , 其作用被认为是降低酶液 中的核糖核酸酶活性 , 增强膜的稳定性 〔1] 。 在精
细胞分离方面 , P D S 可能会降低营养细胞破裂后释放的核糖核酸酶等活性而 对 精 细 胞
起一定的保护作用 。 B S A 和 P v P 在细胞器分离等生理生化研究中早已得到广泛应用 ,
` 6 5植 物 学 报3 3 卷
一般认为 P VP 有助于对抗破碎组织释放出来的多酚类物质的有害作用『3 1 。 o su t hw ro ht
和 K onx (19 8 ) st川 认为 P vP 和 BAs 均作为脂类结合物而对精细胞起保护作用 。 本
试验由精细胞保存液中以不加 P P v为宜 , 其原因之一可能是由于 P v P 是一种芳香环
化合物 , 它的长期作用可能对精细胞具有一定的毒害。
关于精细胞具尾状延伸物的现象 , 在体内已有较多报道口 。 最近在非洲菊 〔` 9]等植物的
精细胞分离过程中也观察到 。 但用 F D A 检测证明精细胞具生活状态 的长尾 , 则是本文
首次报道 。 在紫菜苔中 , 来 自同一粒花粉的一对姊妹精细胞中只是一个精细胞具尾 ,这同
M c
。
cn hi e 等 ( 19 8 , ) 12t , 对同种植物 (不 同变种 ) 成熟花粉粒中的一对精细胞的计算机辅
助三维重构研究结果是一致的 。 若应用前文「24, 方法 , 在 紫菜苔精细胞分离 中难于观察到
具尾状延伸物现象 。 这也表明本文建立的分离条件更为合适 , 能使分离的精细胞在更长
时间内维持体内原状 。
关于分离的精细胞的生活力保存 , 现有文献中只有零星报道而缺乏 翔 实 的 实 验 资
料 7[, 8, “ 】 ’ 5 , ` , , 2 2 , 24] 。我们的研究结果在迄今用冰箱 ( 4℃ )保存精细胞的研究中 , 保存效果较佳 。
考虑到本实验中没有采用无菌操作 , 精细胞在冰箱中保存一周可能会有菌类滋生 , 推测如
果在无菌条件下保存 ,可能还会延缓生活力的下降速度 。 此外 ,应用超低温方法保存精细
胞 , 也值得进一步试验 。
参 考 文 献
[ 斗1
〔 5 ]
[ 6 ]
李文安 , 1 9 8:7 植物原生质体培养 。 植物生理学专题讲座 ( 《 植物生理学通讯 》编辑部主编 ) 。 科学 出版社 , 北
京 , 1 3 2一 14 5 页 。
杨弘远 , 19 8 8 : 用荧光染色与冬青油透明技术显示花粉细胞核。 植物学报 , 30 : 24 2一 2 4 7。
林忠平 , 1 9 8 :7 生物大分子和亚细胞结构的分离 。 植物细胞学研究方法 (孙敬三 、 钱迎倩主编 ) 。 科学 出版社 ,
北京 , 3 6 6一 4 0咯页 。
周嫦 、 杨弘远 , 1 9 8:9 花粉原生质体、 精子与生殖细胞的实验操作 。 植物学报 , 3卜 7 26 一 7 3 4 。
胡适宜 , 1 , 9:0 雄性生殖单位和精子异型性研究的现状 。 植物学报 , 32 : 2 30 一2今O。
B r e w b a k e r
,
J
.
L
.
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.
Y
.
K w a e k
, 1 96 3
二
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In : “ p l a n r s P e r m C e l l s a : T o o l s f o r B i o t e e h n o l o g y , , (H
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i e e l l u l a r P o l l e n s P e e i e s : B r a
了 s i c a o l e r a一 r a , Z ca 协 a 夕5 a n d 丁 r i z i c “ 仍 a 亡了r i粉 u 仍 . P l a 月 t P五 , ` iof . , 8 3 :
4 6 4一 4 6 6 .
M e C o n c h i e
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r a l 了ic 口 c a邢 P口价介. P r 口才o P I口了叨口 , 12 7 : 5 7一 63 .
N a盯 , J . x . a n a P . M a l i g a , 1 9 7 6 : ca l l u s in d : i e t i o n a n d p z a n t r e g e n e r a t i o n f r o m m e ; o p h y l l p r o t o p l a 吕: s d
N i c o , i a o a : y l , 。了 , r该5 . 2 . P f l a 。 : 。 。 P几夕: 10 1. , 7 8
.
4 5 3一 4 5 5 .
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: I匀 o l a r ion o f s Pe r m e e l l s f r o m t he t r i n u e l
e a t e p o l len o f 吕u , r 玩 e t
刀。 r。 。 u l多 a r犷, L . x n : “ P l a n t s p e r m e o l l s 、 s T加 l s f汉 B i o t e e h n ol 呛 y , , (H . J . W i lm s a n d C J . K e i ii橄
e d s净, P u d o c , W a g e n i n g e n , P P . 1 12一 12 2 .
, .1J.f,J,翻之」r.`rL
月叼明川尸.`ó阻r沮.t .IL
9期 莫永胜等 :紫菜苔精细胞的大量分离和生活力保存 ` , ,
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s ic a o l e r a c 亡a : a n e w P o l l e n g e r m i n a t i o n m e d i u m a n d i t s u s e i n e l u c id a r i n g t h e m e e h a n i s m o f s e l f i n -
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3 17一 3 19 .
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e n t , 19 6 9 : I s o l a r i o n o f s p e r m e e l l s f r om m
a t u r e p o l l e n 罗 a i n , o f
S P矛刀 a c i a o Ze r a c e a L 二 S e二 . p l e 丹宕 R ` P r o d . , 2 : 9 7一 10 2 .
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K r e n s a n d 卜1 . A . C . M . Z a a l , 19 9 0 : S P e r m e e l l i s o l a t i o n f r o m p o l l e n
o f p e
r e n n i a l r界 g r a s s ( oL l i u , P o r e。 , 。 L · ) . In : “ A b s t r a e t s v l l t h I n t e r n a t i o n a l C o n g r e s s o n p l a n t T i` s u e
a n d C e l l C u l t u r e
,
A m s t e r d a m
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Y a n g
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an d C Z五o u , 1 9 8 9 : I s ol a t沁 n o f 、 iab l e 却 e r m s f r o鱼 和11e n o f B r a s s f c a ” a P。 ` , Z。 。 , , :
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213
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图 版 说 明
除图 2 为明视野摄影外 , 其余均为荧光显微摄影 。 其中 , 图 l 为 H oe 。协 t 3 3 2 , 8 染色和冬青油透明 , 其余为
F D A 染 色 。
1一粒花粉中的一对精核 (营养核不在此焦面上 ) 。 只 8 0 2 、 3 . 刚分离的一对精细胞 ,其中一个精细胞具长尾状延伸物 ( 2 和 3 分别为同一材料的明视野和荧光摄影 ) 。 火 2 2 ,。 4一对椭圆球形精细胞 。 又 2 2 5。 , .
另一对椭圆球形精细胞 。 K 2 2 5 0 6一对圆球形精细胞 。 火 2 2 , 。 7 . 生活精细胞群体 。 火 2 50
E x Pl a n a t i o n o f P l a t e
A l l p h o t o s w e r e t a k e n b y f l u o r e s e e n e e F i g
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2 w h呈e h w a s a b r i g h t一 f i e ld
公 P C r m
F D A
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t o s h o w f l u
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