全 文 ：的最大特色和优势 [ 8] 。姜黄素正是以保护正常细胞免受各种不
良因素的损伤为基础 ,发挥其抗炎 、抗肿瘤 、抗氧化 、抗病毒等药
理作用的 [ 9] , 姜黄素很有可能成为肝癌治疗的一个很有价值的
候选药物。
我们的研究结果显示 ,常氧条件下姜黄素呈浓度依赖性方式
上调肝癌细胞 Hep1中 VEGF的 mRNA和蛋白表达。结合以往
学者在缺氧条件下对于姜黄素对肝癌细胞 VEGF表达影响的研
究结果来看 , 肿瘤细胞所处的微环境改变 , 药物对其作用也会受
到影响 , 由此可见肝癌治疗研究的复杂性。从多角度进行研究 ,
将为姜黄素用于肝癌的临床治疗提供全面的参考依据 ,这样才能
达到辨证施治的效果 。
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收稿日期:2010-08-28;　修订日期:2011-01-18
基金项目:教育部科学技术研究重点项目(No.210042);
内蒙古自治区高等学校科学研究项目(No.NJ10043)
作者简介:敖恩宝力格(1974-), 女(蒙古族),内蒙古赤峰人 ,现任内蒙
古师范大学生命科学与技术学院副教授,博士学位 ,主要从事生物资源开
发研究工作.
瓣蕊唐松草种子总生物碱的体外抗肿瘤作用
敖恩宝力格 ,王金妞 ,邰丽华
(内蒙古师范大学 生命科学与技术学院 ,内蒙古 呼和浩特　010022)
摘要:目的 研究瓣蕊唐松草种子总生物碱对体外培养的肿瘤细胞株生长与集落形成的抑制影响。方法 用 90%乙醇提
取 , D106大孔吸附树脂分离 , 乙醇洗脱得到瓣蕊唐松草种子总生物碱。采用 MTT法和集落形成法检测总生物碱对人肺
腺癌细胞 NCI-446、人大肠癌细胞 SWWC116和人宫颈癌细胞 Hela的生长与集落形成的抑制情况。结果 瓣蕊唐松草种
子总生物碱对 NCI-446和 SWWC116的生长与集落形成有明显的抑制作用 ,生长抑制的 IC
50
值分别为 0.6 mg/L和 1.4
mg/L, 集落形成抑制的 IC50值分别为 0.2 mg/L和 1.0 mg/L。而对人宫颈癌细胞 Hela的生长与集落形成的抑制不明显。
结论 瓣蕊唐松草种子总生物碱在体外具有明显的抗肿瘤作用。
关键词:瓣蕊唐松草种子;　总生物碱;　MTT法;　集落形成法
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.08.062
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)08-1941-02
　　瓣蕊唐松草 Thalictrumpetaloideum为毛茛科唐松草属植物 ,
在内蒙古地区 , 主要分布于兴安盟 、呼伦贝尔市 、通辽市 、赤峰市 、
锡林郭勒盟 、乌兰察布盟 、大青山 、蛮汗山 、乌拉山;分布广 , 产量
极多 , 是蒙医药 、中医药常用的药材。但是 ,对于瓣蕊唐松草 ,两
种医药学在药材部分的选择和临床应用上各不相同。中医药主
要是用根及根茎 , 蒙医药则用种子和花的部分 [ 1] 。蒙药主治肺
热咳嗽 , 肺脓肿 ,失眠 、消化不良 、恶心等;中药主治肠炎 、赤白痢
疾 、黄疸型肝炎 、小儿热症等 [ 2]。 起药效作用的主要成分是生物
碱 [ 3, 4] , 目前已经发现和鉴定的唐松草属植物源生物碱有十几
种。最近的研究还发现同属植物源生物碱具有抗癌 、抗凝等功
效 [ 3, 5] 。为了探讨瓣蕊唐松草种子生物碱是否也具有抗癌作用 ,
本实验对瓣蕊唐松草种子生物碱进行体外抗肿瘤研究。现将研
究结果报道如下。
1　材料与仪器
1.1　材料 实验用瓣蕊唐松草采自内蒙古赤峰市克什克腾旗 ,采
摘后自然凉干 ,取种子部分粉碎后保存于阴凉干燥处。人肺腺癌
细胞 NCI-446、人大肠癌细胞 SWWC116和人宫颈癌细胞 Hela
均由吉林省肿瘤医院提供。
1.2　试剂 MTT(四甲基噻唑蓝)试剂由德国 Sigma公司提供;
FBS(胚胎牛血清)由杭州四季青生物工程材料有限公司提供;
RPMI-1640培养基由美国 GIBCO公司提供;胰蛋白酶由天津市
景洋生物制品有限责任公司提供;DMSO(二甲基亚砜)、乙醇 、氯
仿等均为国产分析纯试剂。 D106型大孔吸附性树脂为工业品。
1.3　仪器 MP2002型电子分析天平 , FZ102型微型植物粉碎机 ,
KQ3200V型超声波清洗器 , RE-52型旋转蒸发仪 , SHZ-D型循
环水多用真空泵 , SHELLAB型 CO2培养箱 , BIOCELL酶标仪 ,
752型紫外分光光度计 , OLYMPUS倒置显微镜等。
2　方法
2.1　生物碱的提取分离 [ 6] 将瓣蕊唐松草种子粉碎 , 过 80目筛。
称取 10g于 1 000ml圆底烧瓶中 ,加 90%乙醇 200 ml, 在 90℃回
流提取 2 h,抽滤 , 收集滤液。残渣加入 150 ml90%乙醇重复提
取 1次 , 过滤 ,弃去残渣 , 合并 2次滤液。 滤液用 D106大孔吸附
树脂吸附。 60%乙醇洗脱(流速 2 ～ 3ml/s)。洗脱液用旋转蒸发
器回收乙醇 , 并浓缩至 50 ml左右 ,加 0.5% HCl调 pH至 2 ～ 3,
抽滤。滤液用 1倍体积氯仿萃取 2次 , 弃去氯仿相 , 合并水相。
加 0.5% NaOH调 pH至 7左右 , 抽滤 , 除去鞣质 , 继续加 0.5%
NaOH调 pH至 9 ～ 11, 用 100 ml氯仿萃取 3次 ,弃去水层 , 合并
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.8 时珍国医国药 2011年第 22卷第 8期
氯仿相。回收氯仿 , 浓缩 ,真空干燥 , 即得成品。
2.2　肿瘤细胞培养 [ 7] 取冻存细胞迅速于 37℃水浴解冻 , 加入
培养液后 , 1 000r/min离心 5 min,接种于细胞培养瓶 , 5% CO2 ,
37℃过夜培养 , 换液 ,待细胞长满瓶底 70%左右时 , 经 0.25%胰
蛋白酶消化传代培养 。
2.3　MTT法 [ 8, 9] 对数生长期的肿瘤细胞 , 用含 10%胚胎牛血清
的 RPMI-1640培养液调配成浓度至 5×104个 /ml,接种于 96孔
板 , 每孔 100 μl。 在 37℃、 5% CO2条件下培养 24 h后 , 吸取上
清 , 分别加入生物碱浓度为 0.01, 0.1, 1, 10, 100 g/L的培养基
200μl,每个浓度平行设置 5个复孔 ,并设置 5个空白对照孔 ,空
白对照孔加入不含生物碱的培养基 200 μl。 在 37℃、5% CO2条
件下培养 48 h后 , 吸出培养基 ,每孔加入 180 μl无血清培养基 、
20 μlMTT(5 mg/ml)。 37℃培养 4h后 , 酶标仪 λ630 nm处检测
吸光度 A。按下列公式计算抑制率 ,重复 3次。
抑制率(%)=(A对照组 -A药物组)/A对照组 ×100%
2.4　集落形成法 取对数生长期的肿瘤细胞 , 用 0.5 ml, 0.25%
的胰蛋白酶消化 , 细胞计数后用含 10%胚胎牛血清的 RPMI-
1640培养液调配成浓度 200个 /ml,接种于 24孔板 , 每孔加入 1
ml, 其中包括 900 μl肿瘤细胞悬浮液和 100μl生物碱溶液 ,溶液
按浓度递增原则各设 5个不同的浓度 , 终浓度分别为 0.01, 0.1,
1, 10, 100g/l,每种药的每种浓度均设 5个平行孔 , 阴性对照组加
入 900 μl肿瘤细胞悬浮液和 100 μlRPMI-1640培养基 ,摇匀后
置 37℃、5% CO2培养 7 d。弃去上清液 ,用瑞氏染液染色 5 min,
然后用 Giemsas溶液与 Sorensen磷钼酸缓冲液以 1∶9混合 , 染
色 5 min。流水冲洗 、凉干 , 显微镜下计数含 50个细胞以上的集
落 , 重复 3次。按下式计算集落抑制率。
集落抑制率(%)=1-克隆数 /对照组克隆数 ×100%
3　结果
3.1　瓣蕊唐松草种子生物碱对不同肿瘤细胞生长的影响 MTT
法有灵敏度高 、稳定性好 、快速 、操作简便 、可评价率高 、测定结果
客观等优点 , 广泛用于化疗药物筛选和生物学及医学研究中 [ 9] 。
本研究利用该法观察了瓣蕊唐松草总种子生物碱对 3种不同肿
瘤细胞生长的影响。从图 1可看出 , 瓣蕊唐松草种子总生物碱对
NCI-446和 SWWC116细胞的生长具有显著的抑制作用 ,并具有
剂量依赖关系 , 其达到 50%抑制率所需浓度 IC50值分别为 0.6
mg/L和 1.4 mg/L。对 HeLa细胞生长的抑制作用虽然较低 , 但
具有明显的剂量依赖关系。
与空白对照组比较 , ＊＊P<0.01
图 1　瓣蕊唐松草种子总生物碱对不同肿瘤细胞生长的抑制曲线
3.2　瓣蕊唐松草种子生物碱对不同肿瘤细胞集落形成的影响
集落形成法能反映单个细胞的增殖能力 ,通过集落计数可对克隆
原细胞作定量分析 , 能较灵敏地测定药物的抗癌活性 ,目前被认
为是一种较理想的检测方法 [ 10] 。图 2为瓣蕊唐松草种子总生物
碱对NCI-446、SWWC1 16和Hela细胞株集落形成的影响 。从
图 2可看出 , 瓣蕊唐松草种子总生物碱对 3种肿瘤细胞的集落形
成均有抑制作用 , 且抑制率与浓度成正比。其对 NCI-446和
SWWC116细胞集落形成的抑制作用更为明显 , 达到 50%抑制率
所需浓度 IC50值分别为 0.2mg/L和 1.0 mg/L。在本实验条件下
无法得到对 HeLa细胞集落抑制的 IC50值。
4　讨论
该实验发现瓣蕊唐松草种子总生物碱对 NCI-446和 SW-
WC116细胞的生长及集落形成均有明显的抑制作用 , 而对 Hela
细胞的影响较低。
与空白对照组比较 , ＊＊P<0.01
图 2　瓣蕊唐松草种子总生物碱对不同肿瘤细胞株集落形成的抑制曲线
用体外筛选的方法选择有活性的抗肿瘤药物 ,是世界上广泛
应用的筛选方法。经体外筛选 ,如果中药提取物的 IC50 <10 mg/
L, 且呈现剂量依赖性 , 该药即被认为有杀伤作用 [ 11] 。瓣蕊唐松
草种子总生物碱对 NCI-446和 SWWC116的生长抑制的 IC50值
分别为 0.6 mg/L和 1.4 mg/L。抑制作用呈剂量依赖性。因此 ,
瓣蕊唐松草种子总生物碱对两种肿瘤细胞的生长抑制作用非常
显著 , 具有继续开发研究的价值。
据报道 ,唐松草属植物源的生物碱具有抗肿瘤 、抗凝等多种
功效 [ 3, 5] , 该研究证实瓣蕊唐松草种子中的生物碱具有显著的体
外抗肿瘤活性。
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