全 文 ：收稿日期:2009 02 10
作者简介:张改娜(1977-),女 ,河南许昌人 , 讲师 ,博士 , 主要从事细胞生物学教学与细胞工程研究。为通讯作者。
E-mail:zgnluck1@163.com
草木樨状黄芪 A4 转化系原生质体培养研究
张改娜1 , 2＊ , 贾敬芬2
(1.河南科技大学 农学院 ,河南 洛阳 471000;2.西北大学 生命科学学院 ,陕西 西安 710069)
摘要:建立了草木樨状黄芪 A 4 转化系原生质体再生植株的实验体系 。以草木樨状黄芪发根农杆
菌 A 4转化系再生植物幼叶为材料 ,通过酶解法 ,游离出大量有活力的原生质体 ,原生质体经培养
持续分裂形成了愈伤组织 ,并分化出再生苗。比较了不同酶解时间 、培养密度和培养基对原生质体
分裂和再生植株的影响。结果表明 ,原生质体植板密度为 3×105 个/mL ,采用液体浅层培养 ,在附
加了 2.0mg/L 2 , 4-D 、0.5mg/L 6-BA 、0.3mol/ L 甘露醇和 2%蔗糖的 DPD培养基中 ,可获得最高
分裂频率 ,达 32.4%。原生质体持续分裂形成愈伤组织可高频[(91.75±3.1)%] 分化出再生苗。
甘露碱纸电泳和 PCR分析表明 ,外源基因 T-DNA在原生质体来源的再生植株中仍然存在 。
关键词:草木樨状黄芪;原生质体培养;再生植株
中图分类号:S541+.9　　文献标识码:A　　文章编号:1004 3268(2009)08 0046 05
S tudies on M esophyll P rotoplas t Culture and Plant
Regeneration of Agrobacterium rhizogenes-t ransformed
Astragalus meli lotoides Pall.
ZHANG Gai-na1 , 2＊ , JIA Jing-fen2
(1.Colleg e of Ag riculture o f Henan Univer sity of Science and Techno log y , Luoyang 471000 , China;
2.School of Life Science , Northw est Univ ersity , Xi an 710069 , China)
Abstract:An ef ficient pro tocol for plant reg eneration f rom protoplasts of Agrobacterium rhizo-
genes-t ransformed Astragalus meli lotoides Pall.was establishied.The young leaves f rom A.
rhizogenes-t ransfo rmed A.meli lotoides Pal l.were used for protoplast isolation through enzyme
digestion.The effect o f different enzyme dige stion time and plating densi ties and media on pro to-
plast divisions and plant regeneration we re studied.The highest division f requency (32.4%)and
sustained cell divisions w ere obtained in Durand , Po trykus and Donn (DPD)medium supplemen-
ted wi th 2.0 mg/L 2 ,4-D ,0.5 mg/L 6-BA , 0.3 mol/ L manni tol , 2%sucrose at the plat ing densi-
ty of 3.0×105/mL.The frequency of shoo t dif ferentiation f rom pro to calli reached to(91.75±3.
1)%.Mannopine synthesis and po lymerase chain reaction analy sis-confi rmed that T-DNA sti ll
e xisted in the protoplast regenerated plants.
Key words:Astragalus mel i lotoides Pall.;Pro toplast culture;Plant regenerat ion
　　草木樨状黄芪(Astragalus mol ilotoides Pall.)
是豆科黄芪属的多年生牧草植物 ,具植株高大 、根深
耐旱的特性 ,是较好的水土保持 、土壤改良及绿肥植
物 ,同时还可作为动物饲料 ,并且有极强的组织培养
再生能力[ 1] 。但其不足之处在于叶量较少 ,产草量
不高。因此 ,改良其茎叶比例 ,提高草产量 ,可望培
育可以适应沙丘 、半干旱地区的优良牧草[ 2] 。
草木樨状黄芪在我国北方 ,尤其是西北干旱地
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2009年第 8期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2009.08.022
区普遍种植。关于其组织培养[ 3 ～ 5] 、单细胞培养[ 6]
已有成功的报道 。西北大学生物技术省级重点实验
室已经成功建立了草木樨状黄芪高频离体再生体
系[ 2]及其愈伤组织原生质体的培养 ,并得到再生植
株[ 6] ,为培育高品质 ,并且适应沙区 、半干旱地区的
优良牧草提供了可行途径 。同时该实验室也成功建
立了草木樨状黄芪发根农杆菌 A 4 转化再生体
系[ 1] 。在此基础上 ,利用该实验室转化得到的草木
樨状黄芪发根农杆菌 A 4 转化再生植株 ,通过游离
其叶肉原生质体成功地获得了转化系原生质体再生
植株 ,这为豆科牧草体细胞杂交奠定了实验基础。
1　材料和方法
1.1　植物材料
供试植物材料为 25℃,1 200lx 或 400lx 照射条
件下 ,Murashige 和 Skoog 培养基(MS 培养基)[ 7]
中培养的草木樨状黄芪发根农杆菌 A 4 转化系(简
称 AmA 4)再生植株。
1.2　原生质体的分离及纯化
取 1.1培养条件下 AmA 4 不同叶龄的叶片 1g ,
剪成 1 ～ 2 mm 宽的长条 ,置于质壁分离液(P1 溶
液)[ 8] 中分别进行 0min 、 15min 、30min 、 45min 、
60min 、75min质壁分离 ,然后转至盛有 10mL 酶液
的三角瓶中 ,黑暗条件下 ,在 25℃恒温摇床上以 60
r/min振荡 3h 、9h 、15h ,再以 100r/min振荡 1h ,以
游离原生质体 。酶液组成:2% Cellulase Onozuka
R-10(Yakult , Japen), 0.5% pecto ly ase (R-23),
0.4 mo l/L 甘露醇 , 0.1%MES[ 2 , (N-玛琳)-乙烷
磺酸] ,0.05 mol/ L CaCl2 ·2H2O , pH5.8。按照张
改娜等[ 9] 方法分离与纯化原生质体。根据经验 ,那些
呈现规则的圆形 ,亮而透明的原生质体为有较强活力
的原生质体[ 10] 。原生质体的活力以存活原生质体占
原生质体总数的百分数表示。每次分离的原生质体
随机检查 20个视野 ,每个处理至少 3个重复。
1.3　原生质体培养
纯化的原生质体重新悬浮于培养液中 ,并调整
原生质体至合适密度 。然后按照张改娜等[ 9]方法培
养原生质体 ,原生质体培养液包括 DPD的基本成分
和附加的 2 , 4-D 、6-BA 、KT 、NAA 4 种激素的不同
组合 。相对分裂频率以培养 15d发生分裂的原生质
体数占植板的存活原生质体总数的百分数表示。每
次分离的原生质体随机检查 20个视野 ,每个处理至
少 3次重复 。
1.4　愈伤组织的形成及植株分化
待原生质体分裂形成小细胞团后添加甘露醇浓
度减半的培养基 ,以后每10d加入渗透压逐渐降低的
新鲜培养基。将生长至 2mm 左右的小愈伤组织转入
MS固体培养基(附加 2 ,4-D 2.0mg/ L , 6-BA 0.2mg/
L ,CH200mg/ L ,Sucrose3%, pH5.8)进行扩增 ,然后
转入附加 2 ,4-D 、6-BA 和 NAA 不同激素组合的 MS
分化培养基 ,在(25±2)℃,2 500lx的光照条件下诱导
苗分化[ 3] 。40d统计分化结果 ,并将生长到 2 ～ 3cm
时的再生苗切下 , 转入生根培养基(1/2MS +
Sucros3%+Agar 0.7%,pH5.8),诱导生根形成完整
植株。
1.5　rolB基因的 PCR检测
rolB基因是 TL-DNA 上与发状根形成密切相
关的基因。采用 Edw ards 等[ 11] 方法从再生植株叶
片和发状根中提取其基因组 DNA ,用 rolB 基因序
列设计引物:5′-ATGGATCCCAAATTGCTATTCCT-
TCCACGA -3′ 和 5′-TTAGGCTTCTTTCTTCAG-
GTTTACTGCAGC-3′,根据 Hamill 等[ 12] 的反应程
序 ,进行 PCR扩增 。扩增产物采用 1.5%琼脂糖凝
胶电泳和 EtBr 染色分析 。
1.6　冠瘿碱高压纸电泳检测
取 0.1 ～ 0.2g 原生质体来源的再生植株的发状
根和叶片 ,用 1mL 70%乙醇在 2mL Eppendo rf 管
中研碎 ,1.5×104 r/min 离心 15 min。0.01mL 的
上清液与甘露碱标准品(Sigma , S t.Louis , USA)
分别点在Waterman 层析纸上 , 45V/cm 的电压下
电泳30min ,展开剂为甲酸∶乙酸∶水=30∶60∶910 ,
pH 值 2.1。滤纸经 AgNO 3 染色和用 Na2S2O 3 冲
洗后 ,用吹风机快速吹干。
2　结果与分析
2.1　AmA 4 转化系原生质体的游离和纯化
2.1.1 　叶龄对分离原生质体的影响 　叶龄对
AmA4 转化系原生质体分离有一定影响(表 1)。
1 ～ 4 d刚萌发的嫩叶 、5 ～ 7d 嫩叶和 15 ～ 18d的老
叶分离原生质体的产率均偏低 ,且悬浮纯化时有较
多的残核和杂质。而 8 ～ 12d完全展开的嫩叶 ,其细
胞生长代谢旺盛 ,在试验范围内 ,此时的嫩叶可游离
出的原生质体最多 ,原生质体大小均匀 ,质膜完整
(图 1),且细胞残骸最少 。
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河南农业科学
表 1　不同时期的叶片游离原生质体的产量
叶龄(d) 漂浮前产率(%) 漂浮后产率(%) 悬浮杂质
1～ 4 22.1 0.5±0.5 很多
5～ 7 37.7 4.0±0.5 多
8～ 12 42.3 15.9±0.9 少
13～ 15 36.7 15.1±1.8 少
15～ 18 38.7 14.8±0.9 较多
图 1　纯化的叶肉原生质体(×600)
2.1.2　预处理对原生质体活力的影响　预处理包
括原生质体游离前材料在弱光下培养和质壁分离液
浸泡 。将 AmA4 再生植株放在 1 200lx 光照下培养
或预处理前 1周 ,将其放在 400lx 弱光下培养 ,然后
取 8 ～ 12d完全伸展开的嫩叶剪成 2mm 宽的细条 ,
分别用质壁分离液处理 0min 、 15min 、 30min 、
45min 、60min 、75min后 ,转入酶解液中酶解 4h ,离
心纯化后用培养液悬浮于培养皿中 ,于第 7天观察
原生质体的生活能力。结果(表 2)显示 ,游离前弱
光预培养和质壁分离液处理对原生质体活力都有着
积极的影响。影响原生质体活力的最显著的因素是
酶解前在质壁分离液中的预处理时间。预处理时间
从 15 ～ 60min ,原生质体存活力逐渐增强 ,60min 时
达到 72.3%。如果将剪成 2mm 宽的叶片直接酶
解 ,原生质体的活力显著下降 。
表 2　原生质体游离前培养光强和预处理时间对
原生质体活力的影响
预处理时间(min) 400 lx光照下的活力(%) 1200 lx光照下的活力(%)
0 8.2 3.4
15 34.5 11.9
30 51.5 44.5
45 58.9 60.8
60 72.3 54.3
75 58.2 49.8
2.2　原生质体的早期分裂 、愈伤组织再生及其影响
因素
2.2.1　酶解时间对原生质体分裂的影响　将预处
理的 AmA 4 再生植株无菌叶片转入酶解液中分别
酶解 4h 、10h 、16h ,离心纯化 。用培养液调整原生质
体植板密度为 3×105 个/mL ,并悬浮于培养皿中液
体浅层培养 。结果发现:酶解4h得到的原生质体活
力最强 ,最早开始一次分裂 ,且分裂频率最高 ,达到
32.4%。随着酶解时间的延长 ,一次分裂发生的时
间后推 ,分裂频率也在不断下降。说明在预处理之
后 ,酶解时间是影响原生质体活力的重要因素。
2.2.2　原生质体培养密度对其早期分裂的影响　
为了研究 AmA 4 原生质体的起始密度对其分裂频
率的影响 ,将分离的原生质体以不同密度在 DPD培
养基中进行液体浅层培养。再生细胞的早期分裂受
到原生质体起始培养密度的显著影响(图 2)。低密
度的原生质体第 1次分裂的培养时间长;原生质体
密度过高 ,大量聚集 ,分裂频率均较低 。只有 AmA 4
再生植株原生质体的植板密度为 3×105 个/mL
时 ,分裂频率可高达到 32.4%。
图 2　原生质体植板密度对其分裂频率的影响
在合适的密度下 ,原生质体在培养 72h后出现
第 1次分裂(图 3-A),第 5天出现第 2 次分裂 , 10d
后很多细胞发生多次分裂(图 3-B),并在 3周后形
成小细胞团(图 3-C)。
2.2.3　不同激素组合对原生质体分裂的影响　由
表 3 可知:2 , 4-D 为 2.0mg/ L , 6-BA 为 0.2 ～
0.5mg/L 的处理原生质体分裂频率较高 ,效果明显
优于 2 ,4-D 和 KT 的组合。NAA 的加入使得原生
质体不能很好的粘连 ,从而原生质体的分裂也相应
变缓慢 ,分裂频率降低 。总之 , AmA 4 再生植株叶肉
原生质体培养的最佳激素组合为 2 ,4-D 2.0mg/L+6-
BA 0.5mg/L 。
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2009年第 8期
A.原生质体一次分裂(× 790);B.原生质体多次分裂(×45);C.原生质体细胞团(×40)
图 3　草木樨状黄芪 A4 转化系原生质体早期分裂
表 3　不同激素组合对原生质体分裂的影响
处理
代号
激素(mg/ L)
2 , 4-D 6-BA KT NAA
分裂频
率(%)
1
2
3
4
5
6
7
2.0
2.0
2.0
2.0
1.5
1.5
1.5
0.2
0.5
0.2
0.0
0.2
0.0
0.0
0.0
0.0
0.0
0.2
0.0
0.2
0.2
0.0
0.0
0.2
0.0
0.0
0.2
0.0
30.7
32.4
14.7
26.9
25.4
18.4
23.6
　注:①基本培养基:DPD+2%蔗糖+0.3mol/ L甘露醇 ,
pH=5.8～ 6.2;②原生质体密度均为 3×105 个/mL
2.2.4　愈伤组织的形成与植株再生　原生质体培
养 4周后分裂形成肉眼可见的愈伤组织 ,此时需要
添加渗透浓度减半的新鲜培养基。大量植物原生质
体培养试验表明 ,随着细胞壁的再生和持续分裂 ,渗
透剂的浓度需要不断降低 ,才对培养物的生长有
利[ 13] 。待小愈伤组织生长到 2mm 大小时(图 4-
A),转到固体增殖培养基上扩增 。大约 3周可将愈
伤组织转到不同激素组合的 MS 分化培养基上 ,在
2500lx 光照下培养。2周后 ,几乎所有的愈伤组织
表面均有许多淡绿色芽点(图 4-B)。30d后 ,绿芽大
量出现。从表 4 可以看出 , 6-BA 和 NAA 组合比
KT 和 NAA 组合更有利于芽的分化 ,尤其在 1.5
mg/L 6-BA 和 0.2mg/L NAA 组合时芽分化率最
高可达到 91.75%。
　　试验中还发现:较高浓度的 6-BA(3 mg/L 以
上)会引起愈伤组织下部褐化 ,从而严重影响其分化
率 ,使分化率下降到 39.36%;在 1/2 M S 培养基和
MS培养基中 ,分化的幼苗均能生根 ,在培养基中加
入 0.2 mg/L NAA 生根频率提高。再生植株经炼
苗已移至土壤(图 4-C)。该再生植株与未转化植株
相比 ,结节较短 ,叶片较大。
表 4　不同激素对原生质体愈伤组织分化的影响
处理
代号
激素(mg/ L)
6-BA KT NAA
接种愈伤
组织块数
分化愈伤
组织块数
芽的分化
率(%)
1 1 0 0.2 92 78 84.78
2 1.5 0 0.2 97 89 91.75
3 3 0 0.2 94 37(褐色) 39.36
4 0 1 0.2 94 55 58.51
5 0 2 0.2 102 67 65.69
6 0 4 0.2 81 43 53.09
7 1 0 0.5 83 60 72.28
　注:基本培养基:MS+3%蔗糖+0.7%琼脂 , pH=5.8～ 6.2
2.3　AmA 4 再生植株的 PCR分析
PCR产物经电泳后 ,在再生发状根和再生植株
叶片中均扩增出 780bp的 rolB 基因片段 ,而在阴性
对照植株中没有发现该片段(图 5)。从而证明 rolB
基因经原生质体培养后 ,在再生植株和发状根中仍
然存在 。
A.肉眼可见的小愈伤组织;B.分化的愈伤组织;C.移栽至土壤的再生植株
图 4　愈伤组织的形成和植株再生
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河南农业科学
M .λ-DN A(H ind Ⅲ+EcoR Ⅰ 酶切);1.未转化植株 DNA;2.pRiA4
质粒 DNA;3.原始发状根 DNA;4.原生质体再生植株根
DNA;5.原生质体再生植株叶 DNA;o.未转化植株;r.原
生质体再生植株的根;p和 q.原生质体再生植株的叶片;
m.甘露碱标准品
图 5　再生植株和发状根的 rolB基因的 PCR检测(左)
和甘露碱的纸电泳检测(右)
2.4　甘露碱的纸电泳分析鉴定
农杆碱型发根农杆菌 TR-DNA中存在甘露碱合
成酶基因。当 T-DNA整合到植物细胞基因组中并
表达后 ,合成特异产物甘露碱。在原生质体来源的再
生植株和再生发状根提取物中 ,利用高压纸电泳检测
到甘露碱的存在 ,而阴性对照中未出现阳性斑点(图
5)。证明在再生植株和再生发状根中 , TR-DNA 上的
甘露碱基因经原生质体培养后未丢失 。
3　讨论
原生质体的产量和活力直接影响着原生质体的
成功与否。影响原生质体产量和活力的因素主要包
括材料 、酶的种类及配比 、酶解时间 、分离与纯化的方
法等[ 14] 。研究中发现 ,在以 AmA 4 再生植株的叶片
为材料时 ,采用充分展开的幼叶 ,原生质体的得率高 ,
大小均一 ,离心时不易破碎 ,且再生壁的能力强。同
时预处理时间和酶解时间对原生质体的产量和活力
也是至关重要的。只有在 400lx 弱光培养的幼叶在
质壁分离液中预处理 60min , 酶解 4h 才能获得
72.3%的有活力的原生质体。
原生质体的起始培养密度对原生质体培养成功
与否影响很大 ,原生质体无论是处于低密度还是高密
度下 ,均不易获得较高的分裂频率。只有处于适当密
度的原生质体 ,才易于分裂 。在本试验所采用条件下 ,
AmA 4原生质体的最佳培养密度为 3×105 个/mL ,此
时其分裂频率可达 32.4%。细胞在分离 、脱壁前是
一个统一的有机体 ,彼此之间相互影响和协调 。过
低的培养密度使原生质体内涵物外渗而引起褐变 ,
或仅分裂 1次后即死亡;而原生质体密度过高 ,则彼
此聚集并相互竞争营养 ,亦不能获得较高的分裂频
率。大量的研究表明 ,物种不同 ,原生质体的最适培
养密度也不相同[ 6 , 15] 。另外 ,不同的植物生长调节
物质组合对 AmA 4 再生植株叶肉原生质体分裂的
影响表明 ,植物生长调节物质也是原生质体培养获
得成功的重要因素 。
本试验对 AmA 4 进行原生质体游离 、培养 、再
生植株 ,并检测原生质体再生后外源基因未丢失。
本研究所建立的再生体系不仅为体细胞杂交提供筛
选标记 ,也为通过基因转移等遗传操作对其他牧草
植物进行品质改良提供可行途径 。
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