全 文 ：中 国 草 地
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5 0 ~ 5 4
草木握状黄茂单细胞培养再生植株
张相岐 ’ 王 献平 杨 勇
(辽宁师范大学生物系 , 大连 1 1 6 0 2 2)
【提要】 对草木挥状黄蔑茎段愈伤组织 ,单细胞采取振荡悬浮和静止浅层培养的结果表明 ,
振荡培养优于静止浅层培养 . 振荡培养条件下单细胞 2~ 3 天进行第一次分裂 , 10 天左右形成小细
胞团 ,进而发育为胚状体或愈伤组织 . 30 天左右小愈伤组织直径达 1~ Zmm ,愈伤组织和胚状体再
生频率为 8 块 / m】(0 . 2% ) ,是静止培养的 3 . 8 倍 。 经继续振荡培养 ,小愈伤组织和胚状体即可分化
或萌发出大量幼苗 。 小愈伤组织经固体培养荃增殖培养后 . 转入分化培养基可 10 。%分化 . 目前已
获得大量再生植株 。
关键词 : 草木挥状黄蔑 单细胞 再生植株
P l a n t R e g e n e r a t i o n F r o m M o n o c e l l C u理t u r e o f sA rar g a l us m el 汀“咖es . Z h a n g X i-
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M o n oc e l ls w e r e iso la t e d f r o m t h e s u s p e n s io n e u lt u r e s w h ie h o r i g i n a t e d f r o m e a l li d e r i v e d
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.
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K e y w o r d s : A s t r a 圳 l u s 柑l l’ o t 0 id 尸 s , m o n oc e ll , p la n t r e g e n e r a t i o n
利用现代化生物技术培育优 良牧草品种
是改良草地和提高牧草产量的重要措施 。 豆
科植物中有许多优 良草种 , 已受到遗 传工程
工作者的广泛重视 。 首楷 、 短柱花草等已获得
转基 团植株 .7[ 8] ,这是牧草遗传工程研究的一
大进展 。 植物单细胞培养再生植株的研究是
进行遗传操作和细胞突变体选择的一项关键
性技术 。 1 9 7 5 年 K ao 等就对野豌豆属的 V i-
5 0
. 现 在 工作 单 位 : 中 国 科 学 院遗 传研究所 , 北京
1 0 0 1 0 1
。
作者简介 : 张相岐 , 男 , 38 岁 ,讲师 ( 现为中国科学院
遗传研究所博士 后研 究人员 ) , 主要从事植物同工醉 、 植物
细胞和原生质体培养 、麦类作物远缘杂种花药 培养及抗病
性等的研究工作 ,增在有关刊物上发表论文 10 余篇 .
收稿日期 : 1 9 93一 0 3一 1 0 .
血 haS O jta a n进行了单细胞悬浮培养 , 并获得
了细胞团 .1[ 。 但近 20 年来进展缓慢 ,迄今只
有 10 几种豆科植物 由单细胞培养再生了完
整植株〔卜 s] 。
草木娜状黄蔑 ( stA ar g以us me l叔耐es )
属豆科牧草 ,有一定的经济价值 。关于它的组
织培养已有简单的报道 l1[ , 本文主要报道单
细胞培养再生植株的研究结果 。
1 材料和方法
供试草木梅状黄茂种子采集于吉林省西
部草原 。 干种子用浓硫酸浸泡 3 分钟后转入
0
.
1%氯化汞溶液中表面灭菌 3 分钟 ,无菌水
冲洗 4 次 ,接种于无激素的固体 M S 培养基
上萌发 。 待幼苗长出 3一 4 片真叶时切取幼
茎 ,剪成 s m m 左右的段接种至 G , 、 G Z 、 G 。 和
G
` 培养基 (表 l) 上诱导愈伤组织 。 约 30 天
时 ,选择生长速度快 、状态较佳的愈伤组织分
别用镊子 夹碎 , 以 每 29 愈伤组织 50 ml 液体
培养基 (不含水解乳蛋白的 L ; 、 L : 和 L ` )的
比例接种于 15 o m l 的三角瓶中 , 在旋转式摇
床上 振 荡 培养 ( 120 ~ 14 0r p m , 室 温 , 散 射
光 ) 。 每种培养基接种 4~ 6 瓶 。 培养初期每
4 ~ 5 夭换液一次 , 每次换 入 1/ 2 新鲜培养
基 。 第二次换液时弃去没有摇散的大块愈伤
组织 。 以后每 7 天换液一次 , 继续培养 3 ~ 4
周 。 选择增殖速度快 ,单细胞密度大 , 细胞状
态好的悬浮系用 3 0 0 目尼龙网过滤 , 得到 单
细胞悬浮液 。在倒置镜下观察单细胞形态 , 计
算单细胞密度和活细胞 、 圆形或椭圆形细胞
的比例 。 细胞悬浮液经过静止沉淀后弃去部
分清液 ,再分别用液体培养基 L , 、 L : 、 L 。 和 eL
调节单细胞密度至 4 . 0一 6 . o x 10’ 个 / m l . 调
节好的细胞悬浮液一部分继续在三角瓶中振
荡培养 ( 10 0一 12 0 r p m ) , 一部分在 4 o m m 的
培养皿中做静止浅层培养 ( 25 士 1℃ ) 。每个培
养皿中加入细胞悬浮液 2 . 5一 3 . o m l。 每 7 天
换液一次 ,每次换入 1 2/ 新鲜培养基 。 培养过
程中跟踪观察单细胞的分裂与再生过程 。 待
再生的小愈伤组织长到 1一 Zm m 时 , 分别统
计不同培养基和不同培养方法的愈伤组织再
生频率 。 再生频率以每毫升初始培养物再生
的愈伤组织块数计 。
振荡培养再生的小愈伤组织一部分继续
振荡培养 ,待 愈伤组织分化出芽后转入分化
培养基 ( D l一D . )中进一步成苗 . 另一部分转
入 G : 、 G : 、 G 。 和 G 。 固体培养基增殖 , 待愈伤
组织长到 5 . Om m 左右时再转入分化培养基
分化出苗 . 静止浅层培养再生的小愈伤组织
经固体培养增殖后转入培养基分化 。 当再生
苗长到约 c3 m 高时从茎基部剪下转入生根
培养基 ( R : 和 R . )生根 。 培养过程中使用的培
养基列于表 1 .
表 1 草木扭状黄蔑单细胞培养的培养基成份 ( m g / L )
培 养 签
基本培养羞
水解乳蛋白
泛酸钙
生物索
2
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5
注 : 所有培养基均 含 3 %蔗搪 , p H 值 5 . 8 , 高压灭菌 。 G 、 D 、 R 为固体培养荃 ,含 0 . 7 %琼脂 。 L 为液体培养荃 。
2结果
草木梅状黄蔑的幼茎段在 G : 、 G : 、 G 。 和
G
。
( 表 ) l培养基上培养一周后即可陆续诱导
出愈伤组织 , 诱导率可达 10 0% . 培养 3 ~ 4
周愈伤组织可生长至 5一 10 m m 。 在 4 种培养
基上诱导出的愈伤组织形态相似 ,一般为白
色 , 较松软 ,表面粗糙 . 愈伤组织在 2 , 4 一 D
含量较高的 G : 和 G 。 培养基上生长稍快 , 在
G
: 和 G 。 中诱导的愈伤组织生长 4 周后有部
分分化 。
愈伤组织在液体培养基 L : 、 L Z 和 L 6 (表
1) 中振荡培养 4一 6 周便可获得含有大量细
胞的悬浮培养物 . 单细胞密度为 4 X 1 0’ ~ 1
X l 护个 /m l , 选择的活细胞和 圆形 或椭 圆形
细胞较多时 , 细胞质浓厚的悬浮系经 3 0 目
尼龙网过滤后便得到单细胞悬浮液 。 单细胞
悬浮液中活细胞 比例为 89 % , 圆形和椭圆形
细胞 比例为 “ % (图 I 一 1 ) 。
单细胞培养在 L ; 培养基中获得 了较好
的结果 . 在 L , 中的单细胞振荡培养 2一 3 天
观察到第一次分裂 ( 图 I 一 2) , 4一 5 天观察
到第二次分裂 (图 I 一 3 ) 。 能分裂的细胞绝大
多数为圆形和椭圆形 细胞 , 极少数长形细胞
也能进行一两次横断式分裂 , 但不能持续分
裂 。 持续分裂的细胞培养 10 夭左右即形成几
十个细胞的小细胞团 (图 I 一 4 ) ,这时培养物
中细胞密度显著增加 , 4一 5 天细胞数量即可
增加一倍 。 不能分裂或不能持续分裂的细胞
往往变成巨大的长形或不规则形细胞 , 细胞
质越来越稀疏 ,最后逐渐死亡 .
结构较紧密的细胞团能够继续发育成小
愈伤组织 ,经 30 一 35 天小愈伤组织直径可达
1
.
0 ~ 2
.
Om m
, 平均每毫升初始培养物再 生
小愈伤组织 8 块 , 愈伤组 织再生频率约 。
2%
. 其它三种培养基中的愈伤组织再生率均
不同程度地低于 L ; 中的再生率 (表 2 ) 。 小愈
伤组织白色 ,结构致密 。 继续振荡培养 1~ 2
5 2
周即可逐渐转绿 ,随之陆续分化出大量幼芽 ,
同时产生许多新的细胞团和小愈伤组织 , 使
悬浮培养物成为细胞团 、 愈伤组织和幼芽的
混合物 (图 I 一 6 ) 。 这种混合物可以长期继代
培养 , 每周继代一次 ,愈伤组织和幼芽的数量
可增加一倍以上 . 目前已继代培养一年多 ,愈
伤组织的增值速度和分化能力均没有降低 。
如把摇床转速放慢至 8。~ l o o rP m ,即可形成
许多直径 8~ 10m m 的丛生芽状物 (图 I 一
7 )
,一块这样的芽状物可有幼芽 20 ~ 40 个 。
把巳分化出幼芽的小愈伤组织转入固体培养
基 ( D : 一 D . )中可迅速发育成丛生苗 ( 图 I 一
8 )
. 小愈伤组织也可转入 G 系列培养基增
殖 , 10 天左右愈伤组织直径可达 s m m 以上 ,
再转入分化培养基 D : 一 D ` 中 ,一周后即可分
化出大量丛生芽 . 愈伤组织在 4 种分化培养
基上的分化率均为 10 0% (每种培养基上接
种愈伤组织 1 0 0 ~ 4 0 0 块 ) 。 在分化培养过程
中仍伴有愈伤组织的快速增殖 , 新增殖的愈
伤组织又陆续分化出芽 , 所以出苗量很大 , 一
快 10 m m 左右的愈伤组织经 3 周分化培养可
得到 20 一 40 株幼苗 。
当幼苗长至 3c m 左右时 , 即可转入生根
培养基 . 在 R 3 和 R ; 中两周左右生出不定根 ,
成为完整的再生植株 (图 I 一 9) 。 在 R : 和 R `
中的生根率分别为 7 %和 81 % 。 目前 已获得
大量的再生植株 。
培养过程中观察到许多结构紧密的小细
胞可以发育为胚状体 (图 I 一 5) 。 当胚状体发
育至 1 ~ Zm m 大小时 , 无论继续在原培养基
中振荡培养或转入无激素的固体 M S 培养基
上均可 由胚芽端萌发出芽 , 但胚根端极易愈
伤化 , 而且不能长出正常的胚根 。将幼苗转入
生根培养中便可长出不定根 , 与由器官发生
途径分化出的幼苗相似 .
在 L : 中静止浅层培养的单细胞 3~ 4 天
便进行第一次分裂 , 部分细胞持续分裂形成
细胞团 (图 I 一 10 ) , 但未见形成胚状体结构 .
2结果
草木梅状黄蔑的幼茎段在 G :、 G :、 G。 和
G
。
(表 l )培养基上培养一周后即可陆续诱导
出愈伤组织 , 诱导率可达 10 0% . 培养 3 ~ 4
周愈伤组织可生长至 5一 10 m m 。 在 4 种培养
基上诱导出的愈伤组织形态相似 ,一般为白
色 , 较松软 ,表面粗糙 . 愈伤组织在 2 , 4 一 D
含量较高的 G : 和 G 。 培养基上生长稍快 , 在
G
: 和 G 。 中诱导的愈伤组织生长 4 周后有部
分分化 。
愈伤组织在液体培养基 L : 、 L Z 和 L 6 (表
1) 中振荡培养 4一 6 周便可获得含有大量细
胞的悬浮培养物 . 单细胞密度为 4 X 1 0’ ~ 1
X l 护个 /m l , 选择的活细胞和 圆形 或椭 圆形
细胞较多时 , 细胞质浓厚的悬浮系经 3 0 目
尼龙网过滤后便得到单细胞悬浮液 。 单细胞
悬浮液中活细胞 比例为 89 % , 圆形和椭圆形
细胞 比例为 “ % (图 I 一 1 ) 。
单细胞培养在 L ; 培养基中获得 了较好
的结果 . 在 L , 中的单细胞振荡培养 2一 3 天
观察到第一次分裂 ( 图 I 一 2) , 4一 5 天观察
到第二次分裂 (图 I 一 3 ) 。 能分裂的细胞绝大
多数为圆形和椭圆形 细胞 , 极少数长形细胞
也能进行一两次横断式分裂 , 但不能持续分
裂 。 持续分裂的细胞培养 10 夭左右即形成几
十个细胞的小细胞团 (图 I 一 4 ) ,这时培养物
中细胞密度显著增加 , 4一 5 天细胞数量即可
增加一倍 。 不能分裂或不能持续分裂的细胞
往往变成巨大的长形或不规则形细胞 , 细胞
质越来越稀疏 ,最后逐渐死亡 .
结构较紧密的细胞团能够继续发育成小
愈伤组织 ,经 30 一 35 天小愈伤组织直径可达
1
.
0 ~ 2
.
Om m
, 平均每毫升初始培养物再 生
小愈伤组织 8 块 , 愈伤组 织再生频率约 。
2%
. 其它三种培养基中的愈伤组织再生率均
不同程度地低于 L ; 中的再生率 (表 2 ) 。 小愈
伤组织白色 ,结构致密 。 继续振荡培养 1~ 2
5 2
周即可逐渐转绿 ,随之陆续分化出大量幼芽 ,
同时产生许多新的细胞团和小愈伤组织 , 使
悬浮培养物成为细胞团 、 愈伤组织和幼芽的
混合物 (图 I 一 6 ) 。 这种混合物可以长期继代
培养 , 每周继代一次 ,愈伤组织和幼芽的数量
可增加一倍以上 . 目前已继代培养一年多 ,愈
伤组织的增值速度和分化能力均没有降低 。
如把摇床转速放慢至 8。~ l o o rP m ,即可形成
许多直径 8~ 10m m 的丛生芽状物 (图 I 一
7 )
,一块这样的芽状物可有幼芽 20 ~ 40 个 。
把巳分化出幼芽的小愈伤组织转入固体培养
基 ( D : 一 D . )中可迅速发育成丛生苗 ( 图 I 一
8 )
. 小愈伤组织也可转入 G 系列培养基增
殖 , 10 天左右愈伤组织直径可达 s m m 以上 ,
再转入分化培养基 D : 一 D ` 中 ,一周后即可分
化出大量丛生芽 . 愈伤组织在 4 种分化培养
基上的分化率均为 10 0% (每种培养基上接
种愈伤组织 1 0 0 ~ 4 0 0 块 ) 。 在分化培养过程
中仍伴有愈伤组织的快速增殖 , 新增殖的愈
伤组织又陆续分化出芽 , 所以出苗量很大 , 一
快 10 m m 左右的愈伤组织经 3 周分化培养可
得到 20 一 40 株幼苗 。
当幼苗长至 3c m 左右时 , 即可转入生根
培养基 . 在 R 3 和 R ; 中两周左右生出不定根 ,
成为完整的再生植株 (图 I 一 9) 。 在 R : 和 R `
中的生根率分别为 7 %和 81 % 。 目前 已获得
大量的再生植株 。
培养过程中观察到许多结构紧密的小细
胞可以发育为胚状体 (图 I 一 5) 。 当胚状体发
育至 1 ~ Zm m 大小时 , 无论继续在原培养基
中振荡培养或转入无激素的固体 M S 培养基
上均可 由胚芽端萌发出芽 , 但胚根端极易愈
伤化 , 而且不能长出正常的胚根 。将幼苗转入
生根培养中便可长出不定根 , 与由器官发生
途径分化出的幼苗相似 .
在 L : 中静止浅层培养的单细胞 3~ 4 天
便进行第一次分裂 , 部分细胞持续分裂形成
细胞团 (图 I 一 10 ) , 但未见形成胚状体结构 .
培养 4 0一 5 0天 时小愈伤组 织达 1. 0一 2.。
m m (图 I 一 1 1) .在 4种液体培养基 中愈伤
组织再生率分别为 0 1一 3 2块 /m l (表 2) .静
止培养形成的小愈伤组织多数结构疏松 , 部
分呈半透 明状 。 小愈伤组织转入 G 系列培养
基中增殖 2 周后转入分化培养基 D : 一 D . 中 ,
经 1~ 2 周分化出丛生芽 (图 I 一 12 ) , 分化频
率均为 1 0。% .
丧 2 草木御状黄蔑单细胞培养的愈伤组织再生
培养基 愈伤组织再生率 (块 / m l)振荡培养 ( A ) 静止培养 ( B ) A用
11 8 8 2 3 3
.
8
l: 6 9 18 3
.
8
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.
3
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.
6
3 讨论
比较两种培养方法可见 , 在三角瓶 中振
荡培养优于浅层静止培养 . 主要表现在以下
三个方面 : ` l) 愈伤组织再生率高 ,在不同培
养基中分别提高 2 . 6一 3 . 3 倍 (表 2 ) ; ( 2 ) 培
养周期可缩短 2一 3 周 ,主要因为愈伤组织再
生时间可缩短 10 天左右 , 并且愈伤组织在液
体培养基中可直接分化 ,无需愈伤组织增殖
过程 ; ( 3) 换培养基时操作简便 , 一个 150 m !
的三角瓶 (含 4 5一 5 0m l培养物 ) 相当于 1 5~
20 个直径 40 m m 培养皿 (含 2 . 5~ 3 . o nl 培
养物 )的培养量 , 工作效率可大大提高 。
植物单细胞培养是植物遗传操作和细胞
突变体选择的关键技术 。 目前 , 由于大多数经
济植物细胞离体培养的再生系统尚未建立或
再生频率很低 , 从而使这些经济植物遗传工
程的研究受到限制 . 因此 ,研究和建立有 .效的
经济植物离体培养再生系统是十分必要的 .
本实验结果表明 , 草木 择状黄蔑单细 胞在
M S 为基础的较简单液体培养基上获得了每
毫升培养物再生 8 块愈伤组织的再生频率 ,
即一瓶 45 ~ 50 m l 单细胞悬浮液经 30 天左右
的振荡培养可得到 3 0 0。~ 4 0 0 0 块愈伤组织 。
在继续培养过程中 ,愈伤组织和分化的幼芽
数量每周可增加一倍以上 , 并且愈伤组织分
化率为 10 0% ,出苗率非常高 ,这在其它植物
细胞培养中是不多见的 . 以上说明 ,我们已经
建立起一套适合于草木择状黄蔑单细胞再生
植株的培养系统 . 因此 ,草木择状黄蔑是一种
进行植物遗传工程研究的良好材料 .
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(上接第 67 页 )
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