全 文 ：　２０１５，４１（６）：６０－６６　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
收稿日期：　２０１４－１１－１７　　　修订日期：　２０１４－１２－２２
基金项目：　四川省教育厅重点项目（１２ＺＡ１１５）
＊ 通信作者 Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｔｈ１２２７＠１２６．ｃｏｍ
南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定
谯天敏，　罗　蓉，　朱天辉＊
（四川农业大学林学院，成都　６１１１３０）
摘要　经形态学特征观察、致病性测定及ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析，首次确定红豆杉根腐病病原为尖孢镰刀菌（Ｆｕｓａｒｉ－
ｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）。采用平板对峙培养法从健康植株根际土壤中筛选得到３株对尖孢镰刀菌具有明显拮抗作用的芽
胞杆菌ＹＢ６、ＹＢ１５、ＹＢ３７。经形态学、生理生化及１６ＳｒＤＮＡ同源性分析，并通过构建１６ＳｒＤＮＡ系统发育树，将
ＹＢ６、ＹＢ１５和ＹＢ３７分别鉴定为蜡样芽胞杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ）、解淀粉芽胞杆菌（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）和多黏类
芽胞杆菌（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕ　ｐｏｌｙｍｙｘａ），其中多黏类芽胞杆菌拮抗效果最好，具有进一步研究开发的潜力。本研究通过
对南方红豆杉根腐病病原鉴定及其拮抗芽胞杆菌的筛选，对该病的防治提供了理论依据。
关键词　南方红豆杉；　根腐病；　尖孢镰刀菌；　拮抗芽胞杆菌
中图分类号：　Ｓ７６３．１Ｓ４７６　　文献标识码：　Ａ　　ＤＯＩ：　１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１５．０６．０１０
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｏｆ　Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ
ｖａｒ．ｍａｉｒｅｒ　ａｎｄ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｉｔｓ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ
Ｑｉａｏ　Ｔｉａｎｍｉｎ，　Ｌｕｏ　Ｒｏｎｇ，　Ｚｈｕ　Ｔｉａｎｈｕｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１１１３０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｏｆ　Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｍａｉｒｅｒ　ｗａｓ　ｆｉｒｓｔ　ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄ．
Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｒＤＮＡ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ
ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｏｆ　ｒｏｏｔ－ｒｏｔ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｏｆ　Ｔ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｍａｉｒｅｒ　ｗａｓ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ．Ｔｈｅ　ｔａｂｌｅｔ　ｃｏｎｆｒｏｎｔａｔｉｏｎ
ｔｒａｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｄｏｐｔｅｄ　ｔｏ　ｓｃｒｅｅｎ　ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｂａｃｉｌｕｓ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｐｌａｎｔ　ｒｈｉｚｏｓｐｈｅｒｅ，ａｎｄ
ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｏｂｖｉｏｕｓ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｎａｍｅｌｙ　ＹＢ６，ＹＢ１５　ａｎｄ　ＹＢ３７．Ｔｈｒｏｕｇｈ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉ－
ｃａｌ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１６Ｓ　ｒＤＮＡ　ｐｈｙ－
ｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ，ｗｅ　ｆｏｕｎｄ　ｔｈａｔ　ＹＢ６，ＹＢ１５　ａｎｄ　ＹＢ３７　ｗｅｒｅ　Ｂａｃｉｌｕｓ　ｃｅｒｅｕｓ，Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ　ａｎｄ　Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｕｓ　ｐｏｌｙ－
ｍｙｘａ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ　ｗａｓ　ｔｈｅ　ｂｅｓｔ　ｗｉｔｈ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．
Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ｓｏｍｅ　ｖａｌｕａｂｌｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｍａｉｒｅｉ；　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ；　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ；　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　Ｂａｃｉｌｕｓ
　　红豆杉在资源植物中具有较突出的地位［１］，它
是集药用、观赏、绿化、特种优质用材为一体的珍贵
树种，其根、茎、叶中可提取一种近年来全球紧俏的
高新技术抗癌新药成分紫杉醇［２］。天然红豆杉资源
非常有限，远远不能满足医药市场的需求［３］，所以人
工种植的红豆杉成为提取紫杉醇的主要来源。南方
红豆杉因其出苗率较高而被选为人工栽种的优良
种。但南方红豆杉实生苗繁殖慢，扦插繁殖技术要
求高，尤其苗期病虫害发生较多［４］。近年来，随着南
方红豆杉人工种植面积的扩大，病害逐年加重，对紫
杉醇的生产供应产生了极大的影响。
目前，国内有关红豆杉病害的研究较少。范晓
龙等［２］根据Ｓｕｔｔｏｎ［５］的炭疽病分类鉴定方法对南方
红豆杉炭疽病病原进行了分离鉴定。有关红豆杉根
腐病病原分离、鉴定及其拮抗菌的筛选等研究尚未
见报道。根腐病是一种较难防治的土传病害［６］，生
产上常采用化学防治方法，但化学农药的大量不合
理使用给生态环境及人类带来了不良影响［７］，也无
法达到根治的效果。生物防治方法因具有安全、经
济、长效和不污染环境等特点而逐渐成为防治病虫
４１卷第６期 谯天敏等：南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定
害的有效手段。微生物农药的开发利用是生物防治
未来的主要趋势，拮抗菌株的筛选和鉴定则是微生
物农药开发的基础［８］。
本试验从发病的南方红豆杉根部分离出一株致
病菌株，从形态学、致病性和分子生物学等方面进行
了鉴定，并针对该病原菌筛选出３株拮抗作用较好
的芽胞杆菌，以期为南方红豆杉根腐病的有效防治
奠定基础。
１　材料与方法
１．１　病原菌分离
从雅安市天赐苗木有限公司洪雅县生产基地采
集具有南方红豆杉根腐病典型症状的新鲜病株进行
室内鉴定。采用常规组织分离法［９］进行分离：先用
无菌水将新鲜的病株根部冲洗干净，观察根部症状。
从病健交界处切取４ｍｍ×４ｍｍ的病组织，在７０％
乙醇中浸泡１～２ｍｉｎ，再移至０．１％的升汞中灭菌３
～４ｍｉｎ，接着用无菌水洗３～４次。在无菌条件下
将病组织接种至ＰＤＡ平板培养基上培养，长出菌丝
后，取菌落边缘菌丝转至新鲜ＰＤＡ上培养，经单孢
纯化后获得菌种，保存于ＰＤＡ斜面上，并于４℃冰
箱中备用。
１．２　病原鉴定
１．２．１　致病性测定
用柯赫氏法则（Ｋｏｃｈ’ｓ　ｐｏｓｔｕｌａｔｅ）验证病原菌
的致病性。将分离并纯化的真菌移至ＰＤＡ培养基
上培养７ｄ后，加２０ｍＬ无菌水洗下孢子，制成浓度
为１０６～１０７ 个的真菌孢子悬浮液，然后采用伤口接
种法［９］（在健康无病、生长良好的植株基部距离土面
３～５ｃｍ处用灭菌刀轻轻弄伤根系表皮，使之形成
伤口），在伤口处滴孢子悬浮液２ｍＬ／株，３次重复，
每次重复接种１０株，以无菌水处理作对照。每天定
时观察植株发病情况并做记录。从接种发病的病株
根部取腐根木质部和韧皮部病健交界处组织，用组
织分离法分离病原菌，并进行鉴定。
１．２．２　病原菌的形态观察
将分离获得的优势菌株在 ＰＤＡ 上培养，于
２５℃恒温培养箱中培养５ｄ，在此期间观察记录病
原菌菌株的培养特征，包括菌落颜色、形态和菌落生
长速度；制作切片，在光学显微镜下观察有无大、小
型分生孢子和厚垣孢子及其大小、形状和着生方式；
隔膜有无及其数目、产孢结构等。参考Ｂｏｏｔｈ镰刀
菌分类标准［１０］和真菌鉴定手册［１１］进行鉴定。
１．２．３　病原菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析
１．２．３．１　ＤＮＡ的提取
采用摇床振荡培养方法液体培养病原菌，具体
操作：接种病原菌菌株于ＰＤＡ培养基上，室温下连
续培养３ｄ后，取菌落边缘菌丝少许，转接于装有
１００ｍＬ　ＰＤ液体培养基的３００ｍＬ锥形瓶中，２５℃，
１２５ｒ／ｍｉｎ条件下振荡培养５ｄ。收集菌丝体，先用
无菌水冲洗干净，再用无菌滤纸吸干多余水分。收
集的菌丝置于－２０ ℃条件下保存备用。基因组
ＤＮＡ的提取参照天根植物基因组 ＤＮＡ提取试剂
盒的操作步骤。
１．２．３．２　ＰＣＲ扩增
扩增ｒＤＮＡ片段的引物为真菌通用引物ＩＴＳ１
和ＩＴＳ４，上海生工技术公司合成。其序列分别为
ＩＴＳ１：５′－ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ－３′；ＩＴＳ４：
５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ－３′。反应扩增
体系（２０μＬ）包括：基因组 ＤＮＡ　１μＬ，１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ，０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　１μＬ，５Ｕ／μＬ
ｒ　Ｔａｑ　０．２μＬ，１μｍｏｌ／Ｌ　ＩＴＳ１　０．５μＬ，１μｍｏｌ／Ｌ
ＩＴＳ４　０．５μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１４．８μＬ。反应程序为：９６℃
预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，５２℃退火３０ｓ，７２℃
延伸１ｍｉｎ，３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
ＰＣＲ产物的检测在１．５％琼脂糖凝胶电泳上进行。
１．２．３．３　产物的回收克隆
参照林剑伟等［１２］的方法，利用回收试剂盒（天
根植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒）对目标基因片段
进行切胶、回收、纯化。将回收的ＰＣＲ产物连接至
ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，转化大肠杆菌ＪＭ１０９感受态，利
用菌落ＰＣＲ筛选阳性克隆［１３］，送上海生工技术公
司进行测序。
１．２．３．４　ＩＴＳ序列分析及系统发育树的构建
将测序所得的片段序列，登录ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ
比对，从ＧｅｎＢａｎｋ中下载与所得片段同源性较高的菌
株的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列，利用 ＭＥＧＡ　５．０建立病原菌株
的系统发育树，进行基于ｒＤＮＡ－ＩＴＳ的序列分析。
１．３　拮抗芽胞杆菌的筛选与鉴定
１．３．１　筛选
１．３．１．１　分离纯化
从雅安市天赐苗木有限公司洪雅县南方红豆杉
栽培基地采集健康植株根际土样，风干备用。称取
土样１０ｇ，放入盛有９０ｍＬ无菌水和玻璃珠的三角
·１６·
２０１５
瓶中，摇床上剧烈振荡３０ｍｉｎ后于８０℃的水浴中
保持２０ｍｉｎ。用无菌水进行梯度稀释并涂布ＮＡ平
板，于３７℃培养箱中培养２４ｈ左右，挑取菌落形态
差异明显的单菌落进入初筛。
１．３．１．２　初筛
以病原菌为指示菌，采用ＰＤＡ平板对峙生长法。
平板中央先移入直径为３ｍｍ的病原菌的琼脂块，再将
分离得到的菌株点接在距平板中央３ｃｍ处的４个角点
上，每个菌株３次重复，置于２５℃培养箱中培养３～
５ｄ，选出对病原菌生长有抑制作用的菌株进入复筛。
１．３．１．３　复筛
将初筛得到的菌株采用平板对峙法进行反复筛
选，每个菌株３次重复，置于２５℃培养箱中培养３
～５ｄ，选出对病原菌生长抑制效果明显的菌株，并
测量抑菌带大小（细菌菌落中心至病原菌菌丝边缘
的距离）和计算抑菌率，直到筛出抑菌圈半径较大，
被抑病原菌菌丝边缘平齐且拮抗作用持久的菌株。
抑菌率（％）＝（对照病原菌菌落直径—处理病
原菌菌落直径）／对照病原菌菌落直径×１００。
１．３．２　鉴定
１．３．２．１　形态特征
参照沈萍等［１４］的方法，观察拮抗芽胞杆菌在
ＮＡ培养基上的生长特征和显微形态特征。
１．３．２．２　生理生化特征
参照《伯杰细菌鉴定手册》［１５］、《常见细菌系统
鉴定手册》［１６］、Ｇｏｒｄｏｎ等的《芽胞杆菌属》［１７］和王大
耜的《细菌分类基础》［１８］，对拮抗作用较好的菌株进
行相关生理生化指标的测定。
１．３．２．３　１６ＳｒＤＮＡ同源性分析
采用摇床振荡培养方法液体培养拮抗菌株１８
～２４ｈ，收集菌体，以ＤＰ３０５离心柱型细菌基因组
ＤＮＡ提取试剂盒（由北京天根生化科技有限公司提
供）提取的基因组ＤＮＡ为模板，采用细菌１６ＳｒＤ－
ＮＡ通用引物２７Ｆ（５′－ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴ－
ＣＡＧ－３′）和１４９２Ｒ（５′－ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣ－
Ｔ　Ｔ－３′）进行 ＰＣＲ扩增。２５μＬ反应液：２×ＰＣＲ
Ｍａｓｔｅｒ　ｍｉｘ　１２．５ｍＬ，引物２７Ｆ和１４９２Ｒ浓度０．２μｍｏｌ／
Ｌ，各０．７５ｍＬ，目的ＤＮＡ　１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ　１０μＬ。ＰＣＲ反应
程序参照杜毓博等［１９］：９４ ℃ ５ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ｓ、
５５℃４５ｓ、７２℃６０ｓ，３０个循环；７２℃７ｍｉｎ。反
应结束后，用１％琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ扩增结
果，用Ｐｒｏｍｅｇａ公司的 Ｗｉｚａｒｄ　ＰＣＲ产物纯化试剂
盒对ＰＣＲ产物进行纯化，回收目的片段，送生工生
物工程（上海）股份有限公司测序。
根据上海生工技术公司发回的片段序列，登录
ＮＣＢＩ进行ＢＬＡＳＴ比对，从 ＧｅｎＢａｎｋ中下载同源
性较高菌株的１６ＳｒＤＮＡ序列，利用 ＭＥＧＡ　５．０建
立拮抗菌株的系统发育树，进行基于１６ＳｒＤＮＡ的
序列同源性分析。
２　结果分析
２．１　病原鉴定
２．１．１　病害症状
南方红豆杉根腐病危害面积大，病症严重，且潜
伏周期较长，一旦发现病害便是大面积植株已受到
伤害，发病率达到８０％，这给防治工作带来很大困
难。采样地点发病植株多是１０ｃｍ左右的栽培苗，
受害面积大，给当地的生产者带来很大的经济损失。
病株发病时根部受病菌侵染初呈褐斑，后皮层腐烂
（干腐）变黑，发霉，木质部变色，尤其是主根皮层腐
烂水渍状，后呈红褐色，病株叶片变褐由下往上，由
内向外，严重时枝叶萎蔫失水，最后导致全株死亡。
２．１．２　病原菌的分离和致病性测定
采用常规组织分离法［９］，从发病的植株根部分
离得到７株病原菌菌株，纯化后培养比较，发现各菌
株形态特征一致，为同一种真菌。分离菌株经伤口
接种法接种于健康南方红豆杉植株根部后，２０ｄ后
发病。试验结果显示发病症状与初始感染南方红豆
杉根腐病症状一致，发病率达到１００％，对照组没有
症状出现，将接种发病的南方红豆杉腐根进行再次
分离，分离物与第１次得到的分离物菌落形态一致，
产生的孢子也与第１次分离的孢子形态一致。
２．１．３　病原菌形态特征
病原菌在ＰＤＡ平板上，于２５℃培养箱中培养，
菌落平均生长速率为１．２１ｃｍ／ｄ，其中在培养第３
天到第４天增长速率最大。５ｄ后，菌落直径约为
６．０ｃｍ，菌落圆形，气生菌丝茂盛，致密，为白色绒毛
状；菌落边缘菌丝呈放射状，菌落背面中央淡紫色，
边缘乳白色（图１）。镜检发现病原菌菌丝透明，产
孢细胞为瓶状，共产生大小两种分生孢子，营养条件
不佳时产生厚垣孢子。小型分生孢子（图２）居多，
卵形、肾形，无色无隔，假头状聚生，大小为（４．１～
１４．４）μｍ×（２．４～３．９）μｍ；大型分生孢子（图２）镰刀
形，两端渐均匀变细，略弯曲，足孢显著，１～３个隔，大
·２６·
４１卷第６期 谯天敏等：南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定
小为（１４．２～２１．５３）μｍ×（２．０～３．９）μｍ，平均１７．１６μｍ
×２．６μｍ；厚垣孢子球形或卵形，间生或顶生。根
据以上形态特征以及田间症状，依据Ｂｏｏｔｈ镰刀菌
分类标准［１２］，并参考《真菌鉴定手册》［１３］，初步鉴定
该病原菌为尖孢镰刀菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）。
图１　病原菌菌落正面（ａ）与反面（ｂ）图
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｆｒｏｎｔ（ａ）ａｎｄ　ｂａｃｋ（ｂ）ｏｆ　ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ
２．１．４　病原菌ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列分析
采用真菌ＩＴＳ１／ＩＴＳ４通用引物对其进行ＰＣＲ
扩增，得到一条大小约５００ｂｐ明亮清晰的片段。测序
结果显示，该序列长度为５２０ｂｐ，将该序列与 Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ中的核酸序列进行同源性比对，发现该病原菌菌
株的ＩＴＳ序列与尖孢镰刀菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）（登录号：
ＥＦ６１１０８８）的ＩＴＳ序列同源性达到了１００％。选取
ＮＣＢＩ登录的尖孢镰刀菌及相近属ｒＤＮＡ－ＩＴＳ序列，
进一步用软件ＤＮＡＭＡＮ和 ＭＥＧＡ５．０进行多重比
对，并采用ＮＪ法构建系统发育树，结果见图３。
图２　病原菌的小型（ａ）和大型（ｂ）分生孢子
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｓｍａｌ （ａ）ａｎｄ　ｂｉｇ（ｂ）ｃｏｎｉｄｉａ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ
图３　基于ＩＴＳ序列分析构建的南方红豆杉根腐病病原菌系统发育树
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｃａｕｓｉｎｇ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｏｆ　Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ｖａｒ．ｍａｉｒｅｒ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
２．２　拮抗芽胞杆菌的分离筛选和鉴定
２．２．１　分离筛选结果
经涂布培养，共分离出３７株能在ＮＡ培养基上
生长良好且外表性状不同的菌株，命名为 ＹＢ１～
ＹＢ３７。经初筛，共筛选出９株对病原有拮抗效果的
菌株，分别为ＹＢ６、ＹＢ９、ＹＢ１５、ＹＢ１８、ＹＢ２０、ＹＢ２７、
ＹＢ３０、ＹＢ３６、ＹＢ３７。采用ＰＤＡ平板对峙生长法对
初筛得到的９株菌株进行反复筛选，最终筛选出３
株对南方红豆杉病原菌拮抗效果良好的菌株，分别
为ＹＢ６、ＹＢ１５和ＹＢ３７，３株拮抗菌株的抑菌率都在
３０％以上，其中ＹＢ３７拮抗效果最好，拮抗抑菌带达
到１０ｍｍ。３株拮抗菌株对南方红豆杉根腐病病原
菌的拮抗效果见表１和图４。
表１　３株拮抗菌对南方红豆杉根腐病菌的
拮抗效果（对峙培养５ｄ）１）
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎｓ（ｃｕｌｔｕｒｅ　ｆｏｒ　５ｄ）
拮抗菌株
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｓｔｒａｉｎ
抑菌带／ｍｍ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｓｉｓ　ｚｏｎｅ
抑菌率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ＹＢ６ （４．７±０．３）ｂ （３０．６±４．９）ｃ
ＹＢ１５ （４．７±０．３）ｂ （３７．７±１．８）ｂ
ＹＢ３７ （１０．２±０．８）ａ （４８．２±３．１）ａ
　１）同一列中不同小写字母表明差异显著，Ｐ＝０．０５。
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｏｗｅｒｃａｓｅ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　Ｐ＝０．０５．
·３６·
２０１５
图４　３株拮抗菌与病原菌对峙培养５ｄ的拮抗效果图
Ｆｉｇ．４　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｓｔｒａｉｎｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｆｏｒ　５ｄａｙｓ
２．２．２　拮抗菌株的鉴定
２．２．２．１　形态特征和生理生化特征
拮抗菌株接种于ＮＡ培养基培养２４ｈ后，挑取
菌体革兰氏染色，电子显微镜下观察形态，４８ｈ后观
察菌落特征，结果见表２。根据表中描述，ＹＢ６、
ＹＢ１５、ＹＢ３７分别与蜡样芽胞杆菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、解淀
粉芽胞杆菌（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、多黏类芽胞杆
菌（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）形态基本一致。
表２　３株拮抗菌株的菌落形态及特征
Ｔａｂｌｅ　２　Ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｙ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ
菌株
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｔｒａｉｎ
菌落形状
Ｃｏｌｏｎｙ
ｓｈａｐｅ
菌落边缘
Ｃｏｌｏｎｙ
ｅｄｇｅ
菌落颜色
Ｃｏｌｏｎｙ　ｃｏｌｏｒ
菌落表面
Ｃｏｌｏｎｙ　ｓｕｒｆａｃｅ
电镜特征
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ
ＹＢ６ 圆形 较整齐 初为乳白色后变为淡黄色 表面湿润，光滑无凸起，不透明，似蜡状 菌体杆状，长短不一，芽胞呈卵圆形
ＹＢ１５ 圆形 不整齐 白色 表面光滑干燥，无凸起，不透明 菌体长杆状，芽胞呈椭圆形
ＹＢ３７ 圆形 较整齐 白色 表明湿润，稍凸起，呈透明黏质状 菌体杆状，芽胞呈近椭圆形
　　生理生化试验结果见表３。结果表明，ＹＢ６、
ＹＢ１５和ＹＢ３７分别与蜡样芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆
菌和多黏类芽胞杆菌生理生化特征基本一致。
表３　３株拮抗菌株的生理生化特性１）
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ
特征
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ＹＢ６ ＹＢ１５ ＹＢ３７
革兰氏染色　Ｇｒａｍ　ｓｔａｉｎｉｎｇ ＋ ＋ ＋
芽胞染色　Ｓｐｏｒｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ ＋ ＋ ＋
氧化酶　Ｏｘｉｄａｓｅ ＋ － －
接触酶　Ｃａｔａｌａｓｅ ＋ ＋ ＋
Ｖ－Ｐ测定　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｖ－Ｐ ＋ ＋ ＋
明胶液化　Ｇｅｌａｔｉｎ　ｌｉｑｕｅｆａｃｔｉｏｎ ＋ ＋ ＋
甲基红反应　Ｍｅｔｈｙｌ　ｒｅｄ　ｒｅａｃｔｉｏｎ － － －
厌氧生长　Ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｇｒｏｗｔｈ ＋ － ＋
硝酸盐还原　Ｎｉｔｒａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ＋ ＋ ＋
产硫化氢　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ｓｕｌｆｉｄｅ ＋ － ＋
柠檬酸盐　Ｃｉｔｒａｔｅ ＋ ＋ －
淀粉水解　Ｓｔａｒｃｈ　ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ＋ ＋ ＋
葡萄糖　Ｇｌｕｃｏｓｅ ＋ ＋ ＋
木糖　Ｘｙｌｏｓｅ － － ＋
甘露醇　Ｍａｎｎｉｔｏｌ － ＋ ＋
果糖　Ｆｒｕｃｔｏｓｅ － ＋ ＋
蔗糖　Ｓｕｃｒｏｓｅ － ＋ ＋
２％ＮａＣｌ ＋ ＋ ＋
５％ＮａＣｌ ＋ ＋ －
７％ＮａＣｌ ＋ ＋ －
　１）“＋”表示阳性反应；“－”表示阴性反应。
“＋”：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ；“－”：Ｎｅｇａｔｉｖｅ．
２．２．２．２　１６ＳｒＤＮＡ同源性分析结果
采用细菌通用引物２７Ｆ／１４９２Ｒ对拮抗菌ＹＢ６、
ＹＢ１５、ＹＢ３７的１６ＳｒＤＮＡ进行基因ＰＣＲ扩增，分
别得到大小约１　５００ｂｐ片段，产物的测序结果表明
ＹＢ６、ＹＢ１５、ＹＢ３７扩增片段大小分别为１　２２１、
１　２２２、１　２４３ｂｐ（图５）。
图５　３株拮抗菌的电泳图像
Ｆｉｇ．５　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ
将测序结果在ＮＣＢＩ数据库中与已知序列进行
ＢＬＡＳＴ比对，结果显示，ＹＢ６、ＹＢ１５、ＹＢ３７序列长度分别
·４６·
４１卷第６期 谯天敏等：南方红豆杉根腐病病原及其拮抗芽胞杆菌的鉴定
为１　２２１、１　２２２、１　２４３ｂｐ。ＹＢ６与蜡样芽胞杆菌（登录号：
ＧＱ３４４８０５．１）的１６ＳｒＤＮＡ同源性达到了１００％，ＹＢ１５与
解淀粉芽胞杆菌（登录号：ＪＮ７００１４７．１）的１６ＳｒＤＮＡ同源
性达到了９９％，ＹＢ３７与多黏类芽胞杆菌（登录号：
ＪＱ２８３９７４．１）的１６ＳｒＤＮＡ同源性达到了９９％。选取ＮＣ－
ＢＩ登录的芽胞杆菌或类芽胞杆菌及相近属１６ＳｒＤＮＡ序
列，进一步用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ５．０并采用ＮＪ法构建
系统发育树。构建系统发育树结果如下（图６）：
图６　３株拮抗菌株的系统发育树
Ｆｉｇ．６　Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ
　　由图可知，ＹＢ６和 ＹＢ１５属芽胞杆菌属，ＹＢ３７
属类芽胞杆菌属，结合形态特征和生理生化特征，最
终鉴定ＹＢ６、ＹＢ１５、ＹＢ３７分别为蜡样芽胞杆菌（Ｂ．
ｃｅｒｅｕｓ）、解淀粉芽胞杆菌（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）和
多黏类芽胞杆菌（Ｐ．ｐｏｌｙｍｙｘａ）。
３　讨论
作者从雅安市天赐苗木有限公司洪雅县生产基
地采集的具有南方红豆杉根腐病典型症状的新鲜病
株上分离得到一株病原菌菌株。根据形态学、致病
性测定结果和分子生物学序列分析结合田间发病症
状，最终鉴定该病原菌为尖孢镰刀菌（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏ－
ｒｕｍ）。尖孢镰刀菌是一种土壤习居菌，为一类常见
的土传真菌。此前有关尖孢镰刀菌引起植物根腐病
害已有不少报道，如周洪友等发现一株尖孢镰刀菌
黄芪专化型（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ａｓｔｒａｇａｌｉ）侵染沙
打旺导致其根腐［２０］；黄芳等在西葫芦根腐病的病原
鉴定中确定尖孢镰刀菌为病原菌［２１］。尖孢镰刀菌
引起南方红豆杉根腐现象国内暂未见详细报道。
南方红豆杉根腐病潜伏期长、破坏性大且范围
广，这给该病的防治带来了一定困难。传统的化学
防治对病害有一定的防治效果，但一些常用的土壤
消毒剂对人、畜和大气臭氧层的危害很大，目前已基
本禁用［２２］。当前，生产中推行的治理方法是用微生
物菌剂（肥）来防治土传病害［２３－２５］。芽胞杆菌是一类
抗逆能力强，繁殖速度快，营养要求简单，易定殖在
·５６·
２０１５
植物表面的生防细菌，近年来正逐渐成为世界生防
菌的研究重点。本研究不仅鉴定了该病病原，且针
对尖孢镰刀菌引起的南方红豆杉根腐病筛选出３株
拮抗效果良好的拮抗芽胞杆菌。经鉴定，３株芽胞
杆菌分别为蜡样芽胞杆菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、解淀粉芽胞
杆菌（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）和多黏类芽胞杆菌（Ｐ．
ｐｏｌｙｍｙｘａ），其中多黏类芽胞杆菌拮抗效果最好，拮
抗带达到１０ｍｍ，具有进一步开发利用的潜力，这为
该病的防治工作进一步奠定了坚实的基础。
本研究对南方红豆杉根腐病首次进行病原鉴
定，且筛选出３株对病原菌拮抗作用明显的芽胞杆
菌，为今后防治红豆杉根腐病提供了一定的理论依
据。但本文只是针对洪雅县某生产基地的南方红豆
杉根腐病进行了病原分离鉴定和拮抗菌的筛选，其
他地区的发生情况和病原菌的株系还有待进一步研
究；镰刀菌的寄主范围十分广泛，各种寄主分离菌系
的致病性和生理性状不尽相同，我国主要作物上的
其他镰刀菌能否侵染红豆杉及其致病性的强弱还需
进一步探讨，这对于人工种植红豆杉和采取农业措
施防治红豆杉根腐病将具有指导意义。
参考文献
［１］　吕志鹏．甘肃南部红豆杉栽培技术与病虫害防治［Ｊ］．北京农
业，２０１１（５）：１５２－１５３．
［２］　范晓龙，朱建华，周旭，等．南方红豆杉炭疽病病原鉴定及其生
物学特性［Ｊ］．福建林学院学报，２００６，２６（２）：１１７－１２２．
［３］　李湘萍．红豆杉属植物的地理分布与应用前景［Ｊ］．植物杂志，
１９９４（４）：２０－２１．
［４］　李金平．南方红豆杉生态特性及栽培技术［Ｊ］．中南林业调查规
划，２００２，２１（２）：６１－６２．
［５］　Ｓｕｔｔｏｎ　Ｂ　Ｃ．Ｔｈｅ　Ｃｏｅｌｏｍｙｃｅｔｅｓ：ｆｕｎｇｉ　ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ　ｗｉｔｈ　ｐｙｃｎｉｄｉａ，
ａｃｅｒｖｕｌｉ　ａｎｄ　ｓｔｒｏｍａｔａ［Ｍ］．Ｋｅｗ：Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ　Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，１９８０：５２５－５２６．
［６］　张艳秋，刘伟，胡长效．草莓根腐病的发生规律与综合防治［Ｊ］．
植保技术与推广，２００３（１）：１４－１６．
［７］　彭好文，黎起秦，林纬．生物防治研究及其应用概况［Ｊ］．广西农
业生物科学，２００４，２３（２）：１７０－１７４．
［８］　王振军，刘玉霞，刘新涛，等．用１６ＳｒＤＮＡ序列分析方法鉴定４
个拮抗细菌［Ｊ］．河南农业科学，２００６（５）：５９－６１．
［９］　方中达．植病研究方法［Ｍ］．北京：中国农业出版社，１９９８：
１１２－１３４．
［１０］高同春，叶钟音，王梅，等．水稻早育秧苗立枯病致病镰刀菌
分离、鉴定及致病性测定［Ｊ］．中国水稻科学，２００１，１５（４）：
３２０－３２２．
［１１］魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９７９．
［１２］林剑伟，阙友雄，陈天生，等．一株甘蔗黑穗病菌的分离与系统
发育分析［Ｊ］．中国农学通报，２００７（５）：２９３－２９７．
［１３］胡长志，孙晓棠，谢克强，等．白莲腐败病病原菌的分离鉴定
［Ｊ］．长江蔬菜，２０１３（１８）：９２－９４．
［１４］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［Ｍ］．北京：高等教育出版
社，１９９９．
［１５］布坎南Ｒ　Ｅ，吉本斯 Ｎ　Ｅ．伯杰细菌鉴定手册：中文版（８版）
［Ｍ］．中国科学院微生物所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组，译．北
京：科学出版社，１９８４．
［１６］东秀珠，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册［Ｍ］．北京：科学出版
社，２００１．
［１７］Ｇｏｒｄｏｎ　Ｒ　Ｅ，Ｈａｙｎｅｓ　Ｗ　Ｓ，Ｐａｎｇ　Ｃ　Ｈ　Ｎ．芽孢杆菌属［Ｍ］．蔡妙
英，刘聿太，译．北京：中国农业出版社，１９８３．
［１８］王大耜．细菌分类基础［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７７：１０２－１５２．
［１９］杜敏博．梨黑星病拮抗菌ＦＪ１的筛选及拮抗机理研究［Ｄ］．西
安：西北大学，２０１２．
［２０］周洪友，杨合同，唐文华．沙打旺根腐病发生及病原菌鉴定［Ｊ］．
草地学报，２００４，１２（４）：２８５－２８８，２９７．
［２１］黄芳，王建明，徐玉梅．等．西葫芦根腐病的病原鉴定［Ｊ］．山西
农业科学，２００７，３５（１２）：２８－３０．
［２２］王树雪，魏艳敏，尚巧霞，等．三株拮抗细菌的鉴定及抑菌作用
研究［Ｊ］．中国生物防治学报，２０１３，２９（４）：６４７－６５４．
［２３］胡洪涛，王开梅，李芒．几种枯草芽孢杆菌发酵液防治草莓病害
的药效试验［Ｊ］．湖北农业科学，２００２（２）：５２．
［２４］徐淑华，蒋继志，姚克文．两株拮抗细菌对草莓根腐病菌的抑制
作用［Ｊ］．河北农业大学学报，２００５，２８（３）：８１－８３，９７．
［２５］赵秀娟，徐文桥，张凤巧．土壤拮抗微生物对几种草莓病原菌的
拮抗作用测试［Ｊ］．中国农业科技导报，２００７，９（２）：７７－８１．
（责任编辑：田　喆）
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