全 文 ：青风藤醇提液对关节炎大鼠关节骨破坏的影响*
张梦颖1，葛卫红2，姚瑶2
(1．南京中医药大学中西医结合鼓楼临床医学院药剂科，210008;2． 南京大学医学院附属鼓楼医院药剂科，
210008)
摘 要 目的 观察青风藤醇提液对胶原诱导关节炎(CIA)大鼠关节破坏的影响，初步研究其作用机制。方法
雌性 SD大鼠 32 只，随机分为对照组、模型组和青风藤治疗组，模型组和青风藤治疗组制备 CIA 模型。青风藤治疗组灌
胃青风藤醇提液，模型组与对照组灌胃等量 0． 9%氯化钠溶液。每 3 d 行关节评分 1 次，ELISA 法检测血清白细胞介素-
17(IL-17)、核因子 κB(NF-κB)配位体受体活化剂(RANKL)、可溶性蛋白骨保护素(OPG) ，观察大鼠后足病理组织切片。
结果 关节评分模型组显著高于青风藤治疗组(P＜0． 01) ;3 组大鼠 IL-17 表达量均差异有统计学意义(P＜0． 05) ，IL-17
水平青风藤治疗组较模型组低(P＜0． 05) ，较对照组高(P＜0． 01)。3 组大鼠血清 RANKL、OPG水平及 RANKL /OPG值均
差异有统计学意义(P＜0． 01) ，大鼠血清 RANKL水平青风藤治疗组较模型组低(P＜0． 05) ，OPG水平青风藤治疗组较模
型组高(P＜0． 05)。RANKL /OPG青风藤治疗组低于模型组，高于对照组;病理结果显示，大鼠关节骨破坏程度青风藤治
疗组明显低于模型组。结论 青风藤醇提取液能降低 CIA大鼠血清 IL-17、RANKL水平，升高 OPG 水平，降低 RANKL /
OPG，抑制破骨细胞生成，发挥抑制关节骨破坏作用。
关键词 青风藤提取物;类风湿关节炎;骨破坏;核因子 κB配位体受体活化剂;可溶性蛋白骨保护素;白细胞介素-17
中图分类号 R286;R965 文献标识码 A 文章编号 1004－0781(2013)05－0565－04
The Effect of Alcohol Extracts from Caulis Sinomenii on Articular Bone Destruction of
Rats with Arthritis
ZHANG Meng-ying1，GE Wei-hong2，YAO Yao2(1． Department of Pharmacy，Drum Tower Medical College of
Chinese and Western Integrative Medicine，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210008，China;2．
Department of Pharmacy ，the Affiliated Drum Tower Hospital to Nanjing University Medical School，Nanjing
210008，China)
ABSTRACT Objective To investigate the effect of alcohol extracts from Caulis sinomenii on articular bone destruction of
rats with collagen-induced arthritis(CIA) ，and preliminarily explore its mechanism of action． Methods The total of 32 female
SD rats were randomly divided into the control and model groups，and the latter and the latter was randomly devided into model
control and Caulis sinomenii groups． The Caulis sinomenii group was treated with alcohol extracts from Caulis sinomenii，while the
model and control groups were treated with equal volume of saline solution． The feat of the articular score was observed every three
days;the serum levels of IL-17，RANKL and OPG were test by ELISA． The dead rats＇ feet were taken for histopathologic slice and
HE staining to detect the bone destruction． Results The articular score of model group was significantly higher than that of the
Caulis sinomenii group (P＜0． 01) ;IL-17 level of three groups showed a statisticant difference (P＜0． 05) ，IL-17 of the Caulis
sinomenii group was remarkablly lower than that of the model group (P＜0． 05) ，but higher than that of the control group(P
＜0． 01)． The levels of RANKL，OPG and RANKL /OPG ratio of the three groups also showed obviously difference(P＜0． 01)． The
level of RANKL of Caulis sinomenii group was lower than that of the model group(P＜0． 05)and the OPG significantly higher than
that of the model group (P＜0． 05)． The RANKL /OPG ratio of the Caulis sinomenii group was fewer than that of the model group
，but more than that of the model group;the HE staining results showed that the extent of article bone destruction of Caulis
sinomenii group was less severe than that of the model group． Conclusion Caulis sinomenii can inhibit articular bone
destruction CIA rats＇ by reducing the peripheral by reducing the peripheral serum of RANKL and IL-17，elevating OPG level，
down-regulating RANKL /OPG ratio and thus inhibiting intra-articular osteoclastogenesis．
KEY WORDS Alcohol extrots from Caulis sinomenii;Rheumatoid arthritis;Articular bone destruction;RANKL;OPG;IL-
17
青风藤是防己科植物青藤及毛青藤的干燥藤茎［1］，
具有祛风湿、通经络等作用，临床主要用于治疗类风湿
关节炎(rheumatoid arthritis，RA)、红斑狼疮等免疫系统
疾病。RA是由多种不同疾病亚型组成的自身性免疫系
统疾病，这些不同的疾病亚型通过炎症反应相级联，共
同导致持续性滑膜炎和伴随的关节软骨以及软骨下骨
破坏［2］。近年来对青风藤的研究主要集中在其抗炎及
免疫抑制作用方面，而青风藤对 RA关节骨破坏的作用
却鲜见报道。破骨细胞是产生骨破坏的主要细胞，而调
节 RA破骨细胞生成中起着关键性作用的是核因子 κB
(nuclear factor，NF-κB)配位体受体活化剂(receptor or
activator of NF-KB ligand，RANKL)和可溶性蛋白骨保护
·565·医药导报 2013 年 5 月第 32 卷第 5 期
素(osteoprotegerin，OPG)通路［3］。白细胞介素 17
(interleukin-17，IL-17)因 RA炎症和骨破坏进程中起关
键作用，近些年来备受关注［4］。笔者在本实验考察青风
藤醇提液对 RA 大鼠 IL-17、RANKL 以及 OPG 的影响，
研究该药对 RA骨破坏的作用。
1 材料与方法
1． 1 实验动物 8 周龄 SPF 级健康 Sprague-Dawley
(SD)大鼠 32只，雌性，体质量 150 ～ 170 g，由南京大学
模式动物研究所提供。适应性喂养 3 d后开始实验。
1． 2 试药 青风藤干燥藤茎(产于浙江，购于南京药业
股份有限公司，批号:101028，经南京中医药大学吴启南
教授鉴定为防己科植物青风藤) ，天然牛Ⅱ型胶原蛋白
(购自美国 Sigma 公司，批号:C-7806) ，完全弗氏佐剂
(购自美国 Sigma 公司，批号:C-9007) ，IL-17 酶联免疫
吸附测定试剂盒(批号:10090913)、RANKL酶联免疫吸
附测定试剂盒(批号:10090909)、OPG酶联免疫吸附测
定试剂盒(批号:10090913) ，均购于美国 Sigma 公司。
所有化学试剂均为色谱纯，实验用水为超纯水。
1． 3 仪器 ELx800 吸收光酶标仪，美国 BioTek 公司
产品;AXIOVERT 40CFL 荧光显微镜，德国 Carl Zeiss
公司产品。
1． 4 试药的制备 青风藤粉碎，12 倍药量 95%乙醇
回流提取 2 次，每次 2 h，合并浓缩液，回收膏状溶剂，
每毫升相当于生药 50 g，加入纯化水稀释，制
成 2 g· mL－1 青风藤醇提取液。
1． 5 模型的制备 大鼠测体质量后，按简化分层随机
法分为对照组 10 只和造模组。将溶于醋酸的Ⅱ型胶
原蛋白先于 4 ℃低温保存过夜，第 2 天与弗氏完全佐
剂等体积乳化。乳化成功后，模型组大鼠背部及尾部
行多点皮下注射，每只 0． 15 mL，诱导 RA 模型，7 d 后
进行第二次免疫注射，方法与首次相同，最终成模 17
只。对照组大鼠注射等量 0． 9%氯化钠溶液。
1． 6 关节评价 关节肿胀评分标准:关节无肿胀，0
分;趾关节微肿，1 分;趾关节及足趾肿胀，2 分;踝关节
以下足爪肿胀，3 分;全部足爪肿胀(包括踝关节) ，4
分。大鼠最终分数为四肢关节肿胀分数总和，最高 16
分。首次免疫注射后每 3 ～ 4 d称体质量 1 次，每次固
收稿日期 2012－07－19 修回日期 2012－08－25
基金项目 * 江苏省人事厅六大人才高峰资助项目
(2010118) ;南京市医药卫生科研课题(YKK11101)
作者简介 张梦颖(1988－) ，女，辽宁新民人，在读硕士，主
要从事临床药理学研究。E-mail:glnzy6047@ 126． com。
通讯作者 葛卫红，电话:025 －83304616 －66660，E-mail:
6221230@ sina． com。
定两名实验员记录关节肿胀评分。
1． 7 分组与给药 将造模成功大鼠随机分为模型组
(n=8)和青风藤治疗组(n = 9)。造模成功后第 3 周
开始 给 药，青 风 藤 治 疗 组 灌 胃 青 风 藤 醇 提
液 10 mg·kg－1·d－1;模型组与对照组灌胃等量 0． 9%
氯化钠溶液，持续 36 d。
1． 8 指标的测定 第 58 天将全部大鼠经眼眶取血后
处死，使 用 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 (enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA)法试剂盒测定血清 IL-17、
RANKL及 OPG水平，按说明操作。
1． 9 组织病理学检测 从新鲜大鼠尸体中取出关节
滑膜，投入预先配制好的固定液(10%甲醛)中，经脱
水、浸蜡包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、脱水透明封固后
制成厚 3 μm标本切片。
1． 10 统计学方法 实验结果以均数±标准差(x±s)
表示。用 SPSS17． 0 统计软件分别对对照组、模型组、
青风藤治疗组的 IL-17RANKL、OPG 进行单因素方差
分析，P＜0． 05 表示差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 大鼠关节评分 见图 1。青风藤治疗组与模型
组大鼠关节评分均值差异有统计学意义(P＜0． 01) ，造
模第 21 天大鼠足肿胀达第一次高峰，之后两组大鼠均
有所消肿。模型组大鼠约在第 35 天足肿胀程度达最
高峰，之后肿胀程度居高不下;青风藤治疗组大鼠肿胀
程度呈下降趋势;对照组未见发病。第 58 天模型组大
鼠关节评分 7． 5 分，大鼠消瘦且皆蜷缩于角落，畏寒、
足肿胀严重，见图 2B;而青风藤治疗组评分 3 分，大鼠
状态较模型组好，肉眼可见轻度足肿胀，见图 2A;两组
大鼠肿胀评分差异有统计学意义(P＜0． 05)。
图 1 2 组大鼠不同时间足肿胀评分
Fig． 1 The articular swelling scores of 2 groups of rats at
different time points
2． 2 大鼠血清 IL-17、RANKL、OPG 表达情况 青风
·665· Herald of Medicine Vol. 32 No. 5 May 2013
藤治疗组、模型组、对照组大鼠 IL-17 表达量均差异有
统计学意义，青风藤治疗组 IL-17 水平较模型组低(P＜
0． 05) ，较对照组高(P ＜ 0． 01)。3 组大鼠血清
RANKL、OPG水平及 RANKL /OPG值均差异有统计学
意义，其中青风藤治疗组大鼠血清 RANKL 水平较模
型组低(P＜0． 05) ，OPG 水平较模型组高(P＜0． 05)。
青风藤治疗组 RANKL /OPG低于模型组(P＜0． 01) ，高
于对照组(P＜0． 05) ，见表 1。
2． 3 病理学检查 见图 3。对照组大鼠关节未见炎
症细胞浸润和血管翳生成，软骨及软骨下组织未见多
核巨噬破骨细胞生成(图 3A) ;模型组大鼠关节软骨
侵蚀严重，关节滑液腔明显狭窄，有血管翳生成(图
3B) ，软骨及软骨下骨聚集大量深色多核破骨细胞，骨
质破坏严重(图 3E) ;青风藤治疗组关节滑液腔关节软
骨边缘清晰，接近对照组(图 3C) ;软骨及软骨下骨处
多核破骨细胞明显少于模型组，且未出现明显骨质破
坏(图 3F)。提示青风藤提取物能够减少破骨细胞生
成，抑制软骨侵蚀及软骨下骨质破坏。
表 1 3 组大鼠血清 IL-17、RANKL与 OPG表达情况
Tab． 1 Serum level of IL-17 RANKL and OPG in 3 groups of rats pg· mL－1，x±s
组别 大鼠 /只 IL-17 RANKL OPG RANKL /OPG
青风藤治疗组 9 412． 28±95． 22* 1* 2 167． 44±14． 69* 1* 2 51． 56±7． 22* 1* 2 3． 41±0． 72* 1* 3
模型组 8 574． 53±72． 38 203． 49±16． 15 38． 14±8． 03 4． 65±0． 17
对照组 10 221． 06±82． 76* 3 126． 77±37． 85* 3 67． 21±5． 59* 3 1． 87±0． 44* 3
与对照组比较，* 1P＜0． 05;与模型组比较，* 2P＜0． 05，* 3P＜0． 01
Compared with control group，* 1P＜0． 05;compared with model group，* 2P＜0． 05，* 3P＜0． 01
图 2 第 58 天 3 组大鼠关节肿胀情况
A．青风藤治疗组;B．模型组;C．对照组
Fig． 2 The articular swelling of 3 groups of rats on the 58th day
A． Caulis sinomenii group;B． model group;C． control group
图 3 3 组大鼠关节苏木精-伊红染色
A．对照组(×10) ;B．模型组(×10) ;C．青风藤治疗组(×10) ;D．对照组(×20) ;E．模型组(×20) ;F．青风藤治疗组(×20)
Fig． 3 HE staining of rats’ankles in 3 groups
A． control group(×10) ;B． model group(×10) ;C． Caulis sinomenii group(×10) ;D． control group(×20) ;E． model group(×20) ;F．
Caulis sinomenii group(×20)
·765·医药导报 2013 年 5 月第 32 卷第 5 期
3 讨论
RA骨破坏进程中发挥关键作用的细胞是破骨细
胞(osteoclast，OC)———由单核巨噬细胞分化而成的多
核细胞。OC不存在时，炎症反应本身并不介导关节处
骨破坏;OC产生后，首先粘附骨基质蛋白，然后分泌基
质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPS) ，使关
节内微环境呈酸性，最后诱导关节处软骨及软骨下骨
破坏［5］。
RANKL是介导 OC 分化的细胞因子。RANKL 通
过与破骨前体细胞上 RANK结合促进 OC 生成［6］。而
成骨细胞产生的 OPG，作为 RANKL 的诱导受体，能够
竞争性抑制 RANKL 与破骨细胞膜上的 RANK 结合，
抑制 OC生成，防止骨破坏［7］。正常环境下，骨形成与
吸收处于平衡状态，RANKL 和 OPG 表达在骨代谢中
平衡，当 RANKL过度表达或者 OPG表达不足时，都会
引起 OC活化，导致后继骨质破坏［8］。本研究显示，青
风藤治疗组大鼠血清 RANKL水平较模型组降低，OPG
水平较模型组高，且 RANKL /OPG较模型组明显下调，
提示青风藤提取物能降低 RA 大鼠 RANKL 水平，升高
OPG水平，降低患病大鼠 RANKL /OPG，抑制 RA 大鼠
关节 OC活化，抑制骨破坏发生。
IL-17 主要由 TH17 细胞产生。TH17 是唯一一种
能在其表面表达 RANK配位体的 T 细胞亚型，尽管没
有研究表明具有 RANK配位体的 T细胞可以直接促进
OC生成，但是，IL-17 能够增强滑膜细胞产生金属蛋白
酶的能力，抑制基质综合物生成，直接活化 OC，诱导软
骨基质降解，最终导致骨破坏［9］。相关研究显示，IL-
17 还可以诱导 RANKL 表达并与其产生协同作用，促
进 OC分化，造成骨质破坏［10-11］。本实验中，青风藤治
疗组大鼠血清 IL-17 水平较模型组显著降低，提示青
风藤能够抑制 RA 大鼠产生 IL-17，抑制骨破坏进程，
进一步抑制 RANKL的表达及 OC分化。
总之，青风藤醇提取液能够降低大鼠外周血
RANKL /OPG，抑制 OC活化;在抑制 IL-17 防治骨破坏
时，间接加强对 RANKL 的抑制作用，进一步抑制 OC
分化，防止骨破坏。
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DOI 10． 3870 /yydb． 2013． 05． 004
·865· Herald of Medicine Vol. 32 No. 5 May 2013