全 文 ：福建农林大学学报(自然科学版) 第 35卷 第 5期
Jou rna l of Fujian Agriculture and Fo restry Unive rsity (Na tu ra l Science Ed ition) 2006年 9月
收稿日期:2005 - 11 - 15　　修回日期:2006 - 04 -15
基金项目:福建省教育厅资助项目(K2001059).
作者简介:李斌连(1976 -),女 ,硕士.研究方向:植物生物技术.
*通讯作者.
南方红豆杉愈伤组织诱导和继代培养体系的建立
李斌连 1, 2 , 邱　萃 1 , 刘金仙 1 , 王贵荣3 , 何水林 1*
(1.福建农林大学植物生物技术试验室 , 福建 福州 350002;2. 徐州医药高等职业技术学校 , 江苏 徐州
221116;3.中国药科大学中药学院 , 江苏 南京 210038)
摘要:以南方红豆杉为材料 ,建立了其愈伤组织诱导与保持的技术体系 ,主要为:(1)南方红豆杉侧芽是诱导愈伤组织的最
佳外植体;(2)南方红豆杉愈伤组织诱导的最佳培养基为:B5 +2. 0 m g L - 1 2, 4-D+1. 0 mg L - 1 NAA+0. 2 m g L - 1 IAA;
(3)南方红豆杉愈伤组织增殖的培养基为:B5 +4. 0 m g L- 1NAA +0. 5 mg L - 1 2, 4-D+0. 2 m g L- 1GA +500 m g L -1
AC +2000 mg L - 1LH.并在培养基中同时添加 AC、LH和 GA3 3种抗褐物质 ,取得较好的抗褐化效果.
关键词:南方红豆杉;外植体;愈伤组织诱导;褐化;继代培养
中图分类号:S791. 49 文献标识码:A 文章编号:1671-5470(2006)05-0515-04
E stablishm ent of callus induction and subculture system ofTaxus chinensis var. ma irei
LI B in-lian1, 2 , Q IU Cui1 , LIU Jin-x ian1 , WANG Gui-rong3 , HE Shui-lin1
(1. Lab of P lan t B io-techno logy, Fujian Ag ricu ltu re and Fore stry University, Fuzhou, Fujian 350002, Ch ina;2. Xuzhou Advanced
Schoo l ofM edicine Techno logy, Xuzhou, Jiangsu 221116, Ch ina;3. Co lleg e o fT raditional ChineseM edicine, Ch ina Pharm aceu tical
University, Nanjing, Jiang su 210038, China)
Abstrac t:The callus induc tion and m a in tenance system o f Taxus chinensis var.m aireiw as e stablished in the experim ent, them a in
re su lts w ere as fo llow s:(1) la te ra l buds w ere the best exp lants for the callus induc tion;(2) B5 plus 2. 0 m g L- 1 2, 4-D, 1. 0 m g
L - 1 NAA and 1. 0 m g L - 1 IAA w as the bestm edium fo r ca llus induction;(3) B′5 containing 4. 0 m g L - 1 NAA, 0. 5 m g L -1
2, 4-D, 0. 2 mg L - 1 GA 3 , 500 m g L - 1 AC and 2000 mg L - 1 LH w as the be stm edium for ca llus g row th. The b rownness o f ca l-
lu s cou ld be avo ided o r decreased to a ce rtain deg ree when AC, LH and GA3 w ere added to them edium s.
K ey words:Taxus ch inensis var. ma irei;explant;ca llus induction;brownne ss;subcu lture
红豆杉 (Taxus chinensis var. mairei)含有治癌药物紫杉醇 ,是珍贵的药用植物 ,全世界共 11种 ,从欧亚
大陆和北美的亚北极区到中美和东南亚的亚热带甚至热带地区均有分布[ 1] .
培养红豆杉细胞生产紫杉醇及其类似物是保护红豆杉资源 、扩大紫杉醇来源的一条有效途径 [ 2] .但
红豆杉属裸子植物 ,存在内生菌 ,不易获得无菌材料 ,且在组织和细胞培养中酚类物质代谢旺盛 ,褐化现象
严重 ,且组织和细胞培养条件的外植体基因型依赖较为明显 ,已成为细胞培养生产紫杉醇的技术瓶颈.需
要对愈伤组织诱导方法特别是培养基进行针对外植体基因型的优化研究.而这方面的研究在南方红豆杉
上鲜见报道.本研究利用分布于福建省的南方红豆杉为材料 ,通过正交试验优化了愈伤诱导和生长的培养
基条件 ,并针对细胞培养过程中的褐化问题进行研究 ,基本消除了褐化对愈伤和细胞生长的抑制作用 ,为
进一步建立南方红豆杉紫杉醇高产离体培养生产体系奠定了基础.
1　材料与方法
1. 1　试验材料
南方红豆杉的外植体采自本研究室田间栽培植株 ,于春季取当年生的嫩茎 、叶片 、侧芽和茎尖作为外
植体材料.
1. 2　试验方法
1. 2. 1　愈伤组织的诱导　(1)不同外植体诱导愈伤组织的比较.取红豆杉外植体 ,用洗衣粉清洗干净 ,在
DOI牶牨牥牣牨牫牫牪牫牤j牣cnki牣j牣fafu牗nat牣sci牣牘牣牪牥牥牰牣牥牭牣牥牨牭
流动的自来水下冲洗 2 h,再用体积分数为 75%乙醇浸泡 30 s,然后在质量分数为 0. 1%升汞溶液中处理
15 m in,最后用无菌水冲洗 3 - 4次.外植体为 3种类型:①长约 1 cm叶片切段 ,平放于培养基上 (B5 +1. 0
mg L -1 NAA +1. 0mg L -1 IAA+0. 5mg L -1 KT);②带叶茎段上的叶片剪去三分之二后 ,再切成 1 cm
左右 ,插入培养基 (B5 +1. 0 mg L- 1 NAA+1. 0 mg L -1 IAA +0. 5 mg L - 1 KT);③侧芽和顶端生长点去
除少数外鳞后 ,接入培养基 (B5 +1. 0 mg L - 1 NAA+1. 0 mg L- 1 IAA +0. 5 mg L - 1 KT).每种材料接种
10瓶 ,每瓶 5块外植体 ,在 25℃黑暗条件下培养. 20 d后统计各培养基中出现的愈伤组织块数 ,计算愈伤
组织的诱导率.
(2)不同激素配比对红豆杉愈伤组织诱导的影响. 按 2, 4-D(A)、NAA(B)、 IAA(C)3个考察因素 ,各
取三水平 ,据 L9(34)正交表安排试验(表 1).将愈伤组织诱导率及生长率都较高的外植体侧芽接种在附
加上述激素 (生长调节剂)、2 g L -1水解乳蛋白(LH)和 0. 5 g L -1活性炭(AC)不同配比的培养基中 ,培
养 30 d后统计诱导率 ,培养条件同上. 30 d后 ,以诱导率为指标进行分析.
　　表 1　因素水平表
　　Tab le 1　Factors and levels m g L - 1　　
水平 因素
2, 4-D(A) NAA(B) IAA(C)
1 1. 0 0. 0 0. 2
2 1. 5 1. 0 0. 5
3 2. 0 2. 0 0. 8
1. 2. 2　愈伤组织的继代增殖　由于不同的激素配比对南方红
豆杉愈伤组织的生长和紫杉醇的积累都有影响 ,本试验以侧芽
和茎段来源的愈伤组织作为试验材料 ,在添加不同配比的激素
和有机添加物的 B5 、B′5(去掉 Cu2+)和 1 /2B5 3种培养基中进
行培养.从诱导的愈伤组织中筛选出疏松 、浅绿色或白色的愈伤
组织在含有不同激素种类和浓度及有机添加物的 B5培养基上继
代培养 ,验证激素对愈伤组织增殖的效应以及对褐化的影响. 25 d
继代一次 ,观察褐化程度并计算生长率.
2　结果与分析
2. 1　不同外植体对红豆杉愈伤组织诱导的影响
　表 2　不同外植体愈伤组织诱导率
　Tab le 2　Ratio of cal lus indu ction from d ifferen t explan ts ofT. chinensis
外植体 接种块数 愈伤组织块数 愈伤组织诱导率 /%
侧芽 50 43 86
叶片 50 43 86
茎段 50 40 80
　　从表 2可见 ,在 B5 +1. 0 mg L -1 NAA +
1. 0 mg L -1 IAA +0. 5 mg L -1 KT培养基上 ,
不同的外植体对愈伤组织的诱导在数量上差别
不大 ,但试验发现侧芽的污染率很低 ,几乎无污
染 ,而叶片和茎段虽然是春季刚抽出来的 ,污染
率仍在 85%左右. 另外 ,从芽诱导出来的愈伤
组织颜色较浅 ,出愈时间较早 ,而从茎段和叶片诱导出来的愈伤组织颜色浓绿 ,以后继代的过程中易发生
褐化. 综合考虑上述因素 ,红豆杉侧芽是诱导愈伤组织的最佳外植体(图 1).
A.叶片诱导;B.芽诱导;C.茎段诱导.
图 1　不同外植体诱导形成愈伤组织
Fig. 1　The callu s induction from di fferen t exp lan ts of T. ch inensis
2. 2　不同激素配比对红豆杉愈伤组织诱导的影响
红豆杉侧芽接种在附加不同激素的 9种 B5培养基上 , 15 d后均出现脱分化迹象;20 d后陆续产生愈
伤组织 , 30 d后达到高峰(表 3、4).
　　从表 3可见 ,最佳愈伤组织诱导培养基为 A3 B2C1 ,即 B5 +2. 0 mg L -1 2, 4-D+1. 0 mg L -1 NAA +0. 2
mg L - 1 IAA.根据表 3的极差 R值 , 2, 4-D对南方红豆杉愈伤组织诱导的影响最大 ,其次是 NAA和 IAA.
516 福建农林大学学报(自然科学版) 第 35卷　
　　方差分析(表 4)进一步显示 , 2, 4-D、NAA浓度对生长率都有显著影响 ,以 2, 4-D的影响最为显著 ,附
加适量 NAA ,效果更佳.而 IAA浓度对生长率没有显著影响 ,但少量 IAA能促进细胞分裂生长 , 0. 2 mg L -1
　表 3　正交试验设计及结果 1)
　Tab le 3　O rth ogonal test design and resu lts
编号 A B C D 愈伤组织诱导率 /%
1 1. 0 0. 0 0. 2 1 48
2 1. 0 1. 0 0. 5 2 74
3 1. 0 2. 0 0. 8 3 44
4 1. 5 0. 0 0. 5 3 69
5 1. 5 1. 0 0. 8 1 70
6 1. 5 2. 0 0. 2 2 80
7 2. 0 0. 0 0. 8 2 65
8 2. 0 1. 0 0. 2 3 90
9 2. 0 2. 0 0. 5 1 70
K 1 166 182 218 188
K
2 219 234 213 219
K 3 225 194 179 203
R 59 52 39 31
　　 1)A. 2, 4-D;B. NAA;C. IAA;D.对照;K 1 - K 3分别表示该因素
　第 1、第 2、第 3水平所在行的诱导率之和;R.极差.
IAA可以取代细胞分裂素 ,缓解褐化的发生. 由于 6-
BA、KT以及腺素等含嘌呤环的物质 ,对褐化有促进作
用.因此 ,试验结果正交分析表明 ,南方红豆杉侧芽诱
导愈伤组织的最佳条件为:B5 +2. 0 mg L - 1 2, 4-D+
1. 0mg L- 1 NAA +0. 2mg L -1 IAA +2 g L - 1 LH +
0. 5 g L - 1 AC.
2. 3　红豆杉愈伤组织的继代增殖
从表 5可见 ,红豆杉愈伤组织继代培养所用的生
长素应以 NAA为主 ,而愈伤组织诱导时以 2 , 4-D为
主.试验 3、4与 5、6对比表明 , GA3对红豆杉组织的褐
化有缓解作用 , BA3则有促进作用. 试验 6 - 8号的对
比表明 , LH不仅有利于愈伤组织的生长 ,而且与活性
碳一起使用可以减轻褐化程度. 本试验将 AC、LH和
GA 3 3种抗褐物质一起使用 ,基本遏制了褐化的发生 ,
取得了很好的效果. 试验 1、4、6的比较说明 ,去掉
Cu
2 +的 B′5基本培养基比 1 /2 B5 、B5更适合于南方红
豆杉的愈伤组织继代 ,而 1 /2 B5中 Cu2+是 B5的一半 ,所以效果比 B5又好一些 ,这与夏铭等 [ 3]的报道一致.
表 4　方差分析表 1)
Tab le 4　Varian ce ana lysis
方差来源　　 离均差平方和 自由度 方差 F值 显著性
a1 580. 14 1 580. 14 11. 28 *
a2 122. 72 1 122. 72 2. 37
b2 470. 22 1 470. 22 9. 15 *
c1 253. 5 1 253. 50 4. 93
SSe 308. 47 6 51. 41
　　1)F 0. 05(1, 6)=5. 99;F 0. 01(1, 6)=13. 75.
表 5　南方红豆杉愈伤组织继代培养基的筛选
Tab le 5　S creen ing ofm edium s for sub cu ltu re ofT. chinen sis callus
编号 继代培养基　　　　　　　 生长率 /% 褐化程度　　
1 B5 +4. 0 m g L- 1 NAA+0. 5m g L - 1 2, 4-D +5O0 m g L- 1 AC+2000m g L - 1 LH 6. 17±0. 47 褐化严重
2 B5 +0. 5 m g L- 1 NAA+4. 0m g L - 1 2, 4-D +500m g L- 1 AC+2000 m g L- 1 LH 4. 44±0. 09 褐化严重
3 B′5 +4. 0 mg L- 1 NAA +0. 5 m g L- 1 2, 4-D+0. 2m g L - 1 GA+500m g L - 1 AC+
2000m g L - 1 LH 9. 80±0. 18 基本无褐化
4 B′5 +4. 0 mg L- 1 NAA +0. 5 m g L- 1 2, 4-D+500 m g L -1 AC+2000 mg L- 1 LH 8. 93±0. 52 轻度褐化
5 1 /2 B5 + 0. 5 m g L- 1 2, 4-D+4. 0m g L - 1 NAA +0. 5 mg L- 1 BA+500m g L - 1 AC+
2000m g L - 1 LH 6. 39±0. 32 褐化严重
6 1 /2 B5 +0. 5m g L - 1 2, 4-D +4. 0 mg L- 1 NAA +500 m g L- 1 AC+2000m g L - 1 LH 7. 04±0. 11 部分褐化
7 B5 +4. 0 m g L- 1 NAA+0. 5m g L - 1 2, 4-D +500m g L- 1 AC 4. 63±0. 05 褐化严重
8 B5 +4. 0 m g L- 1 NAA+0. 5m g L - 1 2, 4-D 3. 86±0. 02 褐化最严重
3　讨论
3. 1　外植体对诱导南方红豆杉愈伤组织的影响
红豆杉愈伤组织的诱导受外源激素和内源激素的双重调节.春天新抽出来的幼嫩材料内源激素水平
高 ,可显著提高诱导率 ,且内生真菌的污染也较少. 本试验表明 ,侧芽 、茎段和离体叶片等不同外植体对诱
导愈伤组织的效果差异不大.茎段做外植体时 ,外植体迅速膨大形成愈伤组织 ,但是把此时刚形成的愈伤
517　第 5期 李斌连等:南方红豆杉愈伤组织诱导和继代培养体系的建立
组织从茎段上剥离下来单独培养 ,则愈伤组织增殖较缓慢.若将初形成的愈伤组织连同茎段一起转入新鲜
培养基 ,愈伤组织增殖大大加快 ,直到棕色物质开始形成时再把其剥离下来单独培养. 用茎段和叶片为外
植体 ,即使是春天刚抽出的嫩枝也存在内生真菌的污染问题 ,叶片效果比茎段好一些 ,而顶芽和侧芽由于
维管系统还未发育成熟 ,不利于内生真菌的扩散 ,故可有效地克服这个问题.因此 ,春季红豆杉的侧芽为愈
伤组织诱导的最佳外植体.
3. 2　激素对南方红豆杉愈伤组织的诱导影响
本试验中附加 2. 0mg L -1 2, 4-D时 ,较易诱导出愈伤组织 , 2. 0mg L -1 NAA也有较好的诱导效果.
激素的应用效果与所使用外植体内源激素有关 [ 4] ,由于诱导和保持愈伤组织生长所需植物生长调节物质
的种类和浓度不但与外植体供体植物的种类 、外植体本身的生长发育状况或对生长调节剂的敏感性密切
相关[ 5] ,因此在采取特定外植体材料诱导愈伤组织时 ,仍需要进行激素筛选试验. 本试验筛选出的诱导愈
伤组织的最佳培养基为:B5 +2. 0mg L -1 2 , 4-D+1. 0 mg L - 1 NAA+0. 2 mg L- 1 IAA.
3. 3　南方红豆杉愈伤组织继代过程中的褐变问题
南方红豆杉愈伤组织在继代培养中 ,遇到的一个突出问题是发生褐变 ,造成培养物生长缓慢并导致死
亡.大多数研究者认为 [ 3, 6, 7] ,褐变主要是由细胞分泌的酚类化合物氧化成醌类物质 ,对细胞正常生理产生
毒害而造成.另外 ,紫杉醇是次生代谢物 ,次生代谢途径与植物防御反应的一部分途径相重叠 ,从而进一步
加重褐变的程度 [ 8] .通常情况下 ,减轻褐变的措施主要有以下几方面. (1)以具有较强分生能力的外植体
结合适当的培养基和培养条件 ,可大大减轻褐变的程度.处于旺盛生长季节 (6 - 7月 )的幼嫩茎段和侧芽
是优良的外植体 ,愈伤组织发生率高 、增殖快 、褐变程度轻.从培养条件来看 ,适宜的培养基 (B5 +4. 0 mg
L
- 1
NAA +0. 5mg L -1 2, 4-D +0. 2mg L -1 GA3 +500mg L- 1 AC +2000mg L -1 LH)对减轻褐变的伤
害很有利 ,同时初期的暗培养(2周左右 )以及较低的培养温度 ,可在一定程度上减轻褐变程度. (2)抗氧
化剂的添加可在一定程度上抑制醌类物质产生 ,达到防止褐变的目的[ 9] . 使用抗氧化剂一般只能在一定
时间内抑制褐变 ,因为一旦抗氧化剂全部被氧化后 ,褐变可能再度发生 ,所以在使用中应注意用量不能过
小 ,并应分次持续使用.据报道 [ 8] ,多种物质配合使用的抗褐化效果较好.本试验用 0. 5 g L -1 AC、0. 2 mg
L -1 GA 3和 2 g L -1 LH取得了较好的效果. (3)金属螯合剂的添加 ,也可在一定程度上缓解褐化. 多酚
氧化酶是一种含 Cu的蛋白质 ,其氧化活性依赖于 Cu的氧化还原作用. 金属螯合剂可以把 Cu2+从酶中螯
合出来 ,形成稳定的螯合物 ,使多酚氧化酶失去活性[ 10] . 同时 ,由于螯合了部分 Ca2 +、Mn2 +、Zn2+等离子 ,
使其它酶的活性受到影响 [ 8] ,从而达到减轻褐化的效果.本试验采用去掉 Cu2 +的 B′5培养基 ,发现愈伤组
织的生长并未受多大影响 ,但褐变程度明显降低.此外活性碳的使用 、继代时间的选择等都对减轻褐化也
有一定的效果.本研究发现使用质量分数为 0. 5%活性碳 ,对褐变有很好的缓解作用 ,但由于活性碳具有
吸附作用 ,培养基中的植物激素浓度应适当提高.在继代时间长短方面 ,培养初期以 2周左右继代最好 ,而
培养后期 ,褐变减轻后 ,由于红豆杉愈伤组织生长较慢 ,应延长继代时间到 30 d左右.
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120.
(责任编辑:陈幼玉 )　　
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