全 文 ：　　　　 天然产物研究与开发　 　　　　　
　　　 NAT URAL PRODUCT RESEARCH AND DEV ELOPMEN T　 Vo1. 12　 No. 4
　
　
　
　
收稿日期: 1999-10-20　　修回日期: 1999-11-23
* 国家教育部“跨世纪优秀人才培养计划”基金和天津市重点攻关项目资助 (No. 963107211)。
* This Work was Suppo rted by Trans-cen tu ry Training Programme Foundation for Talents by the State Education Commis-
sion and Key Project ( No. 963107211) by Science and Tech nology Commission of Tianjin.
* * 通讯联系人 ( Corresponder)
南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇
诱导子浓度的优化*
施中东　未作君　元英进* *
(天津大学生物化工系　天然产物生化工程所　天津　 300072)
摘　要　本文利用短期诱导实验考察了几种诱导子的最优诱导浓度。结果表明 ,在南方
红豆杉细胞培养体系中分别加入 1. 0 mmol /L硝酸铈铵、 0. 01 mmo l /L硝酸银、 0. 1
mg / L花生四烯酸、 0. 1 mg /L水杨酸以及 10. 0 mg /L甲基茉莉酮酸最有利于紫杉醇产
量的提高。
关键词　植物细胞培养 ,南方红豆杉细胞 ,紫杉醇 ,诱导子 ,优化
0　前 言
利用人工培养的细胞合成紫杉醇 ,消除了天然提取带来的生态环境问题 ,便于放大生产 ,
成为一种切实可行的替代方法。 诱导子是指能够刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物
质 ,它可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力 ,引起次生代谢途径中代谢通量和反应速
率的改变 ,从而提高次生代谢产物的产量。但是诱导子只有在适宜的浓度下才能有效地提高特
定目标产物的产量。本文利用短期诱导实验 ,考察了硝酸铈铵、硝酸银、花生四烯酸、水杨酸以
及甲基茉莉酮酸等诱导子在南方红豆杉细胞培养体系中的最优诱导浓度 ,为更大地提高紫杉
醇的产量甚至实现商业化提供了基础。
1　实验设计
1. 1　细胞株系
实验中采用细胞为中科院植物所提供南方红豆杉细胞的一个变种 YH,液体悬浮继代培
养超过 10代 (每周继代一次 )。
1. 2　培养条件 [ 1]
1. 3　诱导子实验设计
实验采用 250 ml的锥形瓶摇床培养 ,转速定为 100 rpm。每瓶装 40 ml实验用培养基 ,接
入 3 g (以湿重计 )混合均匀的种子细胞。实验用培养基的配置方法为在原改良 B5培养基的基
础上加入确定浓度的诱导子。每个实验都采用三个平行组。培养 5 d、 10 d后分别取样 ,检测生
物量与紫杉烷含量。硝酸铈铵、硝酸银、花生四烯酸、水杨酸以及甲基茉莉酮酸的加入浓度见表
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DOI : 10. 16333 /j . 1001 -6880. 2000. 04. 007
1和表 2。
表 1　硝酸铈铵、硝酸银诱导实验设计表
Table 1　 Scheme of elicita tion experiment by ammonium ce rous nitr ate and silv er nitrate
实验号
Expe riment number
硝酸铈铵浓度
Concentration of ammonium
cerous intra te( mmo l / L)
实验号
Experiment number
硝酸银浓度
Concentration of silv er
nitra te( mmo l / L)
A 0. 0 E 0. 1
B 0. 01 F 0. 005
C 0. 1 G 0. 01
D 1. 0 H 0. 1
表 2　花生四烯酸、水杨酸和甲基茉莉酮酸诱导实验设计表
Table 2　 Scheme o f elicitation experiment by a rachidonic acid, salicylic acid and methy l jasmonate acid
诱导子浓度
Concentra tion o f elicitor s( mg /L)
实验号 Experiment numbe r
花生四烯酸
Arachidonic acid
水杨酸
Salicy lic acid
甲基茉莉酮酸
Methy l jasmonate acid
0. 0 I M Q
0. 1 J N R
1. 0 K O S
10. 0 L P T
1. 4　细胞干湿重测量 [2 ]
1. 5　紫杉醇的提取与测量 [2 ]
2　结果分析
2. 1　硝酸铈铵短期诱导实验结果分析
研究证明 ,稀土是一类具有生理活性的化学元素 ,可以诱导产物的合成与释放 [3 ]。
不同浓度的硝酸铈铵加入后 ,在第 5 d、 10 d取样时紫杉醇的浓度如图 1所示。
图 1显示了较低浓度 ( B, 0. 01 mmo l /L; C, 0. 1 mmol /L)的硝酸铈铵对 5 d和 10 d紫杉醇
的产量影响不大。但当硝酸铈铵的浓度为 1. 0 mmol /L( D)时 ,紫杉醇的产量在 5 d提高到对照
组 ( A)的 3倍左右 ,硝酸铈铵的诱导作用已体现出来 ;在 10 d提高到对照组的 4. 5倍。 显然
1. 0 mmo l /L为最优诱导浓度。
研究发现 ,低浓度稀土处理红豆杉细胞后诱导细胞产生新的酯酶同工酶 (酯酶的活性越高
越有利于生长 ) ,促进了细胞的生长 ;而高浓度的稀土抑制了红豆杉细胞的某些酯酶同工酶的
形成 ,使细胞的生长下降 ,细胞的代谢由初级代谢向次生代谢物质合成转移 ,从而提高了红豆
杉细胞紫杉醇的合成。所以低浓度稀土对紫杉醇产量的影响不大 ,而高浓度稀土可以大大提高
紫杉醇的产量。
2. 2　硝酸银短期诱导实验结果分析
不同浓度的硝酸银加入后 ,在 5 d、 10 d取样时紫杉醇的浓度如图 2所示。
37Vo1. 12　 No. 4 施中东等: 南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇诱导子浓度的优化 　　
图 1　硝酸铈铵诱导下第 5、 10天时紫杉醇浓度
　 Fig. 1　 Taxol concentra tion on day 5 and 10 by
ammonium cerous nitra te elicitation
图 2　硝酸银诱导下第 5、 10天时紫杉醇浓度
　 Fig. 2　 Taxol concentr ation on day 5 and 10 by sil-
ver nitrate elicitation
　　从图 2可以看出 ,不同浓度硝酸银的加入对 d 5的紫杉醇含量影响不大 ,即对紫杉醇的诱
导作用还没有体现出来。而在 d 10时 ,硝酸银对紫杉醇产量的影响已经明显体现出来了。当硝
酸银浓度较低 ( F, 0. 005 mmol /L )时 ,硝酸银对紫杉醇产量的影响不显著 ;当硝酸银浓度为
0. 01 mmo l /L( G)时 ,紫杉醇的产量提到对照组 ( E)的 3倍。在高浓度 ( H, 0. 1 mmo l /L)硝酸银
情况下 ,细胞在 d 5取样时就已经出现大量死亡 ,不能为紫杉醇的合成提供必需的能量和还原
能力 ,同时紫杉醇的降解反应仍然存在 ,因此高浓度的硝酸银不能提高 10 d时的紫杉醇产量。
综合以上分析 , 0. 01 mmol /L的硝酸银对紫杉醇的合成最为有利 ,可以提高紫杉醇的产
量到对照组的 3倍。
图 3　花生四烯酸诱导下第 5、 10天时紫杉醇浓度
Fig. 3　 Taxol concentr ation on day 5 and 10 by
arachidonic acid elicita tion
2. 3　花生四烯酸短期诱导实验结果分析
不同浓度的花生四烯酸加入后 ,在 d 5、 d 10
天取样时紫杉醇的浓度如图 3所示。
可见 , d 5时花生四烯酸的诱导作用已体现出
来 ,但紫杉醇的产量并不随着花生四烯酸浓度的
变化而变化 ,而是在对照组 ( 1)的 3. 5倍处保持恒
定 ; d 10时在 0. 1 mg /L( J)花生四烯酸的诱导下
紫杉醇的产量提高到对照组的 6. 5倍。 而当花生
四烯酸的浓度较高 ( K, 1. 0 mg /L; L, 10. 0 mg /L)
时 ,对紫杉醇产量的影响不如低浓度组明显。
当花生四烯酸的浓度大于 0. 1 mg /L时 ,细
胞毒性体现出来 ,出现了褐化现象 ,细胞活性下
降 ,诱导作用受到了抑制。 另外 ,当花生四烯酸位
于高浓度时 ,其剂量已超过最优值 ,不能再有效地提高紫杉醇合成途径中的酶活力 ,诱导效应
已达到饱合。 因而紫杉醇含量基本保持恒定 ,与花生四烯酸的浓度无关。
2. 4　水杨酸短期诱导实验结果分析
水杨酸是一种酚类化合物 ,已有的研究表明 ,水杨酸在植物生长抵御外界侵扰过程中起了
重要的作用 ,内源水杨酸可以诱导与抗病蛋白有关基因的表达 ,而外源水杨酸则可以诱导防御
反应的产生。 但目前还未见到研究水杨酸对红豆杉细胞培养体系次生代谢产物影响的报道。
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不同浓度的水杨酸加入后 ,在 d 5、 d 10取样时紫杉醇的浓度如图 4所示。
可见 ,在培养到 d 5时 ,水杨酸对紫杉醇的诱导作用已表现出来 ,当浓度为 0. 1 mg /L( N )
时 ,紫杉醇的产量提高到对照组 ( M )的 5. 5倍。当水杨酸浓度高于 0. 1 mg /L( O, P)时 ,其对紫
杉醇产量稍有提高 ,但效果远不及低浓度组。这表明最适宜水杨酸浓度水平应为 0. 1 mg /L,浓
度过高反而会由于诱导子对细胞的毒害或反馈抑制作用而不利于紫杉醇的积累。
培养至 d 10时 ,高浓度 ( P, 10. 0 mg /L )的水杨酸对细胞的毒性已充分表现出来 ,细胞呈
现不正常的褐色 ,且基本死亡 ,不能为紫杉醇的合成提供必需的能量和还原能力 ,因而紫杉醇
的浓度开始急剧下降。 而低浓度的水杨酸使紫杉醇产量继续增高 ,约为对照组的 5. 5倍。
2. 5　甲基茉莉酮酸短期诱导实验结果分析
不同浓度的甲基茉莉酮酸加入后 ,在 d 5、 d 10取样时紫杉醇的浓度如图 5所示。
图 4　水杨酸诱导下第 5、 10天时紫杉醇浓度
　 Fig. 4　 Taxol concentra tion on day 5 and 10 by
sa licy lic acid elicita tion
图 5　甲基茉莉酮酸诱导下第 5、 10天时紫杉醇浓度
　 Fig. 5　 Taxol concentra tion on day 5 and 10 by
methyl jasmona te elicitation
　　由图 5可以看出 ,低浓度 ( R, 0. 1 mg /L )的甲基茉莉酮酸在 d 5时就使紫杉醇产量得到提
高 ,约为对照组 ( Q)的 7倍 ,诱导作用已体现出来。 这与 Moon发现甲基茉莉酮酸使紫杉醇最
大积累浓度的出现时间提前到 d 3的结果一致 [ 4]。当甲基茉莉酮酸浓度高于 0. 1 mg /L ( S、 T)
时 ,紫杉醇的产量略高出对照组 ,且基本恒定。
培养至 d 10时 ,高浓度甲基茉莉酮酸对紫杉醇的诱导作用已充分体现出来 ,随着甲基茉
莉酮酸浓度的升高 ,紫杉醇的产量也随之升高。 可见 10. 0 mg /L ( T )为最优的诱导浓度 ,能提
高紫杉醇的产量到 7倍以上。
甲基茉莉酮酸可激活特定防御基因的转录和翻译 ,最终促进次生代谢产物紫杉醇的合成。
Kutchan
[ 5]发现甲基茉莉酮酸量越多 ,防御基因的转录量也越多 ,因此随着甲基茉莉酮酸浓度
增大紫杉醇的产量也增大。
3　讨 论
从以上的分析可以看出:不同诱导子体现诱导作用所需的时间不同 (其中硝酸银的诱导作
用体现得最慢 ,在 5 d以后 ;而硝酸铈铵、花生四烯酸、水杨酸以及甲基茉莉酮酸等诱导子的诱
导作用都在 5 d以内体现出来 ) ;诱导效果 (即对紫杉醇产量的影响 ,包括 d 5、 d 10提高的倍
数、 d 5和 d 10两天提高倍数的关系以及紫杉醇的最高浓度 )也不同。
诱导子加入培养体系后 ,经过信号传导途径影响细胞中特定的酶 ,使酶活力发生改变 ,从
39Vo1. 12　 No. 4 施中东等: 南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇诱导子浓度的优化 　　
而使该酶所催化代谢途径的代谢通量和反应速率发生改变 ,最终导致紫杉醇浓度和产量的改
变。不同诱导子体现诱导作用所需的时间和诱导子的诱导效果不同 ,正是表明不同诱导子对紫
杉醇合成途径中酶活力的影响以及诱导子的作用位点不同。
利用诱导子的最优诱导浓度、体现诱导作用所需的时间和诱导效果的差别 ,可以为红豆杉
细胞培养中诱导子的添加提供指导。
参考文献
1　未作君 ,苗志奇 ,元英进 . 渗透势及营养物浓度对南方红豆杉细胞生长和紫杉醇合成的影响 . 无锡轻工业
大学学报 , 1999, 18( 5): 31～ 34
2　元英进 ,胡国武 ,王传贵等 . 镧、铈对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成与释放的影响 . 中国稀土学报 , 1998,
16( 1): 56～ 60
3　元英进 ,胡国武 ,那　平等 . 提高红豆杉细胞中紫杉醇含量与释放的方法 . 中国专利 CN1158356A
4　 Moon W J, Yoo BS, Kim D et al . Elicitation kinetics o f tax ane production in suspension cultur es of Taxus
baccata Pendula. Bio technolog y Tech niques, 1998, 12( 1): 79～ 81
5　 Kutchan T. 12-Oxo-phyv todiencoic acid accumulation o f berberine bridge enzyme transcript ana lo gous to
methyl ja smonate. Journa l o f Plant Phy siolog y , 1991, 142: 5502～ 5505
CONCENTRATION OPTIMIZATION OF ELICITORS
ON TAXOL PRODUCTION IN PLANT CELL CULTURE OF
TAXUS CHINESIS VAR.MAIREI
Shi Zhongdong, W ei Zuo jun, Yuan Yingjin
( Natural Product Institute of Biochemical Engineering Tianjin University , Tianjin　 300072)
Abstract　 In this paper, the optimal concentra tions of elicitors on tax ol production in Taxus
chinesis var.Mairei cell culture are studied wi th the short-term experiments. It can be found
that i t is the most beneficial to improve production o f taxo l when added wi th 1. 0 mmol /L
ammonium cerous ni t rate, 0. 01 mmol /L si lv er nit rate, 0. 1 mg /L a rachidonic acid, 0. 1 mg /L
salicylic acid and 10. 0 mg /L methyl jasmona te acid respectiv ely.
Key words　plant cell culture, Taxus chinesis va r.Mairei , tax ol , elici to r, optimiza tion
40　　 天然产物研究与开发 Vo1. 12　 No. 4