全 文 ：柠檬酸铵对紫杉醇生物合成途径的诱导作用研究
未作君 ,苗志奇 ,元英进
(天津大学 化工学院 制药工程系 ,天津　 300072)
摘　要: 目的　确定柠檬酸铵在紫杉醇生物代谢途径的作用位点。方法　分别在 0, 0. 1, 1, 10, 20μmol / L的柠檬酸
铵诱导下 ,观察紫杉烷类物质产量的变化 ,并通过生物代谢途径进行定性分析。 结果　紫杉醇的产量提高近 3倍 ,
而 10-DAB( 10-deacty l baccatinⅢ )与 bacca tinⅢ的浓度下降。 结论　柠檬酸铵提高了紫杉醇合成途径中从 bac-
ca tinⅢ与紫杉醇间的反应速度 ,即其作用位点位于 bacca tinⅢ与紫杉醇之间。
关键词: 紫杉醇 ;柠檬酸铵 ;作用位点 ;植物细胞培养
中图分类号: TQ461　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0213 03
Elicitation of taxol biosynthetic pathway by ammonium citrate
WEI Zuo-jun, M IAO Zhi-qi, YU AN Ying-jin
　　 ( Schoo l of Chemical Engineering , T ianjin Univ e rsity , Tianjin 300072, China )
Abstract: Object　 To study the eliciting ef fect of ammonium ci t ra te ( AC) on the yield of tax ol.
Methods　 The study w as carried out on plant cell cul tures w ith dif ferent concentra tions o f added AC. Re-
sults　 Yield of taxo l w as increased by 3 times under 10μmol /L AC elici ta tion, w hi le the concentrations of
10-deacetyl bacca tin Ⅲ and baccatin Ⅲ were simul taneously decreased. Conclusion　 By analy zing the
changing characters betw een substrate and enzyme in the simplified tax ol synthetic pathw ay. AC w as con-
sidered to play the role in increasing the reaction rate from baccatinⅢ to tax ol.
Key words: tax ol; ammonium ci t rate ( AC) ; acting spo t; plant cel l cul ture
　　人工培养的红豆衫细胞作为紫杉醇生产的微型
反应器 ,最受人关注的是如何提高培养体系中紫杉
醇的产量。 本实验室通过两相培养 [ 1, 2]、稀土添加 [ 3]
对紫杉醇产量有显著的提高。生物诱导子和非生物
诱导子也可以在一定程度上提高紫杉醇的产量 [4, 5 ]。
本文研究了柠檬酸铵短期诱导实验中柠檬铵与
紫杉醇产量间的相互关系 ,并分析了诱导实验与对
照实验中 10-DAB, baccatinⅢ的浓度变化趋势以及
它们与紫杉醇产量间的相关性。 通过拓扑简化将紫
杉醇生物合成途径简化为一连串反应 ,从连串反应
动力学的角度 ,分析柠檬酸铵对各步反应速率的影
响 ,从而获得柠檬酸铵作用位点的相关信息。
1　材料与方法
1. 1　实验中所采用细胞为中科院植物所提供的南
方红豆衫细胞的一个变种 YH,液体悬浮继代培养
超过 10代。
1. 2　培养条件:按文献 [6 ]。
1. 3　诱导子实验设计: 实验采用 250 mL的锥形瓶
摇床培养 ,转速定为 100～ 120 r /min。每瓶盛 40 mL
实验用培养基 ,接入 3 g (以湿重计 )混合均匀的种子
细胞。实验用培养基的配制方法为在原 B5培养基
中加入柠檬酸铵。每个实验都采用三个平行组 ,培养
第 6天、 10天后分别取样 ,检测细胞的生长量与紫
杉烷含量。实验中柠檬酸铵加入浓度如表 1所示:
表 1　柠檬酸铵诱导实验设计
实验因素 A B C D E
柠檬酸浓度 (μmol /L) 0 0. 1 1. 0 10 20
1. 4　细胞干湿重测定:按文献 [7 ]方法。
1. 5　紫杉烷的提取与测定:按文献 [7 ]方法。
2　实验结果分析
图 1、图 2分别为第 5、 10天取样时紫杉醇合成
途径中关键紫杉烷浓度 ,其中实验编号对应柠檬酸
铵浓度见表 1所示 ,紫杉醇含量见图右坐标轴。
从图 1可以看出不同浓度的柠檬酸铵加入对第
5天的紫杉醇含量影响不大 ,这说明在柠檬酸铵加
入的前 5 d,其对紫杉醇产量的影响还没有充分体现
出来。在实验过程中发现加入低浓度柠檬酸铵时细
胞生长最快 (数据未列出 ) ,可能通过某种途径启动
·213·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-08-15基金项目:国家教委“跨世纪优秀人才培养计划”基金和天津市科委项目资助作者简介:未作君 ( 1976-) ,男 ,湖北省京山县人 ,现在天津大学制药工程系攻读博士学位。 从事植物细胞培养研究。
* 通讯联系人
图 1　柠檬酸铵诱导第 5天紫杉烷浓度
图 2　柠檬酸铵诱导第 10天紫杉烷浓度
了作为生长抑制剂的紫杉醇的分解途径 ,因此紫杉
醇含量相对于对照组出现下降。 当柠檬酸铵浓度超
过某一浓度时 ,细胞生长受到明显抑制 ,紫杉醇合成
途径代谢通量出现提升 ,但由于作用时间短 ,反应速
率的提升还没有体现到紫杉醇产量的升高上来。
从图 2中可以明显看出在第 10天时 ,柠檬酸铵
对紫杉醇产量的影响已经明显体现出来。 当柠檬酸
铵浓度较低时 ,紫杉烷的产量近似与柠檬酸铵无关 ,
这可能是由于柠檬酸铵已被消耗完所致 ;当柠檬酸
铵浓度为 10μmol /L时 ,紫杉醇的产量提高到对照
组的 3倍。
另外 ,分析图 1、图 2中紫杉醇合成途径中中间
代谢产物浓度变化的相关性 ,可以看出在柠檬酸铵
诱导下 10-DAB、 baccatinⅢ的含量与紫杉醇的含量
呈现出明显的负相关性。 10μmol /L柠檬酸铵浓度
引起 10-DAB、 baccatinⅢ含量下降的同时 ,紫杉醇
含量相应上升。这种负相关一方面说明在生物合成
途径上 10-DAB、 baccatinⅢ是合成紫杉醇的直接或
者间接前体 ,同时也说明适宜浓度的柠檬酸铵可以
对这种关系的具体模式产生影响。
3　柠檬酸铵对紫杉醇合成动力学的影响
3. 1　紫杉醇生物合成途径的拓扑简化:紫杉醇生物
代谢简图如图 3( a)所示。由于该路径非常复杂 ,涉
及的酶、代谢产物众多 ,因此有必要在保持拓扑结构
不变的前提下 ,对该途径进行简化 ,以适合动力学分
析的需要。其拓扑简化途径如图 3( b)所示。
图 3　紫杉醇生物代谢路径及其拓扑结构简化
诱导子在紫杉醇生物合成与降解途径上的作用
位点是指诱导子加入反应速度得到最大程度提高的
那步生化反应。 在模型分析中诱导子的作用位点的
详尽程度必然受途径拓扑简化程度的影响 ,由于在
本模型中紫杉醇生物合成途径被分为三段 ,因此利
用模型确定的作用位点有 3种可能:位于 10-DAB
之前、位于 10-DAB和 baccatinⅢ之间、位于 bac-
catinⅢ与紫杉醇之间。
3. 2　紫杉醇生物合成动力学分析:由图 1、图 2所
示 ,适宜浓度的柠檬酸铵在实验中提高了紫杉醇的
产量 ,即提高了紫杉醇合成途径的拟稳态通量 ,同时
10-DAB, baccatinⅢ的拟稳态浓度都出现下降。 因
此分析可知 ,柠檬酸铵的作用位点位于 baccatinⅢ
和紫杉醇之间 ,即柠檬酸铵通过提高催化 bacca tin
Ⅲ合成紫杉醇的的酶活力 ,从而提高紫杉醇的产量。
而任何假定柠檬酸铵作用在 bacca tinⅢ之间的假设
都会与实验中 bacca tinⅢ拟稳态浓度下降的实验现
象矛盾。
4　讨论
在 10μmo l /L的柠檬酸铵诱导下 ,紫杉醇的产
量提高了近 3倍 ,同时 10-DAB与 bacca tinⅢ的浓
度出现下降 ,与紫杉醇的浓度呈现出一定程度的负
相关性。通过动力学分析 ,指出柠檬酸铵加入提高了
从 bacca tinⅢ到紫杉醇间反应的反应速度。
参考文献:
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醇合成与释放的影响 [ J ]. 中国稀土学报 , 1998, 16( 1): 56-60.
天赐胶囊中多糖的含量测定
毛丽珍 ,徐世芳 ,唐红芳
(浙江省医学科学院 ,浙江 杭州　 310013)
摘　要: 目的　建立天赐胶囊的含量测定方法。 方法　采用苯酚硫酸法 ,以葡萄糖作为标准品 ,分光光度法于 490
nm波长处测定吸光度。 结果　多糖的线性范围为 10～ 80μg /m L,相关系数 r = 0. 999 7,平均加样回收率为
98. 67% (n= 5) , RSD= 2. 58% ,样品中多糖含量为 267. 7～ 300. 6毫克 /粒。 结论　该法简便 ,准确 ,可用于本品的
质量控制。
关键词: 天赐胶囊 ;多糖 ;鲜河蚌肉汁水
中图分类号: R927. 2　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 03 0215 02
Determination of polysaccharide in TIANCI CAPSULE
M AO Li-zhen, XU Shi-fang , Tang Hong-fang
　　 ( Zh ejiang Academy o f Medical Sciences, Hang zhou Zhejiang 310013, China )
Abstract: Object　 To develop a method for the determination o f po lysaccharide in TIAN CI CAP-
SULE, w hich is a new drug dosage fo rm containing the bouillon of f resh w ater mussels wi th immunopo-
tentiating activi ty. Methods　 Total po lysaccharide w as determined by phenol-sul furic acid method w ith
g lucose as the standard, and spect ropho tometer assay abso rbency at 490 nm. Results　 The linea r range of
poly saccha ride w as 10～ 80μg /mL, r= 0. 999 7. The average recovery ra te was 98. 67% (n= 5) , RSD=
2. 58% . Through sample assay , the content of polysaccha ride w as 267. 7～ 300. 6 mg in each TIANCI
CAPSU LE. Conclusion　 The method is simple, rapid and reliable, and may be used for the quali ty cont rol
o f this preparation.
Key words: T IAN CI CAPSULE; po lysaccharide; f resh w ater mussel bouillon
　　天赐胶囊是由鲜河蚌肉汁水经现代工艺制成的
胶囊剂。在《本草纲目拾遗》中记载“河蚌水乃真阴天
一之精 ,入药最广”。药效学研究表明 ,本品有镇痛、
增强免疫功能和具有抗疲劳及抗应激功能。临床上
有滋阴清热 ,消肿止痛的作用。 适用于阴虚内热 ,咽
燥口干 ,特别是肿瘤患者术后 ,放化疗后 ,对增强体
质 ,提高机体免疫功能更为合适。经理化研究证明 ,
本品主要成分为蚌肉多糖 ,而蚌肉多糖的含量测定
方法未见报道。本文采用苯酚硫酸法 [1～ 4 ]测定其含
量 ,方法简便 ,结果满意。现报道如下。
1　仪器与试药
UV-210紫外 -可见分光光度计 (日本岛津 ) ,
CQ250超声波清洗器 (上海超声波仪器厂 )。葡萄糖
对照品和浓硫酸 (均为分析纯 ) ,苯酚试剂 (取苯酚
100 g ,加铝片 0. 1 g和碳酸氢钠 0. 05 g ,蒸馏 ,收集
182℃馏分 )。天赐胶囊由浙江湖州龙海生化有限公
司提供。
2　方法与结果
2. 1　对照品和供试品溶液的制备
2. 1. 1　对照品溶液:精密称取 105℃干燥至恒重的
葡萄糖 100 mg ,置于 100 mL量瓶中 ,加水稀释至刻
度 ,摇匀 ,精密量取 2 mL置 50 mL量瓶中 ,加水至
刻度 ,摇匀 ,即得 0. 04 mg /m L对照品溶液。
2. 1. 2　供试品溶液: 取本品内容物 0. 1 g ,精密称
定 ,加水 1 mL,超声处理 5 min使溶解 ,加入无水乙
醇 3 mL,放置 10min,离心弃去上清液 ,沉淀加水溶
·215·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 3期
收稿日期: 2000-06-30