全 文 ：华 南 理 工 大 学 学 报(自 然 科 学 版)
第 27 卷 第 1期 Journal of South China University of Technology Vol.27 No.1
1999 年 1 月　 (Natural Science) January　1999
磷限制培养中玫瑰茄细胞生长
及花青素形成动力学
阮　茜　郭　勇
(华南理工大学生物工程研究所　广州　510641)
摘　要　研究了在不同起始磷浓度下玫瑰茄细胞生长 、 主要营养物质(糖 、 铵离子及硝酸根 、 胞
外磷)的消耗及产物花青素形成的动力学特性.结果表明该细胞的比生长速率与限制性底物磷浓
度的关系符合 Monod 方程 , 最大比生长速率为 0.216 0 d-1.细胞比生长速率与产物花青素的形
成呈负相关.
关键词　玫瑰茄;花青素;动力学;植物细胞培养
中图资料分类号　TQ 920.1
由于合成色素逐渐被禁止使用 , 植物天然色素愈来愈受到重视.花青素是常见的一种天
然红色素 , 在许多红色 、蓝色和紫色植物中都有.而广泛分布于热带 、亚热带地区的玫瑰茄
(Roselle), 其紫红色花萼已作为花青苷色素的合适原料而受到重视.在我国福建 、广东等南
部地区已有生产性栽培玫瑰茄以提取此色素.但地域 、气候等条件使大面积栽培植物来获得
色素受到限制.因而 , 植物细胞培养技术的发展为天然色素的生产提供了新的途径.
已有一些文献报道了利用 Daucus carota , Malus pumila , Helianthus tubersus , Perilla
frutescens等植物细胞培养获得花青素的研究.然而 , 植物细胞培养仍然有许多问题尚未解
决.培养基的优化及培养基中各种营养元素对细胞生长及次生代谢产物形成的影响仍未明
了.无机磷是细胞生长的重要营养物质之一 , 磷能够掺入到某些生物大分子中去(如核酸 ,磷
脂等), 对能量代谢有重要作用.在不少植物分批培养的研究中[ 1 ～ 3] , 无机磷在细胞生长的前
48 h 被迅速吸收 , 因而 ,胞内 PO3-4 浓度迅速增加.胞内的 PO3-4 主要分布在两部分:5%～
15%分布在细胞质中 , 而 85%～ 95%分布在液泡中.细胞质中的 PO3-4 是以液泡为贮存基
地 , 以保持细胞质中的 PO3-4 浓度在一稳定水平上 , 有利于细胞分化/生长等诸多代谢过
程[ 4] .Ashihara等[ 5]在对长春花的研究中发现 , 将细胞转接到新鲜培养基后 , 长春花细胞快
速吸收无机磷 , 24 h后 ATP 、葡萄糖 -6-磷酸及果糖-6-磷酸的合成达到了最高水平.
DNA 、RNA及蛋白质等在 72 h 后形成并伴随着最大细胞生长.
本文详细研究了在不同起始磷浓度中玫瑰茄悬浮细胞生长 、主要营养物质消耗及产物花
青素形成的动力学特性.目的是把握该细胞生长和生理代谢的变化规律 , 为生物反应器中大
规模培养花青素奠定基础.
收稿日期:1997-03-25　　修改稿收到日期:1998-04-20
阮　茜 , 女 , 1970 年生 , 现为华南农业大学讲师 , 博士;主要研究方向:细胞工程 , 发酵工程.
1　材料与方法
1.1　培养体系
本实验采用的细胞株是经玫瑰茄花萼诱导得到的愈伤组织[ 6 ～ 8] , 经继代培养 、诱变筛选
获得的高产细胞株.悬浮继代培养采用 B5培养基添加 1×10-6g/L 的 2 , 4_D 、0.5×10-6g/ L
的 KT及3 0g/ L的蔗糖 , pH =4.5的条件下进行 .其中 , 起始磷浓度分别为0.25 , 1.09 ,
6.25 mmol/L .玫瑰茄细胞在 25 ℃、 90 r/min 、光照 1 600 lu 、16 h/d的摇床上进行培养 , 每
100 mL 摇瓶中培养基装量为 30 mL , 细胞接种量为每 30 ml中 2 g.
1.2　分析方法
每 48 h取样.取样后 , 细胞经砂芯漏斗过滤 、洗涤 , 称量得湿重 , 置于 50 ℃左右烘干至
恒重 , 称得干重.葡萄糖浓度采用 3 , 5-二硝基水杨酸法测是 , 铵根离子及硝酸根离子的定
量分别采用苯酚-次氯酸盐反应和水杨酸反应的方法测定.磷的测定采用抗坏血酸还原法进
行测定.花青素测定 :将1g湿细胞用1 0ml含 φ(HCl)=1 %的甲醇于4℃静置抽提24 h ,
3 000 r/min离心 , 吸取上清液 , 测定 OD525.花青素含量(w A), 按文献[ 9] 方法求出:w A=
(27.208A+0.059 1)10/1 000;花青素总量(wAT):wA T =w A·wC .其中 A 为吸光度 , w C
为湿细胞的质量分数.以下数据皆为三次平均值.
2　结果与讨论
2.1　起始磷浓度对玫瑰茄细胞生长及产物花青素形成的影响
图 1(a)给出了玫瑰茄细胞在不同起始磷浓度时的生长曲线.结果表明 , 三种浓度下细胞
生长都经过延滞期(0 ～ 4 d), 生长速度比较缓慢.磷浓度为 0.25 mmol/L 时 , 细胞生长曲线
基本为一直线 , 随着起始磷浓度增大 , 细胞生长速度显著增大.起始磷浓度为 1.09 mmol/ L
时 , 细胞生长曲线已变为 S形曲线 , 产生指数生长期(4 ～ 12 d)及静止期(12 ～ 16 d).而当磷
浓度继续增大时(直至 6.25 mmol/L), 细胞生长速度几乎不再增大 , 曲线形状也不再改变.
这说明在低磷浓度时 , 磷是细胞生长的限制性基质.
图 1　不同磷浓度下细胞生长及花青素形成的变化
F ig.1　Cell grow th and anthocyanin formation of Ro selle
cells at different phosphate concentrations
　　图 1 (b)给出了玫瑰茄细胞在不同起始磷浓度下的产物花青素形成曲线.可见 , 在细胞
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生长对数期末期 , 花青素大量形成.随磷浓度的降低 , 细胞生长速度减慢 , 而花青素产量增
高.图中显示 , 花青素总量是每升培养基中总细胞量与单个细胞花青素的乘积.对于起始磷
浓度分别为 1.09 mmol/L 与 6.25 mmol/L 的条件下 , 细胞生长量几乎相同 , 但单个细胞相差
极大.因而可清楚看出 , 在 1.09 mmol/ L的磷初始浓度下的花青素产量高于 6.25 mmol/L 的
磷初始浓度下的产量.从图1(b)中的曲线来看 ,在0.25mmol/ L浓度下的总花青素量
高于6 .25mmol/ L浓度下的总花青素量 ,而小于1 .0 9mmol/ L浓度下的总花青素量 .但
由于0.25mmol/ L磷初始浓度下 , 细胞量远小于其它两种条件下的细胞量 ,由计算可知
0.25 mmol/L 磷初始浓度下的单个细胞花青素产量高于后两者的.因而从单个细胞花青素产
量来看 , 0.25 mmol/ L磷初始浓度是最有利于花青素的形成的.
上述实验结果表明 , 玫瑰茄细胞悬浮培养花青素的形成与细胞生长呈负相关 , 细胞生长
缓慢有利于花青素形成.其细胞生长与产物形成的动态变化为非生长偶联型.因此其大规模
培养可采用两步培养法.
2.2　磷对主要营养物质消耗的影响
图 2显示了不同起始磷浓度下培养基中主要营养物质消耗的动态曲线.如图 2(a)所示 ,
培养初期培养基中的磷被细胞大量消耗 , 进入对数生长期时胞外磷已降至 0 mmol/L.从细胞
生理代谢过程推断 , 在延迟期(0 ～ 4 d)细胞大量吸收磷 , 合成细胞生长所需的 ATP 、RNA 、
DNA及蛋白质等等 , 然后细胞才能快速繁殖进入对数生长期.
图 2　不同起始磷浓度时玫瑰茄细胞培养基中主要营养物质的动态变化
Fig.2　Curve of main nutrient in cell culture medium of Roselle cells at
different phosphate concentrations
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　　图 2(b)和图 2(c)显示了不同起始磷浓度下培养基中铵根离子和硝酸根离子浓度的动态
变化.NH+4 易被吸收 , 培养的两天内 , NH+4 几乎完全被消耗;NO-3 在整个培养过程中被利
用 , 随着磷浓度的增大 , NO-3 的利用速率增大 , 并与细胞生长相对应.说明随着磷浓度的增
大 , 细胞生长速度加快 , 胞外各种营养成分的吸收利用速率提高.
图 2(d)给出了葡萄糖的利用情况.0 ～ 2 d 内 , 蔗糖被迅速分解 , 葡萄糖含量急剧增高;
两天后 , 葡萄糖的利用速率远远超过蔗糖分解速率 , 培养基中的葡萄糖量迅速降低 , 且随着
磷浓度的增大 , 细胞生长速度加快 , 细胞量迅速增高 , 因而其消耗速率增大.
3　动力学模型的建立
3.1　玫瑰茄细胞生长模型
由图 1可知 ,在玫瑰茄细胞生长过程中 , 首先进入延迟期 , 接着表现为快速生长 , 并且在
低磷浓度时 , 磷是细胞生长的限制基质.其关系基本符合 Monod方程
　　　　　　　　　　　　　　μ=μmax [ S]K S+[ S] . (1)
其中 , μmax为最大比生长速率(d-1);[ S]为限制性基质浓度 , 此处指磷浓度(mmol/L);K S为
饱和常数(mmol/L).
在Monod方程中 ,只包含了限速因子(此处为无机磷), 而其它的一些因子的作用被忽
略.
3.2　产物花青素形成模型
由图 1(b)及以上讨论可知 , 花青素的形成主要是非生长偶联型的 , 因而 , 花青素的形成
可用 Luedeking_Piret模型来表示:
　　　　　　　　　　　　　　　　dP
d t
=αμX +βX . (2)
其中 , α为生长偶联型因数;β为非生长偶联型因数;μ为比生长速率(d-1);X 为细胞含量
(g/ L);P 为花青素产量(g/L).
图 3　细胞生长与花青素形成的模型验证
Fig.3 　Model prediction o f cell grow th and antho-
cyanin formation
3.3　动力学参数的确定和模型验证
根据实验结果 , 采用最小二乘法估计模型
中的动力学参数 , 结果如下:μmax =0.216 0
(d-1), K S=0.245 4(mmol/L), α=0.003 114 ,
β=0.002 209(d-1).利用所估计的参数 , 对模
型进行仿真 , 结果如图 3所示.图中 , 点为实验
值 , 曲线为模拟计算曲线.
由图 3可看出 , 在对数生长期(6 ～ 12 d),
模型与实际过程完全相符.这基本上与建立模
型时所假设的初始条件相对应.然而 , 在植物
细胞生长中 , 细胞的生长过程具有阶段性 , 并
且受到生长过程中环境条件的影响 , 因而 Monod 非结构生长模型对细胞生长的模拟有一定
的限制.在次级代谢物模拟图中 , 仅仅是对数生长期吻合.由于实际中细胞生长与代谢产物
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形成是相对独立而又紧密相关的两个阶段 , 因而我们所用的方程未能体现出次级代谢物与细
胞生长引起的环境的改变之间的关系.由于细胞在不同的外界条件下 , 细胞内部的代谢过程
会有所不同 , 因而表现出的生长过程与产物形成亦会不同.这就要求我们建立不同时期下的
细胞模型.但在大规模连续培养的过程中 , 细胞状态将会被尽量控制在对数生长期 , 以让细
胞生长达到所需的细胞量及在对数生长末期使细胞产生大量色素.这需要很细致地调节外部
的环境条件.
4　结　论
研究磷限制性培养中玫瑰茄悬浮细胞生长 、花青素形成及营养物质消耗的动力学特性.
试验表明 ,磷是细胞生长的限制性基质 , 而花青素的形成是非生长偶联型模式.因而我们拟
在进一步的大规模玫瑰茄细胞培养中 , 在较好地控制培养基中磷的浓度的同时 , 控制溶氧 、
pH等一系列发酵条件 , 采用两步培养法进行试验.
参　考　文　献
1　Brodelius P , Vogel H J.A phosphorus_3l nuclear magnetic resonance study of phosphate uptake and storage in cultured Catha-
ranthus roseus and Daucus carota plant cells.J Biol Chem , 1985 , 260:3 556
2　Gulik W M van , Hooper H J G ten , Heihnen J J.A st ructured model describing carbon and phosphate limited grow th of
Catharan thus roseus plan t cell suspensions in batch and chemostat culture.Biotechnology &Bioengineering , 1993 , 41:771
3　Knobloch K H , Beutnagel G , Berlin J.Inf luence of accumulated phosphate on cul ture grow th and formation of cinnamoyl pu-
t rescines in medium_induced cell suspension cultures of Nicotiana tabaum , Planta , 1981 , 153:582
4　Bieleski R L , Ferguson T B.Physiology and metabolism of phosphate and it s compounds.In:Lauchli A and Bieleski R L eds.
Encyclopedia of Plant Physiology , Vol 15A.Berlin:Springer Verlag , 1983.422
5　Ashihara H , Tokoro T.Metabolic fate of inorganic phosphate absorbed by suspension cultured cells of Catharanth us roseus.J
Plant Physiol, 1984 , 116:417～ 423
6　阮　茜 , 郭　勇.玫瑰茄悬浮细胞生长及花青素形成的研究.生物工程学报 , 1996 , 12(增刊):297～ 299
7　张玉墀 , 阮　茜, 梁　　等.添加剂对玫瑰茄细胞生长及类黄酮形成的影响.华南理工大学学报 , 1993 , 21(增刊):70～ 74
8　蔡燕璇 , 郭　勇.玫瑰茄细胞培养及其花黄素产生的研究.华南理工大学学报 , 1991 , 20(4):94～ 96
9　Zhong Jianjiang et al.Effect of light irradiation on anthocyanin production by suspended cultu re of Peri lla f rutesens.Biotech
and Bioeng , 1991 , 38:653～ 658
KINETICS ON GROWTH OF ROSELLE CELLS AND ANTHOCYANIN
FORMAT ION IN PHOSPHORUS_LIM IT ING CU LTU RES
Ruan Qian 　Guo Yong
(Research Inst.of Biological Engineering , South China Univ.of Tech., Guangzhou 510641)
Abstract　This paper investigates the effects of limited phosphate concentration on the kinetics on
the g row th of roselle cells and anthocyanin fo rmation in suspended cultures.It is shown that the
cell g row th kinetics can be described by Monod equation with μmax of 0.216 0 a day.The change
of anthocyanin formation has negative relevance to that of cell g row th.
Key Words　roselle;anthocyanin;kinetics;plant cell culture
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