全 文 ：图 2　酸枣仁 ( 1)和缅枣仁 ( 2)的 CZE图谱
两者的显微特征基本相同 ,仅子叶表皮细胞中草酸
钙方晶的含量及细胞的大小、多寡有别 ;薄层层析的
斑点
基本一致 ,只是个别斑点的大小和荧光强度不同 ;在
镇静、催眠方面也有相近的作用。 因此 ,认为缅枣仁
可以代替酸枣仁使用。本研究结果表明 ,缅枣仁与酸
枣仁蛋白质的含量、氨基酸组成、 SDS-PAGE及
CZE图谱 ,在基本相似的基础上 ,尚有个别的差异
存在。可以预见 ,两者在药理毒理作用方面 ,可能存
在较多的相似之处和个别的差异 ,其具体的异同有
待进一步研究。
参考文献:
[1 ]　中华人民共和国药典 [S ] . 1995年版 . 一部 .
[2 ]　郑虎占 ,董泽宏 ,余　靖 . 中药现代研究与应用 (第七卷 ) [M ].
北京:学苑出版社 , 1997.
[ 3 ]　方子年 ,郑　玲 .缅枣仁与酸枣仁的比较 [ J ] .中草药 , 1987,
18( 4): 29-30.
[ 4 ]　赵文明 . 种子蛋白质基因工程 [M ]. 西安: 陕西科技出版社 ,
1995.
[ 5 ]　宋治军 ,纪重光 .现代分析仪器与测试方法 [M ] .西安:西北
大学出版社 , 1994.
[6 ]　 [美 ] J. 萨姆布鲁克 , E. F. 弗里奇 , T.曼尼阿蒂斯 . 金冬雁 ,
黎孟枫译 . 分子克隆实验指南 (第二版 ) [M ]. 北京:科学出版
社 , 1992.
悬浮培养过程中碳、氮、磷的补加对南方红豆杉细胞生长影响的研究
胡　萍 ,元英进 ,苗志奇
(天津大学化工学院 天然产物生化工程所 ,天津　 300072)
摘　要: 目的　解决南方红豆杉生长缓慢的问题。 方法　考察红豆杉细胞悬浮培养过程中磷的消耗 ,并研究了碳、
氮、磷对细胞生长及细胞活性的影响。结果　碳源在悬浮培养中期已经消耗殆尽 ,后期碳源的缺乏限制了细胞的生
长。 结论　补加碳源组与对照组相比 ,细胞生长率和细胞密度明显提高 ,其中细胞生长率约提高了 83%。
关键词: 南方红豆杉细胞 ;悬浮培养 ;生长 ;碳源
中图分类号: R284. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0028 04
Effects of fed-batch carbohydrate, nitrogen, phosphorus on
growth of Taxus chinensis var. mairei cell during suspens ion culture
HU Ping , YUAN Ying-jin, M IAO Zhi-qi
( Depa rtment o f Pharmaceutical Engineering , Schoo l of Chemical Engineering and Tech nelog y ,
Tianjin Univ ersity, Tianjin 300072, China )
Abstract: Object　 To so lv e the problem tha t Taxus chinensis var. mairei ( Lemee et Lé v l. ) Cheng et
L. K. Fu grows slow ly. Methods　 The consumption of phospho rus during the cell suspension culture and
the effect o f fed-batch carbohydra te, ni trog en and pho spho rus on cell g row th and living-cel l activi ty w ere
assayed. Results　 The carbohydra te w as exhausted in the middle phase of suspension cul ture, dificiency of
carboh ydra te led to inhibi tion of cell g row th in the late cul ture. Conclusion　 Compared wi th the control
g roup, the cell g row th ra te and the cell densi ty in the fed-batch carbohydrate g roup w ere increased signifi-
cant ly , and the cell g row th rate was up to 83% .
Key words: Taxus chinensis var. mairei ( Lemee et Lé vl. ) Cheng et L. K. Fu; suspension culture;
g row th; carbohydra te
·28· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-04-14基金项目:天津市重点攻关项目 ( 963107211)和国家教委跨世纪优秀人才培养计划基金资助
　　紫杉醇是一种有效的抗癌新药 ,红豆杉植物细
胞培养生产紫杉醇是解决该药源紧缺的方法之一 ,
但在植物细胞培养过程中 ,细胞生长缓慢是制约其
工业化的一个重要因素 ,因此如何提高悬浮培养过
程中植物细胞的生长速度成为国内外研究的热
点 [1 ]。现有研究工作主要集中在初始培养基组成优
化与培养条件优化两方面 [ 2] ,但由于间歇培养过程
中营养组分的含量并不恒定 ,而是随培养过程的进
行而下降 ,因此初始培养基组成优化不能在整个培
养过程中一直保持最优的培养基组成 [2 ]。本文研究
了培养过程中碳、氮、磷的消耗规律 ,并采用流加的
方法 ,对整个培养过程中碳、氮、磷组成进行调整优
化 ,从而大幅度提高细胞生长速率 ,并为后续的优化
流加策略奠定了基础。
1　材料
细胞株系为南方红豆杉细胞 (细胞系 2D3A) ,
在 B5固体培养基上继代培养。液体培养基为 B5培
养基加 30 g /L蔗糖+ 3 g /L酪蛋白水解物+ 2 mg /L
N A A+ 0. 5 mg /L 6-BA。
2　分析方法
2. 1　细胞量的测定: 将培养液于 5 000 r /min转速
下离心 ,收集沉淀的细胞 ,称量其鲜重 ,于 60℃烘干
后 ,称其干重 ,计算出细胞生长率和比生长速率及培
养密度 ;收集上清液 ,测量培养基组成 [3 ]。
2. 2　细胞活性测定:氯化三苯四氮唑还原法 ( T TC
法 )测定 [4 ]。
2. 3　培养液中剩余糖的测定: 采用生物传感仪
测定 [5 ]。
2. 4　培养液中剩余磷的测定:采用钼蓝比色法。
3　实验方案
3. 1　补加碳、磷的实验: 将愈伤组织细胞 ( 13± 1)
g /L接种到装有 50 mL液体培养基的 250 m L摇瓶
中 ,于 100 r /min、 25℃、黑暗条件下培养 ,每一周补
加一次营养成分 ,每瓶补加量均为 5 mL,补加液组
成如表 1所示。培养周期为 20 d。培养过程中每 2天
取 1次样 ,测量其培养液中葡萄糖和无机磷的残留
量、细胞干重及细胞活性。
表 1　补碳、磷实验中添加液成分和浓度 ( g /L)
组别 蔗糖 NaH2 PO4
空白 　 0 　 0
碳源 220 0
磷源 0 1. 65
碳源+ 磷源 220 1. 65
3. 2　补加氮源、碳源的实验: 实验设计方法与补加
碳、磷实验相同 ,其中补加液组成如表 2所示。 培养
过程中每 3天取样 1次 ,测量细胞重量、细胞活性。
表 2　补氮、碳实验中添加液成分和浓度 ( g /L)
组别 蔗糖 ( N H4) 2 SO 4 KNO3 水解酪蛋白
空白 　 0 0 0 0
有机氮 　 0 0 0 30
无机氮 　 0 13. 4 40 0
碳源+ 有机氮 220 0 0 30
4　结果与总结
4. 1　补加碳、磷的实验: 培养过程中取样测量细胞
密度、细胞活力、培养基残糖含量以及培养基中残磷
含量 ,见图 1～ 4。
图 1　细胞干重随时间变化曲线
图 2　细胞活性随时间变化曲线
图 3　培养液中剩余糖含量曲线
·29·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
图 4　培养液中剩余磷含量曲线
4. 1. 1　细胞生长状况:图 1显示同时补加碳和磷的
实验组中细胞量在整个培养周期内保持增长趋势 ,
对照组和补加磷的实验组中细胞在培养第 10天后
基本停止生长 ,而单独补加碳源的实验组虽然在第
10天仍保持继续生长趋势 ,但第 15天后 ,细胞量增
长停滞。
由于红豆杉细胞在碳源丰富的条件下会在细胞
内形成淀粉颗粒 ,作为能源储备 ,而以细胞干重来表
征生物量必然将这种胞内淀粉作为生物量来处理 ,
同时较高浓度的磷抑制这种淀粉形成过程 ,所以在
培养的前 17 d同时补加碳和磷的细胞生长速率低于
单独补加碳的实验结果 ,但在培养 17 d后 ,同时补加
碳和磷的红豆衫细胞继续保持增长 ,而单独补加碳
的细胞生长基本停止。
根据实验中细胞生物量数据 ,可以计算在不同
实验组中的细胞平均生长速率、比生长速率、倍增时
间、生长倍数及干基密度数值 ,见表 3。
表 3　细胞生长统计数据表
组别 生长速率
( g /L· d)
比生长速率
( d- 1)
倍增时间
( d)
干基密度
( g /L)
碳源 　 1. 47 0. 108 11 43
磷源 　 0. 875 0. 062 16 28
碳源+ 磷源 　 1. 73 0. 129 11 48
空白 　 0. 75 0. 056 18 27
4. 1. 2　细胞活性: 从图 2中可以看出 ,在培养的前
10天各组实验中细胞活力基本相同 ,约等于接种时
的细胞活力 ,而在培养的后 10天 ,对照组细胞活力
迅速下降到一个较低的水平 ;单独补加碳的实验组
中细胞活力下降的现象出现在第 15天 ,表明单独补
加碳源 ,可以延续细胞的活力的下降 ,但同样不能在
整个培养周期内保持较高的细胞活力。同时补加碳
和磷的实验组中细胞活力则继续保持在高水平上 ,
没有出现下降。补磷实验结果与对照组结果相似。以
上实验现象说明加碳源可以抑制对照组中第 10天
出现的细胞活力下降 ,但在 15 d后 ,只有同时补加
碳和磷 ,才能维持较高的细胞活力。
4. 1. 3　碳、磷的消耗规律以及补碳对细胞生长的影
响: 从图 3中可见 , B5培养基中的糖在一周左右就
随细胞生长代谢而消耗完毕 ,培养基中基本测不到
残糖的存在。而补加碳源或者同时补加碳、磷 ,可以
引起培养基中碳源含量的周期性阶跃上升 ,然后随
细胞代谢而下降。且同时补加碳、磷实验组中碳的消
耗速率低于单独补加碳源的情况。
残磷的变化规律与残碳基本类似 ,差别是培养
基中磷的消耗速率比碳慢 ,在对照组培养 15 d后 ,磷
含量才下降到初始量的一半以下。
总结以上实验现象 ,可以推测: B5培养基中的
碳源在 1周左右就由于细胞生长代谢而消耗完结 ,
细胞利用胞内储存的淀粉 ,可以继续维持代谢并保
持高的细胞活力到 10 d左右 ; 10 d后 ,由于碳源的缺
乏 ,细胞生物量停止生长 ,细胞活力下降。由于此时
培养基中的磷含量还足够维持细胞生长代谢 ,因此
若通过补加方式 ,提高培养基中的碳源含量 ,可以继
续维持细胞的生长与活力。但在培养 15 d后 ,培养基
中的碳源和磷源的含量都出现缺乏 ,因此必须同时
补加碳和磷才能继续维持细胞的生长与活力。
4. 2　补加氮、碳的实验: 培养过程中取样测量细胞
密度、细胞活力如图 5, 6。
图 5　细胞干重随时间变化曲线
　　细胞生长状况: 图 5显示 ,同时补加碳和氮的实
验组中细胞量在整个培养周期内保持增长趋势 ,对
照组细胞在培养第 10天后基本停止生长。补充有机
氮和无机氮源实验组中的细胞量相似 ,均较对照组
略有增加 ,但不显著 ,在第 10天以后细胞生长也进
入停滞期。
根据实验中细胞生物量数据 ,可以计算在不同
实验组中的细胞平均生长速率、比生长速率、倍增时
间、生长倍数及干基密度数值 ,见表 4。
·30· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
图 6　细胞活性随时间变化曲线
表 4　细胞生长统计数据表
组别 生长速率
( g /L· d)
比生长速率
( d- 1)
倍增时间
( d)
干基密度
( g /L)
有机氮 0. 89 0. 064 14 29
无机氮 0. 79 0. 058 16 28
碳源+ 有机氮 1. 58 0. 117 11 45
空白 0. 74 0. 056 18 26
　　从图 6中可以看出 ,在培养的前 10 d各组实验
中细胞活力基本相同 ,约等于接种时的细胞活力。而
在培养的后 10 d,对照组细胞活力迅速下降到一个
较低的水平 ;补加有机氮与补加无机氮实验组中细
胞变化情况相似 ,活力下降的现象均出现在第 12
天 ,表明单独补加氮源对延缓细胞活力下降的作用
有限。 而同时补加碳氮的实验组中细胞活力则继续
保持在高水平上 ,没有出现下降。补充碳源物质才是
抑制对照组中第 10天出现的细胞活力下降的有效
手段。
　　总结以上实验现象 ,可以推测: 培养 10 d后 , B5
培养基中碳源消耗完毕 ,成为抑制细胞生长与细胞
活力下降的主要原因。而此时培养基中氮源还比较
充分 ,补充有机氮和无机氮对细胞生物量的增加和
维持较高的细胞活性没有显著影响。
5　讨论
在南方红豆杉细胞悬浮培养过程中 , B5培养基
中的各元素基本满足细胞生长需要 ,培养中后期氮
源和磷源仍能满足细胞生长代谢的需要 ,因此补充
氮、磷对细胞生长和细胞活力没有显著影响 ;但碳源
物质却消耗完毕 ,成为制约细胞生长的主要因素 ,所
以补充碳源则可以克服在培养后期培养基中出现的
碳源缺乏现象 ,使细胞维持较高的生长速率和细胞
活性 ,为采用流加的方式进行大规模红豆杉细胞悬
浮培养做了初步的尝试。
参考文献:
[ 1 ]　元英进 ,刘家新 ,卢伟伸 . 大规模细胞培养生产紫杉醇的潜
力 .第九届全国化学工程科技报告会论文集 [C ] . 1998.
[2 ]　 Fet t-Neto A G, Melanson S J, Sakata K, et al . Imp roved
g row th and taxol yield in dev eloping cal li of Ta xus cuspid ata
b y medium composi ti on modif ication [ J] . Bio /Technol , 1993,
11( 6): 731-734.
[ 3 ]　 Fett-Neto A G, Zhang W Y, Dicosmo F. Kin etics of tax ol
production , grow th and nut rien t uptak e in cell s uspensions of
Taxus cuspidata [ J ] . Biotechnolog y and Bioengin eering,
1994, 44( 2) : 205-210.
[ 4 ]　孙敬三 ,桂耀林 .植物细胞工程实验技术 [M ] . 北京: 科学技
术出版社 , 1995.
[ 5 ]　刘家新 . 红豆杉细胞培养 pH值调控与生化反应器操作策略
研究 [D] . 天津大学硕士论文 .
水飞蓟素固体分散体中总黄酮的测定
李凤前 ,胡晋红 ,朱全刚
(第二军医大学长海医院 药学部 ,上海　 200433)
摘　要 :目的　测定水飞蓟素固体分散体制剂中总黄酮。 方法　采用一阶导数紫外分光光度法。 结果　以 1∶ 3,
1∶ 6和 1∶ 9药物 /载体比例处方制成的固体分散体中总黄酮的量分别为 27. 72% 、 15. 59%和 10. 98%。结论　该法
可避开空白 PEG-6000载体对固体分散体中总黄酮测定的干扰 ,操作简便 ,结果准确可靠。
关键词: 水飞蓟素 ;固体分散体 ;黄酮 ;一阶导数紫外分光光度法
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 01 0031 03
Quantitation of flavonoids in s ilymarin loaded solid dispersion system
LI Feng-qian, HU Jin-hong , ZHU Quan-gang
( Depa r tment o f Pha rmaceutical Sciences, Changhai Hospital, Second Milita ry Medica l Univ ersity, Shanghai 200433, China)
·31·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 1期
收稿日期: 2001-03-13作者简介:李凤前 ( 1970～ ) ,男 ,理学博士 ,现于第二军医大学长海医院进行博士后研究 ,研究方向:药物新型给药系统。