全 文 ：1999 年 12月
第 14卷　第 4期
山 东 师 大 学 报(自 然 科 学 版)
Journal of Shandong Normal University(Natural Science)
Dec.1999
Vol.14 No.4
中华补血草和中亚滨藜叶片中盐激
蛋白和 dehydrin的研究＊
王洪燕1)　　刘　箭1)　　石　凤2)
(1)山东师范大学生物学系 , 250014 ,山东济南;　2)山东师范大学测试中心 ,250014 ,山东济南;第一作者 23 岁 ,女 ,硕士研究生)
摘要　应用二相电泳方法 , 分析中华补血草 Limon ium sinensis (Girard.)O.Kuthze.和中亚滨藜 Atrip lex
centralasiatica Iljin这二种典型泌盐植物叶片中的蛋白组成变化 ,发现盐胁迫时 ,二种植物叶片中均有少量的盐激蛋白
出现 ,其中中亚滨藜叶片中的蛋白质组成变化大一些.运用 Western-blot 方法对这二种盐生植物叶片中的 dehydrin
蛋白进行检测 ,结果发现 ,无论是在正常环境下 ,还是高浓度盐渍环境下 ,都未能检测到可提高植物抗盐性的 dehydrin
蛋白.
关键词　中华补血草;　中亚滨藜;　盐激蛋白;　dehydrin
分类号　Q 948.113
盐激蛋白和脱水蛋白 dehydrin ,被认为是形成非盐生植物诱导抗盐性的重要因子之一 ,但对盐
生植物来说 ,还未见这方面的研究报道 ,本研究的主要目的是分析盐激蛋白和 dehydrin 在盐生植
物中的表达.
1　材料和方法
1.1　实验材料　将砂培的中华补血草和中亚滨藜 ,每日用 Hoagland营养液浇灌 ,待植株生长至30
天后 ,用含 0 、100 、200 、和 400 mmol/L NaCl的 Hoag land培养液处理 ,处理 2周后取样.
1.2　蛋白样品的提取　取植物叶片按 1:2的比例加入提取缓冲液(0.7 mol/L 蔗糖 , 0.1 mol/ L
Tris-HCl/pH7.8 ,0.1 mol/L NaCl ,10 mmol/L EDTA ,1 mmol/L PM SF),进行匀浆 ,离心提取上
清液 , 加入等体积水饱和酚溶液 ,充分混合后 ,离心取上清酚相 ,再用等体积的提取液萃取上清酚
相溶液一次 ,在酚相中加入四倍体积的 0.1 mol/ L NH4Ac的甲醇溶液沉淀过夜 ,再洗涤沉淀二次 ,
用-30 ℃丙酮洗涤沉淀二次 ,沉淀风干后即为 2-D电泳和Western-Blot分析用样品.
1.3　2-D 电泳分析　将制备的蛋白质样品用 0.5 ml IEF 样品缓冲液(9.2 mol/L 尿素 ,2%NP-
40 ,1 mol/LDTT ,0.8% pH5-7 Ampholine , 0.8% pH3-9.5 Ampholine , 0.8% pH4-6 Ampho-
line)溶解 ,将电泳样品加在 2.5×100 mm的 IEF 电泳胶上(IEF 电泳胶组成为 T =4%、
C =5.6%的 Acr-Bis ,9.2 mol/L 尿素 , 2%NP -40 , 0.8%pH3-9.5 Ampholine ,0.8%pH5-7
Ampholine ,0.8%pH4-6 Ampholine ,Ampholine为 LKB产品)600V聚焦 24 h , 850 V聚焦 2 h.剥
离 IEF 胶条 ,在平衡缓冲液(125 mmol/ L Tris-HCl , pH6.8 , 2%SDS)中 ,平衡 2 h ,然后在 T =
12.5%的 SDS-PAGE电泳胶上分离 ,分离后的电泳胶进行银染色.
1.4　Western-Blot分析　将制备的样品 ,用 12.5%SDS-PAGE Laemmli的电泳系统进行分离 ,
然后电转移至硝酸纤维素膜上 ,用 BLOTTO溶液(C =5%脱脂奶粉 ,0.5%Tw een-20 , TBS)阻断
＊国家自然科学基金资助项目(39770076)　收稿日期:1998-12-20
30 min ,用 0.5%Tw en20-TBS 洗涤 NC 膜(3×5 min), 用 1/500 的抗玉米 dehydrin 兔血清-
BLOTTO溶液在 4℃温育过夜 ,(抗玉米 dehydrin兔血清是由澳大利亚 CSIRO中心的 M.Roberton
教授提供),将 NC 膜浸入 Biotin-SARIgG 溶液中温育 2 h(Biotin-SARIgG 溶液组成为:1/1000
的Biotin化羊抗兔 IgG-0.1%Tween20-TBS 溶液),然后用 Tween20-TBS 洗涤 NC 膜(3×5
min),用 AP-Avindin溶液(1/1000 AP 标记的 Avindin-1%Tw een20-TBS 溶液)温育 1 h后 ,用
0.1%Tween20-TBS 洗涤 NC膜(4×5 min),将 NC膜在 BCIP-NBT 溶液中显色.
2　实验结果
从 2-D电泳图片(1 ～ 6)上可以看出 ,不论是中华补血草还是滨藜 ,经 100 mmol/ L 最适生长
浓度的 NaCl溶液处理后 ,或用 400 mmol/ L高浓度 NaCl进行更强烈的胁迫处理后 ,植株叶片中均
有一些新的蛋白出现(箭头指),也有一些蛋白消失(三角所指).中华补血草叶片中只有二种低分子
量盐激蛋白出现 ,五种蛋白因盐渍而消失 ,而滨藜则因盐渍有六种盐激蛋白出现 ,一种低分子量蛋
白消失.二者相比 ,中华补血草合成的水溶性盐激蛋白种类较少 ,而滨藜的盐激蛋白种类要多一些.
用抗玉米 dehydrin蛋白的抗血清进行Western-Blot检测 ,结果发现 ,用1 、100 、200和 400 mmol/ L
NaCl处理的滨藜和中华补血草 ,其叶片中均没有 dehydrin的出现(图 7),至少 dehydrin 含量低于
本方法的检测限 ,而在同一 NC 膜上做为参比样品的玉米种子胚蛋白样品则显示出一条 20KD的
Western-Blot阳性杂交反应色带 ,说明分析结果是可靠的.
3　讨　　论
中华补血草中的二种盐激蛋白(图 1 ～ 3左侧箭头指)和滨藜中的二种盐激蛋白(图 4 ～ 6左侧
箭头指),从分子量 、等电点和在电泳图谱中分布位置来判断 ,好似同类型蛋白 ,而滨藜的另四种盐
激蛋白 ,只是出现在高盐胁迫环境之下(图 4 ～ 6右侧箭头所指).因此这二类分别在最佳生长盐环
境下和高度胁迫盐环境下出现的盐激蛋白其生理学功能可能是不同的 ,这在今后的相关研究中应
引起注意.另一值得注意的问题是 ,这两种泌盐植物的水溶性盐激蛋白数量比非盐生植物的盐激蛋
白数量少很多 ,因此 ,我们认为水溶性盐激蛋白对泌盐植物的抗盐能力的形成可能意义不大.
Dehydrin也是水溶性蛋白 ,它属于 LEA蛋白的第二类型 ,主要出现在正常性植物种子和脱水
胁迫的营养组织中 ,是一种脱水诱导性蛋白 ,一般认为 LEA 蛋白(包括 dehydrin)与植物耐脱水性
有关.由于盐胁迫也造成植物脱水 ,因此当非盐生植物受到盐渍时 ,植物组织中常能检测到多种类
型 LEA蛋白 ,而且又有实验证明 ,转 LEA蛋白中的 HVA1基因的水稻幼苗抗盐能力有所提高 ,这
些实验都说明某些 LEA蛋白对非盐生植物抗盐能力的形成有一定的作用 ,但本实验未能在二种泌
盐植物中检测到 dehydrin ,说明 dehydrin不是泌盐植物必具备的抗盐因子.至于第一 、三类型 LEA
蛋白是否存在 ,需要进一步研究.
盐生植物具有较强的抗盐能力 ,其机理应该是多方面的 ,离子在细胞内的区域化 、渗透调节物
的出现和盐腺泌盐应该是主要的机制 ,但对于盐激蛋白在盐生植物中所起的作用过去还没有人研
究和评述 ,而我们的研究只是对水溶性的盐激蛋白和水溶性的 dehydrin进行了初步分析 ,至于盐
渍环境下 ,泌盐植物体内的膜蛋白的变化如何 ,还需进一步研究.
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4　参考文献
1　Hurkman W J , Tanaka C K.Polypept ide Changes Induced by Salt S t ress,Water Defici t and Osmotic St ress in Barley roots:a Com pari-
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2　Willian J H , Cheter S F , Charlene K T .A Comparison of The Ef fect of Salt on Polypeptides and Translatable mRNA in Roots of a S alt
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3　Deping Xu, Xiaolan Duan , Baigang Wang , et al.Expression of LEA Protein Gene , HVAL1 , f rom Barle Tolerance to Water Def icit and
S alt St ress in T ransgenic Rice.Plant physiol , 1996 , 110(1):249～ 257
STUDIESOF SALT STRESS PROTEINS AND DEHYDRIN IN
ATRIPLEX CENTRALASTATICA AND LIMONIUM S INENS IS
Wang Hongyan1)　　Liu Jian1)　　Shi Feng2)
(1)Deptment of Biology , Shandong Normal University , 250014 , Jinan , P R C;
2)Analysis and Testing Center , Shandong Normal University ,250014 , Jinan , P R C)
Abstract　The proteins in the leaves of the two kinds of halophy tes , Atriplex centralasiatica Iljin
and Limonium sinensis(Girard.)O.Kuthze , were analy zed by two -dimension elect rophoresis when
the palnts w ere suf fered f rom salt stress.The results show ed that there were a few of salt stress pro-
teins in the two kinds of halophy tes.By comparison , Atriplex centralasiatica Iljin expressed more salt
stress proteins than Limonium sinensis did.Dehydrin , which could confer salt tolerance to crops , was
not detected in these two kinds of halophytes wi th Western-Blot test ,no mat ter w hether the plants
w ere treated by Hoagland s solution or Hoagland s solution added w ith 100 , 200 , and 400mmol/L Na-
Cl.
Keywords　salt st ress proteins;　 Atriplex centralasiatica Iljin;　Limonium sinensis (Gi-
rard.)O.Kuthze;　dehydrin
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