全 文 ：基金项目:国家中医药管理局科研基金项目(95B026);
上海市教育委员会科研基金项目(95C14)
＊现在上海市中药研究所工作
代谢中间产物和诱导子
对南方红豆杉培养细胞生长和紫杉醇含量的影响
孙彬贤＊　翁颖琦　刘　涤　胡之璧　上海中医药大学中药研究所　(上海　200032)
摘要:以南方红豆杉(Taxus chinensis var .meirei)悬浮细胞为材料 ,利用紫杉醇合成途径中 3-羟基-3-甲基
戊二酸还原酶(HMGR)抑制剂研究其合成途径的多样性 ,以及代谢中间产物( 牛儿醇 , 牛儿 牛儿醇 ,蒎烯 ,
甲瓦龙酸)和诱导子(花生四烯酸 ,茉莉酸甲酯)对培养细胞生长和紫杉醇含量的影响 ,以探讨紫杉醇生物合成
途径人工调控的可能性。结果:从培养细胞生长曲线看 ,细胞干重和紫杉醇含量均在培养第 30 天达到最高 ,
HMGR抑制剂 compactin对紫杉醇生物合成的抑制作用不明显;在培养开始时 ,加入 牛儿 牛儿醇(5mg/ L)能
显著提高紫杉醇含量 , 牛儿醇(10mg/ L)、甲瓦龙酸(100mg/ L)对紫杉醇的合成也有一定的促进作用 , 而蒎烯
(10mg/ L)没有作用;加入花生四烯酸(3.2μmol/ L)和茉莉酸甲酯(100μmol/ L)分别提高紫杉醇含量 1倍和 10
倍。结论:在南方红豆杉培养细胞中 , 紫杉醇生物合成除了经典的乙酸/甲羟戊酸途径外 , 还可能存在其他途
径。加入合适的代谢中间产物的诱导子可以提高植物培养细胞中的紫杉醇含量 , 但由于其生物合成步骤复杂 ,
较早期的代谢中间产物对紫杉醇合成影响较弱。
关键词:南方红豆杉培养细胞;紫杉醇;代谢中间产物;诱导子;代谢调节
中图分类号:R 284　　　文献标识码:A　　　文章编号:1008-861X(2000)03-0054-03
　　紫杉醇是具有抗癌活性的二萜类化合物 ,主要来源于红
豆杉科红豆杉属植物的树皮。由于生长缓慢 , 紫杉醇含量
低 ,资源非常紧张。为解决紫杉醇的来源 , 许多实验室探讨
了利用植物细胞培养方法生产紫杉醇的可能性[ 1] 。随着对
紫杉醇生物合成途径的了解 , 目前除采取筛选合适培养基 、
加入刺激剂 、筛选高产细胞系等来提高培养细胞中紫杉醇的
含量外 ,加入代谢中间产物如苯丙氨酸 、蒎烯 、 牛儿醇等也
是一种常用的方法 ,对提高紫杉醇含量具有一定的作用。本
研究前期已经建立了云南红豆杉(T.yunnanensis)、欧洲红豆
杉(T.baccata)、东北红豆杉(T.caspidata)和南方红豆杉(T.
chinensis var meirei)的悬浮细胞培养系统 , 并比较了四者的生
长和紫杉醇含量的变化[ 2] ,发现南方红豆杉培养细胞的这两
项指标均优于前三种红豆杉。本实验即以南方红豆杉悬浮
细胞为材料 ,利用紫杉醇合成途径中 3-羟基-3-甲基戊
二酸还原酶(HMGR)抑制剂研究其合成途径的多样性 , 以及
代谢中间产物和诱导子对细胞生长和紫杉醇合成的影响 , 并
对紫杉醇生物合成途径和人工代谢调控的可能性进行讨论。
1　材料与方法
1.1　细胞及培养　实验材料为连续培养 6 代以上的南方红
豆杉悬浮细胞系。培养基为 B5+NAA(2mg/ L)+KT(0.2mg/
L), 在 25±2℃和黑暗条件下进行培养 , 摇床速度为 110r/
min , 30天继代一次。
1.2　生长曲线测定　每 5天取样两瓶 , 过滤和冻干细胞后
称干重 , 以 g/L表示细胞生长速度。
1.3　紫杉醇含量(mg/ L)测定　采用笔者以前建立的 HPLC
方法[ 3] 。
1.4　外源物质配制和加入　本实验使用的代谢中间产物 、
诱导子和酶抑制剂均购自 Sigma 公司。 加入培养基前以
0.20μ除菌滤膜除菌 , 并于培养 0 天加入。HMGR 抑制剂
Compactin和等当量 NaOH 混合 , 90 ～ 95℃水浴 30min;代谢中
间产物 牛儿醇 、蒎烯和 牛儿 牛儿醇分别以无水乙醇配
制 ,甲瓦龙酸与等当量KOH 混合;诱导子花生四烯酸和茉莉
酸甲酯用无水乙醇配制成所需要的浓度 。
2　结果
2.1　细胞生长和紫杉醇合成的时间进程　见图 1。
从图 1 可以看出 ,在 40 天培养过程中 ,南方红豆杉培养
细胞生长基本呈“S”曲线。以干重表示的最大细胞生长量出
现在第 30 天 ,以后逐渐下降。而紫杉醇含量的变化基本上
与细胞生长的进程一致 ,即当细胞进入指数生长期时 , 紫杉
醇含量也达到最高值。
2.2　不同剂量 compactin对细胞生长和紫杉醇合成的影响
　见图 2。
　　从图 2 可以看出 , compactin 对南方红豆杉培养细胞的生
长和紫杉醇的合成略有抑制 , 其低剂量(0.01mg/ L)时影响不
明显 ,但当剂量为 0.1mg/ L时 ,使紫杉醇含量降为 0.58mg/ L,
约为空白对照的 70%。
第14卷第 3期
2000年9月
上 海 中 医 药 大 学 学 报
　
ACTA UNIVERSITATIS TRADITIONIS MEDICALIS SINENSIS PHARMACOLOGIAEQUE SHANGHAI
VOL.14 NO.3
Sept., 2000
DOI :10.16306/j.1008-861x.2000.03.019
图 1　细胞生长和紫杉醇合成的时间进程
　　
图 2　不同剂量 compactin对细胞生长和紫杉醇合成的影响
　　
　　图 3　不同代谢中间产物对细胞生长的影响
1: 牛儿醇(10mg/ L)　2: 牛儿 牛儿醇(5mg/ L)
3:蒎烯(10mg/ L)　　　4:甲瓦龙酸(100mg/ L)
　　图4　不同代谢中间产物对培养细胞紫杉醇含量的影响
1:牛儿醇(10mg/ L)　2:牛儿 牛儿醇(5mg/ L)
3:蒎烯(10mg/ L)　　　4:甲瓦龙酸(100mg/ L)
图5　不同浓度花生四烯酸的作用
　　
图6　不同浓度茉莉酸甲酯的作用
2.3　不同代谢中间产物对细胞生长的影响　见图 3。
从图 3 可看出 ,代谢中间产物 牛儿醇 、 牛儿 牛儿
醇 、蒎烯和甲瓦龙酸在合适的浓度对南方红豆杉培养细胞生
长没有明显影响 , 其中蒎烯还有一定促进作用 , 说明这四种
代谢中间产物对细胞生长无毒害作用 ,可以被吸收和利用。
2.4　不同代谢中间产物对培养细胞紫杉醇含量的影响　见
图 4。
从图 4 可以看出 ,在合适的浓度 , 上述四种代谢中间产
物对南方红豆杉培养细胞紫杉醇含量的影响不同。其中 ,
牛儿醇和 牛儿 牛儿醇对紫杉醇含量的促进作用最为明
显 ,分别比空白对照提高了 73%和 91%, 甲瓦龙酸的作用居
中(32%), 而蒎烯基本没有作用。
2.5　不同诱导子对培养细胞生长和紫杉醇含量的影响
2.5.1　不同浓度花生四烯酸的作用　见图 5。
从图 5 可以看出 ,图示的四种浓度花生四烯酸对南方红
豆杉培养细胞生长和紫杉醇含量的影响基本相似 ,即轻微抑
制生长而促进紫杉醇的合成。其中 , 当花生四烯酸浓度为
3.2μmol/L时 , 细胞生长是空白对照的 85%, 而紫杉醇含量
增加 1 倍 ,达到 1.06mg/L。
2.5.2　不同浓度茉莉酸甲酯的作用　见图 6。
从图 6 可以看出 ,图示的四种浓度茉莉酸甲酯虽然均轻
微影响细胞生长 , 但对紫杉醇合成有明显的促进作用。 其
中 , 0 天加入浓度为 100μmol/L茉莉酸甲酯时 , 培养细胞中紫
杉醇含量增加 10 倍 ,达到 5.38mg/L。
3　讨论
HMGR是紫杉醇生物合成途径最重要的早期酶之一 , 它
催化 3-羟基-3-甲基戊二酸 CoA 生成甲羟戊酸 , 虽然该
酶在动物甾体[ 4]和植物倍半萜植保素[ 5]生物合成中具有重
55实验研究
要的调节作用 ,但是也有报道证实在中国红豆杉(T.chinen-
sis)悬浮培养细胞的质体中 , 紫杉醇合成经过丙酮酸/ 3-磷
酸甘油醛※5-P-1-脱氧木酮糖※IPP※FPP※GGPP途径 ,
而不通过经典的乙酸/甲羟戊酸途径形成 IPP ,直至产生紫杉
醇[ 6] 。本实验观察到 , compactin(0.1mg/L)对紫杉醇合成略
有抑制作用 ,而甲瓦龙酸的加入促进作用不明显 , 因此笔者
推测南方红豆杉细胞中紫杉醇的形成除了通过乙酸/甲羟戊
酸外 ,还可能存在丙酮酸/磷酸甘油醛的形成途径。
紫杉醇合成的中间产物 IPP通过异戊二烯转移酶和萜
烯合成酶的作用形成 GPP、FPP、GGPP , 再通过不同程度二级
修饰形成各种不同类型的异戊二烯产物。由于 GGPP 及其
前体GPP在培养介质中不稳定 , 因此常用 牛儿 牛儿醇和
牛儿醇作为其合成前体。本研究提示 ,加入二萜化合物共
同起点GGPP的前体 牛儿醇和 牛儿 牛儿醇 , 紫杉醇含
量分别提高 73%和 91%, 在使用的代谢中间产物中作用最
明显。而蒎烯是单萜类化合物松节油的主要成分 ,其化学结
构与紫杉醇的主核有一定共同处 ,因此被认为是化学合成的
重要来源[ 7] ,但体外加入蒎烯并不促进紫杉醇生物合成。
紫杉醇的合成途径与植保素合成途径有部分重叠 , 因
此 ,诱导子往往能同时刺激它们的合成。如茉莉酸和茉莉酸
甲酯对次生代谢产物合成是一种有效的诱导子 ,对红豆杉培
养细胞中紫杉醇的合成有一定的刺激作用[ 8 , 9] , 本实验也得
到了同样的结果 ,并观察到大剂量的茉莉酸甲酯对细胞生长
也有一定的抑制作用。花生四烯酸对紫杉醇合成也有刺激
作用[ 10] , 本实验也证实在 0 天加入时能促进南方红豆杉培
养细胞中紫杉醇的合成 ,而在培养的第 5、10天加入时 , 则表
现出抑制作用。
目前 ,紫杉醇的生物合成途径研究已取得突破性进展 ,
但如何通过人工调控提高紫杉醇含量还需进一步了解其中
的关键步骤和关键酶。本实验研究结果对于通过加入合适
的代谢中间产物和诱导子以大幅度提高紫杉醇产量提供了
一定的理论依据。
　　参考文献:
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编　辑:任丽娟
收稿日期:1999-09-10
Influence of Metabolic Intermediate
Products on Culture Cell Growth
and Taxol Content of Taxus chinensis
var.mairei
SUN Bin-xian ,WENG Ying-qi LIU Di , HU Zhi-bi
Institute of Chinese Materia Medica ,
Shanghai University of Traditional
Chinese Medicine
Abstract:In order to understand influence of metabolic intermediate
products of geraniol , geranyl geraniol , pinene , and hiochic acid on
culture cell growth and taxol content of Taxus chinensis var , mairei
and to explore the biological synthetic channel and artificial regula-
tion of taxol , suspension cells to Taxus chinensis var.mairei cul-
tured continuously for over six generations were taken as experimen-
tal materials for observation.The results showed that the inhibition
function of HMGR inhibitor , compactin , for biological synthesis of
taxol was not obvious , indicating that beside the channel of typical
acetic acid/methylhydroxyl valeric acid synthesis , there might be
other channels.Judging from the curve line of culture cell growth ,
the dry weight of cells and taxol content reached their peak in the
thirtieth day.After geranyl geraniol(5 mg/L)was added , taxol
content was remarkably increased.There was also certain promoting
function in geraniol(10mg/L)and hiochic acid(100mg/L)for tax-
ol synthesis.But there was no any function in pinene.The findings
indicate that if the proper metabolic intermediate products were
added , it is possible to enhance taxol content in culture cells of the
plants.But due to complicated steps in its biological synthesis , the
influence of the early metabolic intermediate products is compara-
tively slight for taxol synthesis.
Key Words:Taxus chinensis var.mairei , culture cell , taxol ,
metabolic intermediate products , metabolic regulation
56 实验研究