全 文 ：桂扬生河李连叙 p la n t外 , a i . l o g , .c ~
。 ` e a t娜 1 9的 , 2 5 (为 : 1 61~ 生“
芸苔属作物的遗传转化
程振东 卫志明 许智宏(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 2 0 。招 )
C e n e t i e rT a n sf or ma
t i o n of B
r a s i e a C r o p s
O H E N e Z h 。力 - D o gn
,
w班 肋 i we M in g , X U z 址一H 。刀 g (日四叩无成 I二it 响 of 尸乙曲 t 月明似o口夕, 通倪幼妙功妇
刀侧ca, 名爪城 g ha 公 20 0 a2)
提要 本丈主要从转化受体 、 筛选标记和转 化
方法三方面介绍芸苔属植物遗传转化的研究成果及
岌辰方向。
芸苔属 (丑犷创圳幼。 )属于婴粟目 ( R h oe a卜
a l e。 )
、 十字花科 ( o ur c i fe r a e ) , 约有 1 0 0 个
种山。 其中包括许多重要的油料、 饲料和蔬
菜作物。 应用常规方法进行作物育种已经取
得很大成功 , 近期将仍然是一个主要的方法 ,
但它能够利用的种质资源有限。 应用植物基
珍工程技术在理论上应该能够突破物种间的
界限 , 转移有用基因 , 为进一步改 良芸苔属作
物提供新的手段 。 近年来芸苔属作物遗传转
化的研究进展较快 , 现分三个方面介绍于下 。
1
. 转化受体 芸苔属植物遗传 转化的
研究主要是以甘蓝型油菜为试验 材 料 (表 1
和 2 ) 。 花椰菜和黑芥已经能够得到转基 因
植株 〔15, 低 4们 。 白菜型 油菜 (.B ca 州罗` s分菇
别 p . 此 e叮讨。 )和芜臂得到 了 转化的愈伤组
织 tS , “们。 基因受体主要是直接取自植株的组
织块 , 包括无菌苗的下胚轴 、 子叶和茎段以及
大田植株花茎的切段和薄层细胞 。 芸苔属植
物的叶圆片对根癌农杆菌一般比较敏感 , 感
染后不易得到存活的组织〔3] 。 用这些外植体
进行转化比较简便 、 快速 , 但也有不足 , 主要
是 : 第一 , 它们是多细胞结构 , 再生植株可能
是嵌合体 。 这可通过原生质体转化 来解决 6
目前己可从甘蓝型油莱和黑芥的原生质体再
生转基因植株以气纸 ` 1, 4” , 从芜著和 白菜型油
莱再生转化的愈伤组织 c3 ,即 。 第二 , 它们具
二倍染色体 , 外源基因同时插入到同源染色
体相同座位的可能性极小 , 因而转化植株常
常是杂合的 , 后代会发生分离。 如果以单倍
性的细胞或组织为受体 , 再生植株可 以很容
易地经过加倍成为纯合二倍体。 在这方面甘
蓝型油菜已有成功的担道 。 经过与根癌农杆
菌共培养或显微注射 , 小抱子及其培养物产
生的原胚 、 胚均已再生转化植株亡纸叭州 。
值得一提的是小抱子同时具备了单倍体
和单细胞两个特性 , 完全不存在这些问题 。遗
憾的是除了甘蓝型油菜以外 , 其它芸苔属植
物的花粉培养技术还很不成熟。
2
. 筛选标记 在芸苔属植物的遗传转
化中最常用的筛选标记基因仍然是新霉素磷
酸转移酶基因 (N P T 11) 。其次是潮舞素磷酸
转移酶基因山 , 3力和二氢叶酸还原醉基因〔 , 飞
它们分别可以使转化细胞产生对卡那裸 素、
G一 4 1 8、 巴龙霉素等氨基糖昔类抗菌素、 潮霉
素和氨甲喋吟的抗性 。
在用卡那霉素筛选 N P T l 转化体时 , 有
时结果很不理想 。 卫u a 等用根癌农杆菌转化
收稿 1 9 9 1刁 8一 2 6
DOI : 10. 13592 /j . cnki . ppj . 1992. 03. 001
甘蓝型油菜茎的纵切片 , 在选择培养基上根
本分化不出茎芽〔39 1。 hC ar se 七等转化花茎切
段的薄层细胞 , 虽然得到了转化植株 , 但筛选
效果欠佳 1[ 们。 oS hi ed er 实验室转化甘蓝 型
油菜和黑芥的原生质体 , 也没有得到抗性克
隆〔 ls, “幻。 由此可见 , 随着植物材料和转化方
法的不同 , 卡那霉素的筛选效果差异很大 。
就烟草等其它科属的植物而言 , 氯霉素
乙酞转移酶基因 (OA T )也是一个较好的标记
基因。 但在芸苔属植物中 , 目前已测定的植
物材议均含有高水平的内源 OA T 活 性。 它
们分属于八个种 、 十六个品种 , 包括甘蓝型油
菜 、 花椰菜 、 芥莱 (B 口“ 卿日的 、 黑芥等仁1, 1气
o h a er st 等还发现芥菜和甘蓝型油菜含有针
对外源基因表达产生的氯霉素乙酷转移酶的
选择性抑制剂山。 这使 O A T基因的应 用 效
果受到极大的影响。 至今只有一篇文献报道
用极低浓度的氯霉素筛选到 了 一些抗性 植
株 , 但其中只有一半矗真正被转化了的 。而且
在相同条件下 , 对照也熊分化茎芽 〔10] 。
.3 转化方法 可分为农杆菌介导 的转
化和 D N A 直接转化两和。
(1 ) 农杆 菌介导的基因转移 常用于植
物遗传转化的农杆菌有发根农杆菌 (A g r o卜
。 `邵俪。 r 从切夕e 、 砂 和 根 癌农杆菌 (A ·
协饥日户加初秘) 。 它们能分别把 R i 和 T 主质粒
中的一段 D N人 ( T 一D N A )转移并插入到植物
细胞的染色体墓因组中。
芸苔 属 植 物是 农 杆 菌 的 良 好 宿
主 t洲 , : 工气 15, ’ l, 眠纸枷叭 ` , `们 。 不过 , 对于某
些物种 ,例如 ,甘蓝型和白菜型油莱及花椰菜 ,
不同类型的根痛农杆菌菌株转化能力差异较
大 , 一般情况是胭脂碱型恤。碘 1加 e) 强于章
鱼碱型 o( ot p in “ ) 〔l0, 巩巩纸 .a8 翎 。 这种差异
主要是由 T i 质粒 上 的 V幼 区 决定的 , 可能
是因为章鱼碱型 V扮 区基因对这些植物伤口
细胞分泌的信号物质不太敏感〔切。 发根农杆
菌存在类似现象 , 一般是 农杆 碱型 (ag r小
p主n e )强于 甘露 碱型 ( m a n n o p i ne )味碑的 ,
原因可能是被它们转化的植物细胞对生长素
的敏感性不同 st ol 。 因 为 农杆 碱 型 T 一 D N A
中含有生长素合成基因 , 甘露 碱 型 没有仁气
因此也可推测转化细胞中生长素含量的差异
是造成这种现象的原因之一 。
发根农杆菌的一个很大优越性是“ 发根”
基本保持了再生植株的能力 。 但是 T刁N A
基因的表达常常使转化植株表现异常 : 根的
向地性减弱 、 叶片皱缩 、 节间缩短 、 育性降低
甚至丧失 st, , 1, “ .5 ” ” 。 而花椰菜似乎是个例外 ,
大多数转化植株表现正常以的。 总的来说 , 有
关发根农杆菌转化系统的基础研究尚比较肤
浅 , 大大限制了其在遗传转化中的应用 。至今
还没有用发根农杆菌将特定的外源基因导入
芸苔属植物的报道。
外植体与根癌农杆菌共培养是获得转化
植株的主要途径 (表 l) 。 我们发现头抱霉素
和狡节青霉素都能抑制根癌农杆菌的生 长 ,
但前者对甘蓝型油莱组织块的芽分化同时有
抑制作用 , 后者则有促进作用。 O h ar . t 和 D 6
lB 佣k 观察到 类 似 的 现 象 仁10, 生目。 过去 的
报 道 绝 大 多 数 是 用 狡 节 青 霉 素 完 成
的以 0, 1氏 1 7, 8O, “ 1, 89, 机均 。 因此我们现在倾向于
使用狡节青霉素 , 必要时可附加低浓度的头
抱霉素。
通过原生质体与根癌农杆菌共培养已在
甘蓝型油菜和黑芥得到了转基因植株 咖 , `飞
白菜型油菜得到了转化的愈伤组织 t as] 。 研究
发现 , 加入根癌农杆菌的最佳时间随物种的
不同而有差异。 甘蓝型油菜与烟草相似是在
原生质体开始培养后第三天 [’ ” 。 白菜型油菜
则在开始培养时立即加入为好 , 这可能是因
为其原生质体分裂开始得较早仁38, 。 一般认为
在原生质体开始第一次分裂时加入比较容易
发生转化仁l0, 兀叨。
( 2 ) 直接基因转移 直接基因转移不受
宿主范围的 限制 , 也勿须使 用特 定 的载
体19t , 吸幻 。 在芸苔属植物上取得成功的方法有
三种 (表 2 ) 。
一 1 62
-
表 l 根痛农杆菌的感染和转基因植株的再生
物 种 转 化 受 体 参考文献
加71 045盯肚妞2甘蓝型油菜 (B . 哪少哪) 茎纵切片
花茎切段
花茎薄层细胞
下胚轴
子叶
小抱子
花粉胚
花椰菜
(B
.
o扮娜a 甲a r. 西o t 护班幼)
黑芥 (B j 感夕俨口 )
原生质体
下胚轴
转化频率份
1 0% e
7% C
习% d
2
.
5肠G
3 9% d
5 5% e
口 X 1 0一 ` b
2
.
9 X 1 0
一 s b
石 X 1 0一 s b
8
.
2 一 8 K 1 0峭 吕
3 0% d
原生质体 6 . 8% 0
. 转化频率采用经培养能够产生抗性愈伤组织 (a) 、 胚 ( ) b或转化芽 (的 、 植株 (哟的基因受体所占的百分比表示 , 或者
用在没有选择压力的条件下再生的愈伤组织中真正被转化者所占的百分比 (e) 表示
表 2
物 种
外源基因对芸答属植物的直接转化
转化方法 结 参考文献
189肚的招部6甘蓝型油菜
切 冲p姗)
黑芥 ( B确感卯。 )
基因受体
原生质体
原生质体
原生质休
原生质休
花粉胚
原生质休
P E G
P E G
电击
显微注射
显微注射
P E G
愈伤组织
植株
植株
愈伤组织
植株
愈伤组织
芜普
(B
· 拍饥乡es t八召
原生质体 P E G 愈伤组织
v a r
. 护口 p d )
, . . . . . .
.
曰 . . . .
~
P E G 法不需要特定的仪器设备 , 结果也
比较稳定。 应用这种方法已从甘蓝型油莱原
生质体再生转基因植株 , 从黑芥和芜著原生
质体再生转化的愈伤组织邸 ,生。 ·戮闭 。 K o hl er
等发现如果在转化处理后用低剂量 的 X 一射
线照射原生质体可以把转化频率提 高 3~ 6
倍 。 他们推测是因为 X 一射线造成细胞基 因
组的损伤 , 从而诱导了 D N A 修复机制 , 增加
了外源基因插入的可能性 〔蝴。
1 9 8 7 年 , G u e r o h 。 等用 电击法转化 了 甘
蓝型油菜。 他们共处理 了 4 丫 1e0 个原 生 质
体 , 筛选到 匀1 个抗性克隆 , 最终仅分化出两
个转化植株。 形态 和 育性 都完全 正 常〔伙
O h a p el 等用瞬间表达系统研究发现 , 如果加
细胞壁形成抑制剂 ( 2 , 6一记h l o r卜b e n ` o n i七·
rj le )到培养基中 , 使细胞处于原生质体状态 , J
那 么培养三天后进行转化比立 即转化效率高
1 0 0 0 倍。 他们推测有两个原因 : ① 核膜崩 ,
解 , D N A 易于进入核内。 ② 原生质体脱分
化 , 翻译活动比较旺盛 , lO ;
显微注射法不受细胞壁的限制 , 转化效
率比较高 , 并且不需要特定的选择系统 , 这在
应用上颇具意义〔加 J。 eR 沁h 等在无选择压力
的情况下得到的愈伤组织 中转化 者 占脚多
~ 6 6 % 「29 〕。 N e u 五a u s 等把外源基因注射到十
二细胞时期花粉胚的每个翻胞中 , 再生植株
1 6 3
中有一半被转化了。代 当然这一方法需以精
细的显微操作技术和细胞低密度 培养为基
础 , 目前应用范围有限 。
除此之外 , 还有一些方法正在发展 中。
W e b er 等用一个持续 15 n 。 的激光 脉冲 就
能在甘蓝型油菜的细胞壁 (包括花粉壁 ) 、 细
胞膜和叶绿体外膜上穿一小孔 , 外源 D N A
可以由此流入到细胞或细胞器内部 , 并且这
一处理对细胞的分裂能力和叶绿体的光合能
力影响较小 r48 , ` ,ol H u跳协 i n 等用脂质 体法
成功地把花椰菜花叶病毒导入到芜普原生质
体中山 J, 说明类似的方法也可用来导入外源
基因。
综上所述 , 转化系统已在部分芸苔属植
物上建立起来。 但从总体上看 , 转化效率仍
然不高 , 结果也不太稳定 , 尤其是转化成功的
植物材料太少 , 主要限于甘蓝型油菜的个别
品种。 逐步解决这些间题应该成为今后工作
的重点。
参 考 文 献
1 贾士荣 、 杨美珠 , 植物生班学通讯 19翻8 , 均 : 7 ·
2 何玉科 , 西北 农业 大今学报 1 9 5 9 , 17 (4) : 1 .
3 何玉科 , 生物工程学报 1 9 90 , . ( 2 ) : 1加 .
4 何玉科 , 西北 农业 大学学报 1 99 0 , 1 8 ( 2 ) : 1 8 .
5 蒋兴郁等 . 科学通报 19 8 4 , 1东 81 4
6 蒋兴邻等 , 遗伶李报 1朋 6 , 13 (1 ) : 盛3 .
7 aB l az
s E
,
oB
n D e v i l lo J M
. 月翻考l反翻娜 1 9 8 7 , 助:
6 5
-
S B仕 ot A M e t ` . 尸如时 几 ,殉弓刀众把彻仍 . 1 9 8 7, 肠三
82 .3
9 o h a护 I M , G l i口 e l五仙 K . 八曲君eC 乙乙五娜冲枯 1 0 9 0 , ,
1 0 5
.
1 0 o h a r e a t P J 时 因 . T加Of 刁酗 G湘考. 1 9 8 8 , 铭 : 4 8 .
U 口助。 e t 卫 J e t 心 、 尸如心 山尽及叨分幼 1 9 89 , 7 : 6 2 8 .
1 5 伪 a了时 P J e君国 · 只曲名山召 且叩汾坛 1 0 8 9 , 8 : 30 3 .
1 8 D a v id O, 肠功钾 J . 尸如 ” 云 C崛王丑叻分坛 1 9 88, 7 , 8 8
1’ I冶 O le ne 域 工沁助 y J . T he B璐潮感`画 丑“ 翻幼功 7份
臼: 3 8么
1 5 eD B IOC 互 M 6t 璐
. 月如云尸习沁奴 1 9 8 9 , . 1 : 6 9 4 .
1 6 P ar 拍v 丑 T e“ . 2铂时 卫` 。侧沼。犷 刀么硕刀 I Q8 4 ,
3 : 3 7 1
.
17 卜 y J 时 成 . 尸公价忿`协2乙丑明州召加盯 , 长 3肚 .
1 8 G o 1Z C o t 国 . 玩 P u i et K J 口“ (e卿 , P : 叱乒创拍 组
.
1似 .
P h 时 R Ot oP l as t eR跳 r e h 19 8 8 , P . 3 5 3 ·
1 9 G七场 O时 璐 . 尸如 ” 公 万。乙口州分 B初乙叩到 1 9 9 0 , 1决
4 7 5
-
即 G u e r o五e P 时司 . 翻口耐 S川切” c 口 1 9 87 , 驰: U l .
2 1 G ue 那五e P 口 t 璐 . 肚碗 口翻 G e解 t 1 9 8 7 , 盆佣: 3 8 2 .
朋 H a印咖r M E e亡画 . 肚山 G城 G姗 t 1 9 8 8 , 2 1 , : 1 8 2 ,
2 8 H o l br o k L A
,
M止 1 B L . 尸卜时 伪召 五 d夕分翻 1 9 8 5卜
吸 3 9 9 .
24 H
u旧日a in MM 时 成 . 尸如心 eC 双丑。尹时 . 19 85 , 心 侧 .
那 J o似n i n L 时 哪 . 肚哪 G . G娜公1 9 8 7 , 2佣 : 3 8 7 .
邵 K o 日 e r F et 醉 , 尸肠切云卫山` 闷盯 刀初如夕夕 19 8 9 , 挂 ,
1 8 9
.
2 7 M
a r
ot
n L e t 心 . 刀时` 护口 1 9 7 9 , 2竹 : 1含9 .
2 8 M时加 w a V H 日t 成 . 尸勿月君8 件` 月` 口 1 9 8 5 , 3 , : 4 9 .
即 M通 i B L et 公 . 加 G珊朋 OE et 时 (e da ) , lP 幼七
T i8 8 u e a n d 伪11 o u lt u l . . A玩 n R . L i . , I加 . , 卫抽 ,
y 。众 . 1 9 8 7, p . 4 35 ·
即 M加ar 5, 3纽 a ln u L . T彻 of 次四 2 G e舶 t 1 9 8 9, 7 8
161
。
31 M
o lo 刀 e y M M e t 画 . 月朋云 C礴Z 刀即汾坛 1 9 8 9 , 8 , 1
邵&
8 2 N
e u h a u s G 时 璐 . r he 汁 咸卯2口`加名. 1 9 8 7 , 乃: 吕。 .
3 3 o h ls so n M
, 习 r选卿 n T . H e仰成亡留 1 9 8 8 , 108 , 1 7 3 .
触 O n d功 j M . 及O匆 g勿 尺曲 t即 “饥 ( P r a h a ) 1 9 8 3 , 玛 t
3 8 7
.
肠 0她 s e e云改 . r 加即 . 减即 Z, G淞 t . 1 9 8 5 , 7 1: 32 5 .舫 P期Z k o w . k i J e云心 . 尸乙。 刀云肚。乙e c川时 B初如 g夕 加8 6 ,
. : 3 0 3
.
3 7 P
e C h a n P M
. 月伽 t C e Z不五即伴幼 1 9 8 9 , 8 : 3 87 .
38 eP t王t A e t 画
. 山陌2召战 口姗 t 1 98 3 , 1 , 0: 2 0 4 .
加 P au E O时 心 . 压 o/ 全叱枷成。夕夕 19 8 7 , 息 81 5 .
如 凡记 k o S E 时 心 . 全h e汾 左州 G阳 t · 1 9 8 8 , 招 , 68 5 .
且 日巨C r l日 t a n M D 时 心 . 加 卫 u彻 K J et ` . <改加 ):
P r o g r翎 主n P】a 刀 t P r o t o aP凤助眺加五. 1 9 8 8, P .肚 .
妇 日以C rj s at 刀 M D 时 哪 · 全he 眯 』州 G姗忿 198 9 , 7十
1 9连-
盛3 aS u l MW 以 心 . 尸知心 几州成 习众褚彻协 . 1 9 8 7 , 那 ,
3 61
.
4 4 巴r i , a 协 v a e ` 成 . 刃趾价考eC l云五叩汾 苦` 1朋 8, 卜 石0 4 .
拐 S aw卿 n E B, rE 宜C如犯 n L R . 全触冲。 却蟀 G姗云1口 8口卜
铭 ; 8 31 ·
幼 吸刀 a k a N 口考成 . 卫乙。 . 公 C日艺丑列男冲考召 1 9 8 5, 4 , 7 4 ·
4 7 处。哪众 J E , H a主刀 B . 刀知协云C碗 Z 丑归夕劳 t a 19 9 0 , , 于
邵 .3
妞 W e肠犷 口 et 呜 . 刀姗勿卿山 J口哪 , 盼 of eC 犯 及况勿沙·
19 8 9
, 臼: 73 .
妇 W e加丈 G 时 成 . 卫乙a 耐 Oe 称, T伽助 , 助d o 叨助 C议 t毋巴
功8 , 珍: 肚 9 .
印 W e n H u i s加 n et 璐 . 尸找沁 N a t Z 刁`叼 召时 孙名3
1 9 8 8
,
8写: 3红 7 .