全 文 ：植
A c t a
物 学 报 1 9 9 3 , 3 5 ( 1 0 ) : 7 3 3一 7 3 8
B o t a n i ca S in i c a
紫菜苔花粉超低温保存及其原生质体分离 `
` 梁 立 ` 徐秉芳 2 郑从义 ` 周 嫦
, (武汉大学生命科学学院植物生殖生物学研究室 ,武汉 4 3 。。 7 2)
“ (中国典型培养物保藏中心 ,武汉 4 3 0 0 7 2)
摘 要
研究了紫菜苔 ( B ar 骊ca ` a mP es 沉: va r . p ur uP er a) 花粉超低温保存的影响因素 : 花粉发育
时期 ,冰冻保护剂与降温程序 。 建立了较适宜的保存流程 。 保存 60 、 90 天期间 ,成熟花粉与近
成熟花粉生活力保持不变 ,幼嫩花粉生活力稍有下降 。 前二者与后者相对存活率分别达 91 %
与 84 %左右 。 保存的和新鲜的幼嫩花粉经培养均能诱导脱分化 、 发生细胞分裂 。 改进和简化
了紫菜苔成熟花粉原生质体分离技术 ,并在其幼嫩花粉原生质体分离上取得成功 。 保存的成
熟花粉化冻后直接酶解 ,原生质体分离率达 7 . 4% ;幼嫩花粉在化冻后需经过温育 , 才能获
得和新鲜花粉近似的原生质体分离率 (3 5 . 9% ) 。
关祖词 超低温保存 ;花粉 ;花粉原生质体 ; 紫菜苔
P O L L E N C R Y O P R E S E R V A T I O N A N D P O L L E N
P R O T O P L A S T I S O L A T I O N I N B R A S S I C A
C A M P E S T R I S V A R
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Z h e n g C o n g
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( aL 加 ar t 。理 of P l a , t R eP r o d u ct i v e B lOI o g ) , C d l l咭 e of L ife s e i , c e , W “ ha n U n *` sr iyt , W u h a n 4 3o 0 7 2 )
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A b s t r a e t
T h e a u t h o r s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e f a e t o r s a f f e e t i n g p o l l e n e r y o p r e s e r v a t i o n i n B -r
a s s ic a c a l ” P e s ir s v a r
.
P u rP
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p or e e s s o f f r e e z i n g
.
A s u i t a b l e p r o e e d u r e w a s e s t a b l i s h e d a s f o l l o w s
:
P o l l e n g r a in s s u s p
-
e n d e d i n B S m e d i u m 。 o n t a i n i n g 1 0% D M S O a n d 1 5 % s u e r o s e w e r e f r o z e n b y a t h r e e -
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目~ ~一卜一 4 0℃ , s t a n d i n g f o r l
收稿日期 : 1 9 9 3一 0 5一 3 0 接受日期 : 2 9 9 3一 04一 2 8
在花粉超低温保存工作中得到了中国典型培养物保藏中心屈三甫同志的大力帮助 ,特此表示感谢 。
国家自然科学基金资助项目 。
7 4 3植 物 学 报 5 3卷
hr ~ l iq
uid n i tr o ge n ) a n d l a te r tha w e d in 0 4℃ w a te r b a th. D ur in ga p e r io d o f 6 0 , 90
d a y s
’
p r e s e r v a t i o n
,
t h e r e l a t i v e s u r v i v a l P e r e e n t a g e o f m a t u r e ( a t t h e d a y o f a n t h e s i s ) a n d
n e a r ly m a t u r e ( 2 d a y s b e f o r e a n t h e s i s
,
t r i n u e l e a t e s t a g e ) p o l l e n s m a i n t a i n e d a t e a
.
9 1%
;
t h a t o f y o u n g p o l l e n s ( 7一 8 d a y s b e f o r e a n t h e s i s , l a t e u n i n u e l e a t e s t a g e t o e a r ly b i n u c l e -
a t e s t a g e ) s l i g h t ly d e e l i n e d f r o m t h e o r i g i n a l 9 1
.
6% t o 8 4
.
3写 . C u l t u r e . e x p e r im e n t s h o -
w e d t h a t t h e e r y o p r e s e r v e d y o u n g p o l l e n e o u ld b e i n d u e e d t o e e l l d i v i s i o n ju s t a s w e l l a s
t h e f r e s h p o l l e n
.
T h e m e t h o d o f i s o l a t i n g p r o t o p l a s t s f r o m f r e s h m a t u r e p o l l e n d e v e l o
-
p e d p r e v i o u s ly w a s im p r o v e d a n d s im p l i f i e d
.
A s a r e s u l t
, p r o t o P l a s t s w e r e i s o la t e d m o r e
e o n v e n i e n t l y f r o m m a t u r e p o l l e n a n d y o u n g p o l l e n f o r t h e f i r s t t im e
.
T h e p r o t o P l a s t s
f r o m e r y o p r e s e r v e d m a t u r e a n d y o u n g p o l l e n e o u ld b e o b t a i n e d a s w e l l w i t h a n i s o l a t i o n
r a t e o f 7 7
.
4%
a n d 3 5
.
9%
r e s p e e t i v e l y
.
H o w e v e r
,
f o r i s o l a t io n o f p r o t o p l a s t s f r o m p r e s
-
e r v e d y o u n g p o l l e n
, a n i n e u b a t i o n i n N L N m e d i u m a t 3 5 ℃ a f t e r t h a w i n g w a s n e e e s s a r y .
K e y w o r d s C r y o p r e s e r v a t i o n ; P o l l e n ; P o l l e n p r o t o p l a s t ; B ar s s ic a c泛mP e s t ir s v a r
.
P u rP
u
er
a
超低温保存作为现代种质保存技术 ,在植物的多种营养器官 、组织 、 细胞和原生质体
方 面获得成功 5[, `幻 。 在花粉方面 , 已对 30 余种植物作 了成熟花粉超低温保存的研
究 [’, 8 , ` ’ 〕 。 随着花药与花粉培养及其在育种中应用 日益发展 , 幼嫩花粉的保存亦已开始 。
玩 ja j ( 1 9 7 5 ) 〔` 〕作了几种植物花药的超低温保存 。 C h a r n e 等 ( 2 9 5 5 )研究了甘蓝型油菜 (刀-r
as sl’ ca n aP “ : ) 游离小泡子的超低温保存川 。 当前 , 花粉原 生质体分离取得重要 进
展〔`一 ’ , ` ” · ` 3〕 ,这使花粉的保存有了新的研究与应用价值 。 本文的目的是研究紫菜苔不同发
育时期花粉的超低温保存以及由新鲜和保存的花粉分离原生质体 。
材 料 和 方 法
(一 )试验材料
供试材料为紫菜苔 ( B ar s i ca ca mP es t ir 、 va r . P u rP u er a) 。 选用 3 个发育时期的花粉 :
幼嫩花粉 (开花前 7一 8 天 ,单核后期至二核早期 ) , 近成熟花粉 (开花前 2 天 ,三核期 )和成
熟花粉 (开花当天 ) 。
(二 )超低温保存
1
. 冰冻保护剂预处理 在含 15 %蔗糖的 B S 培养基中压出花粉 , 4 0 目不锈钢网过
滤 ,离心 , 去上清液 , 置 4℃冰箱中 ,待温度恒定 ,加入预冷至 4 ℃的冰冻保护剂 (成分见实
验结果 ) 。
2
. 降温 将花粉悬浮液转入塑料小管 ( B i o 一 F r e e ez MT V ia l s C o s t a r C o . U S A ) ,置程序
降温仪 ( K r y o 1 0一 1 . 7 , p l a n e r p r o d u e t s L t d . , E n g l a n d )内 , 由微机控制降温速度与程序进
行降温 ,然后将小管置液氮中保存 。 试验了两种降温程序 : 二步法 (由 o ℃以一 1℃ /分的速
度降至一 40 ℃ ,停留 60 分钟 , 入液氮 ) ;三步法 ( 由 。 ℃以一 1℃ /分的速度先降至一 10 ℃ ,
停留 15 分钟 ,以相同速度降至一 40 ℃ ,停留 60 分钟 , 入液氮 ) 。
1 0期 梁 立等 : 紫菜苔花粉超低温保存及其原生质体分离
3
. 化冻与洗涤 由液氮取出塑料小管 ,在 40 ℃恒温水浴内迅速化冻 。 用 B 、 培养基离
心洗涤 2 次 。
(三 )花粉生活力测定
用荧光素二醋酸醋 ( F D A 50 拼g /m l) 染色 ,统计生活花粉的比率 。 用相对存活率 (保存
后与保存前生活花粉的百分比 )分析保存效果 。 用 Ol y m uP s IM T 一 2 倒置显微镜的荧光显
微装置摄影 。
(四 )幼墩花粉培养
参考 H ua n g 等 ( 1 9 8 9) 的油菜小抱子培养方法 s[] ,将花粉在含 13 %蔗糖的 N L N 培养
基中 , 35 ℃ 、 黑暗条件下培养 4 天 ,再转入 25 ℃黑暗培养 。
(五 )花粉原生质体分离
花粉置于酶液 l( %纤维素酶 、 1%果胶酶 、 0 . 1写 P ec ot l y as e Y 一 2 3 、 0 . 5%葡聚糖硫酸
钾 、 0 . s m ol / L 甘露醇 、 0 . 4m ol / L 山梨醇与 C PW 液 )中 ,在 25 一 30 ℃下酶解 2一 4 小时 。 保
存花粉分离原生质体前先经化冻 、洗涤 。 保存的幼嫩花粉试验了 3 种处理 ,详见 “ 实验结
果 ” 。
实 验 结 果
(一 )花粉超低温保存
1
. 花粉发育时期的影响 作了 3 种不同发育时期花粉的比较 (表 1 ) 。 总的看来 ,成熟
花粉的保存效果较好 ,近成熟花粉与之相近 ,幼嫩花粉较差 。不仅如此 ,幼嫩花粉对保存条
件比前两者敏感 ,只在适宜条件下才有好的保存效果 。 如 8种不同处理中 ,保存的成熟与
近成熟花粉的相对存活率变动在 75 . 8写一 1 0 . 0写之间 , 而幼嫩花粉则变动在 46 . 2%一
96
.
4%之间。 图版 I 图 1一 4 分别示保存花粉群体的生活状态 。
2
. 冰冻保护剂中蔗糖浓度的影响 冰冻保护剂的基本成分为 B 。 培养基 、 10 肠 D M -
5 0 和蔗糖 。 其中蔗糖浓度对保存效果有明显影响 。 在 “ 二步法 ” 降温程序中 , 比较了 5 种
蔗糖浓度 (% ) : 1 0 、 1 5 、 20 、 25 和 30 。 花粉保存效果随蔗糖浓度的提高达到一个最高值后下
降 。 成熟与近成熟花粉以 巧%蔗糖最好 ;幼嫩花粉以 20 %蔗糖最好 。 在 “ 三步法 ”降温程
序中 ,进一步比较 1 5% 、 20 写和 25 %三种蔗糖振度的效果 , 结果 3 个发育时期的花粉均以
15 %蔗糖为佳 (表 1 ) 。
3
. 降温程序的影响 比较了两种降温程序的效果 。结果表明 , “ 三步法 ” 比“ 二步法 ” 的
效果显著 (表 1 ) 。 以幼嫩花粉为例 , 同为 15 % 一 25 %蔗糖条件下 , “ 三步法 ” 的相对存活率
为 87 . 4 % 一 96 . 4% ,而 “ 二步法 ” 仅为 “ . 2%一 79 . 4% 。 成熟与近成熟花粉也是 “ 三步法 ”
优于 “ 二步法 ” 。
4
. 保存时间 根据上述实验结果 , 以 10 % D M SO 、 15 %蔗糖 , B S 培养基作保护剂 , 采
取 “ 三步法 ” 程序降温 ,在液氮中长期保存 ,然后定期取样检查 (表 2 ) 。 成熟与近成熟花粉
在保存 60 、 90 天期间 ,生活力保持不变 ,相对存活率均达到 90 % 以上 。 幼嫩花粉在保存 30
天后生活力有所下降 ,但此后变化不大 , 90 天时的相对存活率仍达 84 . 3% 。
5
. 幼嫩花粉培养 将新鲜与保存的幼嫩花粉进行初步培养试验 。 培养 2一 3 天后 ,有
些花粉能分裂 1一 2 次 ,形成 2一 4 个细胞 ( 图版 I , 7 ) 。 新鲜花粉与保存花粉培养结果相
植 物 学 3 5卷
近 ,表明幼嫩花粉经超低温保存后仍具有脱分化能力 。
衰 l 影响花粉保存的因素 `
T a b l e 1 F a e t o r s a f f e e t i n g th e p o lle n s u r v i v a l
降 温 冰冻保护剂中 保 存 花 粉
程 序 蔗糖浓度 (% ) C r y o P r e s e r v e d P o ll e n
斤 e e z in g S u e r o s e e o n e e n t r a t i o n
P r o e e d u r e o f e r y o p r o t e e t a n t ( % ) 生 活 率 ( % ) 相 对 存 活 率 ( % )
V i a b i l i t y (% ) R e la t i v e s u r v i v a l p e cr e n t a g e
幼嫩花粉 近成熟花粉 成熟花粉 幼嫩花粉 近成熟花粉 成熟花粉
Y o u n g N e a r l y m a t u r e M a t u r e Y o u n g N e a lr y ma t
u r e M a t u r e
P o l le n p o l l e n P o ll e n P o ll e n p o l le n P o lle n
二步法 l 0 3 9 . 9 7 3 。 4 70 . 0 4 6 2 8 4 。 3 8 9 。 9
T w o
一 s t e P l 5 5 5 4 8 0
.
7 8 4
。
0 6 5
.
2 9 3
。
8 9 6
。
5
r n e th o d 2 0 6 7
.
0 7 3
.
0 7 9
。
0 7 9
。
4 8 2
.
6 94
.
6
2 5 6 4 8 6 7
。
0 7 1
。
4 7 5
.
3 7 5
.
8 9 0
.
9
3 0 4 4
.
8 6 5
.
9 6 2
.
5 5 2
。
5 79
.
3 7 5
.
8
三步法 l 5 7 8。 0 8 9 . 0 8 9。 9 96 . 4 10 0 . 0 9 8 . 1
T h r e e
一 s t e P 2 0 7 6
.
6 8 0
.
9 8 5
.
4 92
.
8 93
。
2 9 4
.
9
r n e t h o d 2 5 7 2
。
6 7 8
。
2 8 3
.
3 8 7
.
4 94
。
1 9 2
.
5
` 保存时间 : l 天 。 每个处理观察花粉数均在 2 0 个以上 .
T ime
o f e r y o p r e s e r v a t i o n
:
1 d a y
.
T h e n u m b e r o f o b s e r v e d p o ll e n g r a in s 15 a b o v e 2 0 0 in e a e h t er
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.
表 2 保存时间对花粉存活的影响 ’
T a b l e 2 E ff e e t o f e r y o p r e s e r v a t i o n t im e o n p o ll e n s u r v i v a l
保 存 时 间 保 存 花 粉
D u r a t i o n o f C r y o P r e s e r v e d P o ll e n
c r y o P r e s e r v a t io n
( d a y ) 生 活 率 相 对 存 活 率
S u r v i v a l ( % ) R e l a t i v e s u r v i v a l p e r e e n t a g e ( % )
幼嫩花粉 近成熟花粉 成熟花粉 幼嫩花粉 近成熟花粉 成熟花粉
Y o u n g N e a r ly m a t u r e M a t u r e Y o u n g N e a r l y ma
t u r e M a t u r e
p o l le n p o lle n P o lle n Po lle n OP ll
e n
OP ll
e n
5 8 1
.
2 8 3
.
6 8 2
.
6 9 1
.
6 9 1
.
4 9 1
.
8
3 0 7 6
.
5 8 3
。
8 8 2
.
2 8 6
.
3 9 1
.
6 9 1
.
3
6 0 7 5
.
8 8 3
.
3 8 2
.
3 8 5
.
6 9 1
。
0 9 1
.
4
9 0 74
.
8 8 3
。
8 8 4
.
3 9 1
.
6
. 每个处理观察花粉数均在 2 0 个以上 。
T h e n u m b e r o f o b s e r v e d p o l le n g r a in s 15 a b o v e 2 0 0 in e a e h t r e a t m e n t
.
(二 )花粉原生质体分离
1
. 成熟花粉原生质体分离 用本文技术将花粉直接酶解 , 一步完成原生质体分离 ,取
得很好的结果 。 新鲜花粉原生质体分离率可达 90 . 3% ;超低温保存花粉原生质体分离率
为 7 . 4肠 (图版 I , 5 、 8一 1 1 ) , 比新鲜花粉的效果有所下降 (表 3) 。
2
. 幼嫩花粉原生质体分离 幼嫩花粉原生质体的分离比较困难 。 用同上方法酶解新
鲜的幼嫩花粉 ,原生质体分离率为 32 . 2写 。 保存花粉经化冻 、 洗涤后直接酶解 , 分离原生
质体的效果不佳 。 为改进技术 , 作了 3 种试验 。 花粉化冻 、 洗涤后 : ( 1) 直接酶解 (对照 ) ;
( 2) 在含 13 %蔗糖的 B S 培养基中 25 ℃温育 20 小时酶解 ; ( 3) 在 13 %蔗糖的 N L N 培养基
中 3 5℃温育 9 小时后酶解 。 结果表明 ,试验 ( 3) 的花粉原生质体分离率达 35 . 9% (图版 工 ,
6 )
, 与新鲜花粉的分离效果类同 (表 3 ) 。 而试验 ( 1) 与 ( 2) 的分离率仅 10 . 1%和 14 . 9% 。 此
外 , 用试验 (2 ) 、 (3 )的方法处理新鲜花粉 ,对原生质体分离则无明显影响 。
10 期 梁 立等 : 紫菜苔花粉超低温保存及其原生质体分离
表 3新鲜花粉与保存花粉原生质体的分离
Ta b l
e 3I so l a tio n o fp ro to p la st s fo rm fe r sh a n d e ry o p e e r sv re d p o lle n ga rin s
材 料 幼 嫩 花 粉 成 熟 花 粉
Ma te ri a l Yo un P go lle n Ma tu re P o ll e n
观察花粉数 花粉原生质体 观察花粉数 花粉原生质体
P o lle n gra in sP o lle n p o r to P l a stP o ll e n ga rin sP o l le n p o r to Pl a st
o b e v r se d o b se rv e d数 量 分 离 率 数 量 分 离 率
N um b e r P e e e rn ta ge ( %) N
um b
e r P e re e n ta ge ( %)
新鲜花粉 4 41 1 4 3 2 2. 3 2 26 1 9 0 3 2. 3
F e r sh p o l le n
保存花粉 27 6 9 9 5 3. 9 248 1 9 27 7 。 4
C ry o p e r se v re dQ
lle n
讨 论
花粉超低温保存的研究集中在成熟花粉方面5[, “ 〕 ,而在未成熟花粉方面的工作几近
空白 。 就我们所知 ,迄今仅有 C h ar en 等 ( 1 98 8 )川关于甘蓝型油菜小抱子超低温保存的报
道 。其结果表明 , 保存花粉能保持胚胎发生与植株再生能力 ,但生活力显著下降 ,相对存活
率仅 4%一 10 % 。 本文研究了紫菜苔花粉的超低温保存及其影响因素 ,建立了较适宜的保
存流程 。 不同发育时期的花粉经保存后 , 相对存活率可达 90 %以上 。
多种植物材料的研究表明 ,影响因素的调节是超低温保存成败的关键 5[, `幻 。 就紫菜苔
花粉而言 ,花粉发育时期是重要的内在因素 , 成熟与近成熟花粉对保存条件的适应能力较
宽 ,存活率高 ;幼嫩花粉对保存条件敏感 ,存活率因条件变化而波动 。幼嫩花粉处于花粉第
一次有丝分裂前后时期 , 与成熟花粉相比 ,其代谢较活跃 , 液泡化程度较高 ,含水量较大 。
这种生理状态显然是它们对超低温保存条件要求更为严格的内在原因 。冰冻保护剂 、 降温
程序以及化冻方式是重要的外在因素 。 许多植物成熟花粉超低温保存时 ,一般不需冰冻保
护剂 , 干燥处理后即可保存 5[, “ 〕 。 本文为了在相同条件下进行比较 , 一律采用由 D M S O 、蔗
糖与 B S 培养基组成的冰冻保护剂 。 在此条件下 ,成熟花粉也能很好保存 。 本文采用程序降
温仪 , 由微机严格控制三步 , 降温程序 , 提供了平稳 、 逐步降温的条件 ,使花粉排水较为充
分 ,冰冻伤害较小 。 此外 ,常用的快速化冻方法对紫菜苔花粉也是适宜的 。
花粉原生质体分离已在若干植物中获得成功〔` 一 3 、 ` 。 、 ’ 3〕 ,但分离技术仍有待完善 。 李仕
琼等 ( 1 9 9 2) 用“ 水合一酶解二步法 ” 分离出大量紫菜苔与甘蓝型油菜成熟花粉原生质体 〔`〕 ,
但有水合时间过长的缺点 。 本文减去水合步骤直接酶解 ,分离效果也很好 。 而且首次分离
出部分幼嫩花粉原生质体 。 主要改进措施是酶的组成中增加了 eP ct ol ya se Y 一 23 · T a n a ka
等 ( 19 8 7 )在赓香百合近成熟花粉原生质体分离的研究中 , 比较了酶的种类 ,认为纤维素酶
与果胶酶效果好 ,添加 p ec ot ly a s e 无益 l0[ 〕 。 周嫦 ( 1 9 88) 分离营草 、 莺尾 、 风雨花时也是用
的这两种酶闭 。 此后 , 在其进一步的研究中 ,发现有的只需上述二酶即可阁 。
保存花粉能否分离原生质体及其技术上有无特点是需要研究的问题 。 从本试验结果
看 ,保存的成熟花粉经化冻 、 洗涤后 ,和新鲜花粉一样 , 可以直接分离原生质体 。 保存的幼
嫩花粉则需在酶解前增加 “ 温育 ” 处理 。 W it he r s ( 1 9 8 5 )认为保存材料在降温与化冻过程中
对环境有适应性变化 ,往往需要经过一段时间才能恢复保存前状态 口 2〕。 简令成 ( 1 9 90 )指
出 ,测定保存的成熟花粉生活力或萌发率时 ,需经过一定时间使花粉恢复其含水量川 。 显
7 38 植 物 学 报 35 卷
然 ,紫菜苔幼嫩花粉原生质体分离的保温处理是必要的技术环节 ,具有恢复保存前状态的
作用 。
参 考 文 献
〔 l〕
[ 2〕
[ 3〕
[ 4 ]
[ s j
[ 6 ]
[ 7〕
[ 8〕
[ 9 ]
[ 10 〕
〔1 1〕
〔1 2〕
〔13〕
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,
Y
.
P
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1 9 7 8
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lo w t e m p e r a t u r e o n e x e i s e d a n t h e r s a nd p
o lle n
一 e m b r y o s o f tA 八功a , N 介“ i -
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C h a r n e
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,
19 8 8
:
E m b r yo
一召e
nes i
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fo ll
o 侧 n g c r yo p er s e r v a t i o n in
i s o l a t e d m i e r o s p o r e s o f r a p e 、 e e d ( B ar s s ic a n aP
u s L
.
)
.
p la 趁 t eC l l 尺eP
. ,
,
:
4 0 7一 4 0 9 .
块me k e , T . a nd H . G . H u g h e s , 19 9 1 : G e r m in a t i o n a dn s t o r a g e o f p o lle n o f P hy t o al c a ddo e c 口 , d r “ L . ( e n d o d ) .
A 月 n . 刀创 . , 6 8 : 13一 15 .
H u a n g
,
B
.
a n d W
.
A
.
K e lle r
,
19 8 9
:
M i e r o s p o r e e u l t u r e t e e h n o lo g y
.
J
. 孔 55 “ e C以 t u er 人几 t h o d s , 1 2 ( 4 ) : 1 7 1一 1 7 8 .
T a n a k a
,
L
. ,
C
.
K i t a z u am
a n d M
.
I t o
,
1 9 8 7
:
T h e i s o la t i o n a nd
e u l t u r e o f l i ly p o lle n p r o t o p la s t s
.
P l a n t cS i二 5 0 :
2 0 5一 2 1 1 .
T o w i ll
,
L
.
E
. ,
1 9 8 5
:
L o w t e m p e r a t u r e a n d f r e e z e
一
/ v a e e u m
一
d r y in g p er s e rva t i
o n o f p o lle n
.
In
:
K
.
K
.
K a r t h a
, e d
. ,
C r y o p r e s e r v a t io n o f P la n t eC ll
s a n d O r g a n s
.
F lo r id a
:
C R C P r e s s
,
1 7 2一 1 9 8 .
W i t h
e r s , L
.
A
, ,
1 9 8 5
:
C r y o p r e s e r va t jo n a n d s t or 昭 e o f g e r m p la s m . I n : R . A . D i x o n , e d . , P la n t C e l l C u l t u r e : A
P r a e t i e a l A P p r o a e h
.
1 6 9一 1 9 1 .
Z h o u
,
C
.
a n d Y
.
W
u , 1 9 9 0
:
T w o p a t h w a y s in p o ll e n p r o t o p la s t e u l t u r e
:
eC l l d i
v i s io n a n d t u b e g or w t h
.
I n
:
H
.
J
.
J
.
N ik a m p e t a l
. , e d s
. ,
P r o g r e s s in P l a nt C
e llu l a r a n d M o l e e u la r iB o lo g y
,
P r o e e e d in g s o f t h e 7 t h In t e r na t io n a l
oC
n g r e s s o n P la n t T i s s u e a n d C e ll C u l l t u r e
.
K lu w e r A e a d e m i e P u b li s h e r s
,
2 2 2一 2 2 7 .
图 版 说 明
l
、
2
. 保存的幼嫩花粉群体 , F D A 染色示花粉的生活力 , 1 和 2 分别为明视野与相应的荧光图象 . x 2 0 3 、 4 . 保存
的成熟花粉群体 , F D A 染色示花粉的生活力 。 3 和 4 分别为明视野与相应的荧光图象 。 x 2 0 5 . 分离的成熟花粉原生
质体群体 。 又 4 0 6 . 分离的幼嫩花粉原生质体群体 。 x 4 0 7 . 保存的幼嫩花粉经培养发生一次分裂 。 x 60 8一 n .
成熟花粉原生质体的分离过程 . X 7 30
E x P l a n a t io n o f P l a t e
F ig s
.
l
,
2
.
A p o p u la t i o n o f e r y o p r e s e r v ed y
o u n g 卯 ll e n s s t a in e d w i t h FD A s h o w in g s t r o雌 f lu o r oc h or ma t ie r e a e t i -
o n
.
F ig s
.
1 a n d 2 a r e b r ig h t if e ld a n d e o r r e s p o n d in g fl u o r e s e e n e e m i e r o g r a p h s
.
X Zo o F ig s
.
3
,
4
.
A p o p u la t io n o f e r y o p
-
er
s e r v e d ma
t u r e p o lle n s s t a in e d w i th F D A s h o w in g s t r o n g f lu o r o e h r o m a t i e r e a e t io n
.
F ig s
.
3 a n d 4 a r e b r ig h t f i e ld a n d
e o r r e s p o n d in g f lu o r e s e e n e e m i e r o g r a p h s
.
X 2 0 0 F i g
.
5
.
A p o p u la t i o n o f m a t u r e p o ll e n p r o t o p la s t s
. 义 4 0 0 F ig . 6 . A
p o p u la t i o n o f y o u n g p o ll e n p r o t o p la s t s
. 又 4 0 0 iF g . 7 . F i r s t d i v i s i o n o f e r y o p er s e r v e d y o u n g p o l le n . x 6 0 0 iF g s . 8一
1 1
.
T h e r e l e a s e p roc e s s o f m a t u r e P o l le n p r o t o p la s t s
.
x 7 3 0