全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J． of Agr． Sci．) ，2014，30(2) :264 ～ 267
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宋晓宏，沙 伟． 毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)耐旱相关 cDNA文库中 4 个候选基因的表达分析［J］．江苏农业学报，2014，30
(2) :264-267．
doi:10． 3969 / j． issn． 1000-4440． 2014． 02． 007
毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)耐旱相关 cDNA 文库中
4 个候选基因的表达分析
宋晓宏1， 沙 伟2
(1．长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 涪陵 408100;2． 齐齐哈尔大学生命科学与工程学院，黑龙江 齐齐哈尔
161006)
收稿日期:2013-09-01
基金项目:国家自然科学基金项目(31070180、31270254)
作者简介:宋晓宏(1980-) ，女，辽宁建平人，博士，讲师，主要从事耐
旱藓类抗旱分子机制研究。(E-mail)sxh829@ 126． com
通讯作者:沙 伟，(E-mail)l Shw1129@ 263． net
摘要: 采用实时荧光定量 PCＲ方法，分析毛尖紫萼藓中 4 个干旱胁迫诱导基因在干旱及复水条件下的表达
模式。结果表明，GpSuSy基因主要受干旱胁迫诱导表达，GpATP基因和 GpPAK基因主要受复水诱导表达，GpCAT基
因在干旱及复水条件下均有较高表达量，4 个基因在毛尖紫萼藓耐受干旱及复水恢复过程中分别发挥作用。
关键词: 毛尖紫萼藓;实时荧光定量 PCＲ;表达分析;抗旱性
中图分类号: S188，Q786 文献标识码: A 文章编号: 1000-4440(2014)02-0264-04
Expression analysis of four candidate genes from drought-tolerant cDNA
library of Grimmia pilifera
SONG Xiao-hong1， SHA Wei2
(1． College of Life Science and Technology，Yangtze Normal University，Fuling 408100，China;2． College of Life Science and Agriculture and Forestry，
Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract: Ｒeal-time fluorescence quantitative PCＲ was used for identification of expression profiles of 4 drought
stress induced genes in Grimmia pilifera under dehydration and rehydration． The expression of GpSuSy was induced by
drought stress，the expressions of GpATP and GpPAK were induced by rehydration，and GpCAT had a high expression level
during both dehydration and rehydration． These results demonstrated that four genes play roles in drought resistance of
Grimmia pilifera respectively
Key words: Grimmia pilifera;real-time fluorescence quantitative PCＲ;expression analysis;drought resistance
苔藓植物是自然界的拓荒者之一，在长期的进
化过程中许多耐旱藓类植物形成了特殊的形态、细
胞及大分子等特征，具有很强的耐旱能力，并且在复
水过程中可诱导启动恢复机制，如丛本藓(Anoectan-
gium compactum)和土生藓类(Tortula ruralis) ，经受
几个月甚至几十年的干旱仍能保持生命力［1-2］。国
外从 20 世纪 70 年代起开始研究苔藓植物抗旱性，
其中以土生墙藓研究较多，已有大量关于其应对严
重的水分和干旱胁迫的生理学、生物化学、细胞响应
及分子生物学的研究［3-6］。毛尖紫萼藓(Grimmia
pilifera)是紫萼藓属(Grimmia)中典型旱生植物，生
长在向阳的裸岩上，久旱而不丧失生活力，是很好的
抗旱资源。本研究从已构建的毛尖紫萼藓耐旱 cD-
NA文库中筛选 4 个干旱胁迫诱导表达的基因，分
析其在干旱及复水条件下的表达模式，试图找到重
要的抗旱相关基因，为研究毛尖紫萼藓抗旱分子机
制提供初步的理论基础。
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1 材料与方法
1． 1 材料及处理
毛尖紫萼藓采自黑龙江省北部五大连池风景区
的老黑山。清洗后在自然光照条件下，保持水分充
足，室温培养 7 ～ 10 d 至生理指标［质膜透性、丙二
醛(MDA)含量、游离脯氨酸含量等］稳定，作为对照
材料。然后停止浇水进行干旱处理，依据已有对毛
尖紫萼藓干旱及复水过程中抗旱相关生理指标测定
结果选择取材范围［7］，分别取干旱 1 d、3 d、5 d，再
复水 0 h、0. 5 h、1. 0 h、6. 0 h、12. 0 h、24. 0 h、36. 0
h、48. 0 h共 11 个时间点材料，液氮速冻后 － 80 ℃
冰箱保存备用。
1． 2 总 ＲNA提取及 cDNA合成
藓类植物普遍含有萜类、固醇类、酚类等次生代
谢产物，使提取的 ＲNA 易于降解。为此在 SDS
法［8］基础上加以改进，液氮研磨过程中加入聚乙烯
吡咯烷酮(PVP)和抗坏血酸(VC)粉末，裂解步骤中
加入终浓度 20% 的乙醇，沉淀步骤用 1 /2 体积 8
mol /L LiCl 和 1 /2 体积 75% 乙醇，-20 ℃ 沉淀 30
min。ＲNA纯化使用 ＲQ1 ＲNase-free DNas 试剂盒。
cDNA合成采用 Promega公司的M-MLV ＲT试剂盒，
合成方法参照说明书进行。
1． 3 候选基因及引物设计
通过生物信息学分析，从毛尖紫萼藓耐旱 cD-
NA文库［9］中选取与活性氧清除、信号转导、代谢、
物质转运及离子平衡相关的过氧化氢酶相似基因
(GpCAT)、丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶相似基因(Gp-
PAK)、H + -ATP酶相似基因(GpATP)和蔗糖合成酶
相似基因(GpSuSy)进行表达分析。根据这 4 个基
因的 EST序列，结合荧光定量 PCＲ 引物设计原则，
采用 Primer express v3． 0 软件设计定量 PCＲ 引物。
引物序列见表 1。
1． 4 候选基因表达分析
以 18S rＲNA作为内参基因，设置空白对照，每
个反应设置 3 次重复。分别以对照和 11 个时间点
材料 cDNA为模板，采用荧光定量 PCＲ 分析各基因
在干旱及复水条件下的表达。荧光定量 PCＲ 使用
TaKaＲa 公司的 SYBＲ Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect
Ｒeal Time)试剂盒在伯乐公司的 Chromo4 荧光定量
PCＲ仪上进行，试验数据采用 OpticonMonitor3 软件
自动分析。
表 1 候选基因荧光定量 PCＲ引物序列
Table 1 Fluorescence quantitative PCＲ primer sequences of the
candidate genes
基因 序列
GpCAT 正向 5-CCGATTTGACCCTGTTCGTC-3
反向 5-TTACAGCCTTCTCCCTCACTCC-3
GpATP 正向 5-GGGGACATTGCACGAGAGA-3
反向 5-TCTACAAGCACAAGGCGATACAA-3
GpSuSy 正向 5-AATCTCGTCGCCTCTCTGTTG-3
反向 5-TGTCGGAATCTGGATACTTGGTT-3
GpPAK 正向 5-TCATCCAGGCGTTCATTCC-3
反向 5-TCAGTGTCCTTGCCGCTCT-3
18S 正向 5-TTGACGGAAGGGCACCA-3
反向 5-ACCACCACCCATAGAATCAAGAA-3
2 结果与分析
2． 1 干旱条件下基因的表达
以复水培养 7 ～ 10 d 的毛尖紫萼藓材料中基因
表达量作为对照，并定义为 1 个单位，干旱条件下各
基因表达量如图 1 所示。4 个基因在干旱条件下基
因表达均上调，干旱 5 d时 GpCAT、GpPAK、GpATP和
GpSuSy 基因表达量分别达到对照的 3. 5、3. 7、4. 6
和 3. 2 倍，说明 4 个候选基因均受干旱诱导表达。
在毛尖紫萼藓抵御干旱的过程中，GpPAK 作为信号
转导系统的关键酶，通过可逆的蛋白质磷酸化过程
在细胞内外形成信号转导途径，完成信号转导过程;
GpCAT作为活性氧清除酶系统的一员发挥作用，使
细胞免于遭受 H2O2的毒害;GpATP调节植物离子及
渗透物质平衡;GpSuSy 调控蔗糖的合成，从而维持
细胞膨压，保证其正常生长。
2． 2 复水条件下基因的表达
复水条件下各基因表达量如图 2所示。复水初期
(0. 5至 1. 0 h)，4个基因均表达下调，但之后表达水平
各异。其中，GpCAT基因复水后 1. 0 h表达水平开始大
幅上升并呈波动变化，至复水后 48. 0 h表达量仍为对
照的 2倍;GpSuSy 基因复水后 0. 5 h 表达水平迅速下
降，并逐渐恢复到对照水平;GpATP 基因复水后 1. 0 h
表达量大幅上升，复水 24. 0 h时表达量最高，为对照的
7. 3倍，干旱5 d的1. 6倍;GpPAK基因复水后与其他基
因相比在短时间内表达量有较大幅度升高，复水 6. 0 h
表达量最高，达到对照的 4. 2倍，之后逐渐下降到对照
水平。说明并不是所有基因都受复水诱导表达，有些
562宋晓宏等:毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)耐旱相关 cDNA文库中 4 个候选基因的表达分析
基因可能对毛尖紫萼藓复水后快速恢复生长发挥作 用，并且分别作用于复水后的不同时期。
图 1 干旱过程中基因的表达模式
Fig． 1 Expression profiles of drought stress induced genes during dehydration
图 2 复水过程中基因的表达模式
Fig． 2 Expression levels of drought stress induced genes during rehydrationn
3 讨 论
耐旱藓类具有特殊的形态、细胞及大分子等特
征，既可以适应缓慢干旱胁迫，又可以抵御快速干旱
造成的伤害，复水后几秒钟外部形态特征即可恢复
正常，并很快恢复生长，区别在于缓慢干旱后复水生
662 江 苏 农 业 学 报 2014 年 第 30 卷 第 2 期
理代谢恢复速度很快，而快速干旱后复水要较长时
间恢复。Hinshiri 等［10］研究牛舌藓(Anomdonviticu
losus)和光萼苔(Porella pltyphylla)时发现，缓慢干
旱 8 ～ 9 d后再复水，两种苔藓的呼吸和光合速率可
迅速达到正常水平，积极的碳平衡几乎在瞬间建立。
植物干旱后复水能继续生长也是抗旱性的一种
表现，多数复苏植物可以在复水 24 h 后恢复正常代
谢水平［11-12］，并且复水后的基因表达与干旱胁迫时的
基因表达是一个连续的过程，很多基因的表达具有连
续性，在复水过程中依然起到重要作用［13-14］。耐旱藓
类复水时基因表达有很大变化，Oliver 等［15-16］对土生
墙藓的研究结果表明，复水时蛋白质的合成受到巨大
影响，其中 25种蛋白质合成终止或大幅度下降，74种
蛋白质合成开始或大幅度上升，这 2 组蛋白质分别被
称为 Hydrins和 Ｒehydrins。在复水延长期，Ｒehydrins
和 Hydrins的合成在恢复至正常水平的过程中也有所
不同，在水化后 2 ～ 4 h 内，几乎所有 Hydrins 的合成
达到正常水平，而一些 Ｒehydrins 仅合成不到 2 h，另
一些 10 ～12 h 后仍呈上升趋势，24 h 后所有蛋白质
均达到正常水平［17］。因此也有学者［18］推测，复水早
期的 Ｒehydrins蛋白质可能参与修复质膜损伤，而复
水延长期间的 Ｒehydrins蛋白质则可能参与细胞器结
构和功能的长期恢复过程。本研究中，GpSuSy 基因
在复水后表达量大幅下降，推测其可能为编码
Hydrins的基因;GpPAK 和 GpATP 基因在复水后表达
量高于干旱处理，分别在复水 6 h 和 24 h 时达到最
高，推测它们为编码 Ｒehydrins的基因，主要受复水诱
导，在再水化恢复过程中对细胞的质膜氧化损伤及细
胞器的结构功能进行修复;GpCAT基因在干旱及复水
条件下都有很高的表达量，无法判断其是编码 Ｒe-
hydrins或 Hydrins的基因，但证明了毛尖紫萼藓与土
生墙藓有类似的特点，干旱及复水条件下某些基因表
达具有连续性。
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( 责任编辑:张震林)
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