全 文 ：小 立 碗 藓 CAS 基 因 的 克 隆 及
与拟南芥 CAS 基因的比较＊
胡　勇1＊＊　蒋广龙1　赵晓刚2　周伟巍1
(1.首都师范大学生命科学学院 ,北京　100048;2.北京市第四中学 ,北京　100034)
摘 要
　　钙信号在动植物的生长 、发育过程中具有不可替代的作用.胞外钙受体(Extracellular Calcium-sensing receptor ,
CAS)是动植物质膜上一种跨膜离子通道蛋白 , 可以感受胞外 Ca2+水平 , 充当第一信使将胞外的信号传递到细胞
内.但迄今为止 , 仅 2003年从植物拟南芥中克隆了胞外钙受体 CAS 基因 ,其起源进化我们知之甚少.本实验成功克
隆了小立碗藓 CAS 基因 , 其 cDNA全序列共1 574 bp , 5′-非翻译区 80个核苷酸 , 3′-非翻译区 234 个核苷酸 ,开放阅读
框(ORF)1 257 bp , 编码 419 个氨基酸 ,共有 6 个内含子.虽然藓类植物与被子植物进化距离较远 , 但小立碗藓 CAS
基因前五个内含子的插入位置以及相位与拟南芥完全相同 , 这说明植物中 CAS 基因在漫长的进化过程中非常保
守 ,暗示被子植物胞外钙离子信号感受 、传递机制起源于藓类植物.
关键词:小立碗藓 , CAS(calcium-sensing receptor), 内含子 , 内含子相位 , 逆转录 PCR.
中图分类号:Q 943.2
收稿日期:2008-01-11
＊国家自然科学基金资助(30500288), 北京市教委科技发展计
划面上项目(KM200610028010)和北京市优秀人才项目资助
(20051A0501605)
＊＊联系人　Tel:010-68902375 , E-mail:hyong@mail.cnu.edu.cn
　　植物钙通道研究的历史仅有十几年 ,早期研究
主要借鉴动物研究方法 ,采用 Ca2+载体及哺乳动物
有关的 Ca2+通道抑制剂或激活剂进行相关研
究[ 1 ～ 3] .这些研究仅仅提供某些种类的 Ca2+通道在
植物体可能存在的间接证据.最近几年 ,随着植物细
胞信号转导研究的兴起和膜片钳(patchclamping)技
术的发展 ,人们获得了许多种类的 Ca2+通道存在的
直接证据[ 1 , 2 ,4] ,并对其开放调控机制进行了较为深
入的研究.在植物细胞中 , 外源 Ca2+可引起胞内
Ca
2+浓度升高(Ca2+-induced[ Ca2+] increase CICI),进
而引起保卫细胞气孔的关闭[ 5 ～ 7] .但是 ,至关重要的
Ca
2+受体虽经多方寻找却毫无结果.直到 2003年 ,
植物中第一个胞外钙受体基因 CAS(Ca2+-sensing
receptor)才由 Pei研究小组成功克隆[ 8] .目前 ,其他
植物中的 CAS 基因未见报道 ,其感受 、传递信号机
理及其起源进化有待进一步研究.
苔藓是陆生植物中最古老种群之一 ,起源于古
生代中泥盆纪 ,距今大约 37亿年.它们没有真正的
根 、茎 、叶分化 ,只有线状假根 ,更没有保卫细胞 、气
孔等结构[ 9] .进化研究认为陆生植物属于单系起源 ,
苔藓与维管植物在进化树上并列.它们的相对位置
说明 ,苔藓是研究陆生植物进化的理想材料.小立碗
藓(physcomitrella patens)属于葫芦藓目(Funariales)
葫芦藓科(Funariaceae)立碗藓属(physcomitrium),己
成为重要的功能基因组学研究的模式植物.
本文利用 RT-PCR从小立碗藓中克隆了 CAS 基
因.序列以及内含子分析表明拟南芥与小立碗藓
CAS 基因非常保守 ,二者具有共同的进化祖先.这暗
示最早的陆生植物藓类与被子植物具有相似的
Ca
2+信号传导机制.
1　材料与方法
1.1　材　料
小立碗藓 physcomitrella patens由本实验室培养 ,
培养条件:25 ℃,16 h光照.E .coli菌株 JM109由本
室保存.Taq酶 、T 载体购买于天维时代公司 ,反转录
试剂盒购自大连宝生物有限公司.引物由上海生工
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第 29 卷　第 6 期
2008 年 12 月
首都师范大学学报(自然科学版)
Journal of Capital Normal University
(Natural Science Edition)
　
No.6
Dec., 2008
公司合成.限制性内切酶 、T4 DNA 连接酶购自华美
生物工程公司.dNTP 与 DNA 电泳凝胶回收试剂盒
购自上海生工公司.其他常规试剂及培养基购自华
美 、生工等公司.
1.2　RNA的提取
分别收集不同生长时期的小立碗藓材料 ,混合.
总 RNA采用 TE3D溶液(2 mol·L-1 Tris ,0.2 mol·L-1
Na2EDTA:10% NP-40 , 15% LDS , 10% Sodium
deoxycholate)提取.将 1 份 TE3D与 2 份饱和酚溶液
混合 ,加 β-疏基乙醇(1%)备用.将小立碗藓新鲜材
料于液氮下研磨至粉末状 ,倒入含 4mL phenol-TE3D
溶液的离心管内 ,迅速混匀 ,冰上放置 5 ～ 10 min ,加
入1.4 mL 氯仿/异戊醇 ,0.8 mL 3 mol·L-1醋酸铵 ,
颠倒混匀 ,冰浴 10 ～ 20 min;4 ℃,12 500 rpm 离心 15
min ,取上清 ,加等体积酚 氯仿 异戊醇(25∶24∶1)抽
提.取上清 ,加等体积 6 mol·L-1氯化锂 ,低温(-20
℃)沉淀 1 ～ 2 h;4 ℃,14 000 rpm 离心 30 min , 70%
乙醇洗涤 RNA 沉淀 ,4℃,12 000 rpm 离心 5 min;重
新洗涤2次.RNA沉淀加入 20 ～ 50μL 经DEPC处理
的 ddH2O溶解.
图 1　PCR电泳
1:DL2000;2:PCR产物
1.3　小立碗藓 CAS 基因克隆
以拟南芥 CAS 基因为探针检索小立碗藓
Physcobase EST 数据库 , 得到几条 EST 序列 , 利用
BioEdit软件进行 EST 序列拼接 ,并设计一对引物
(mossCASs:BamH Ⅰ ggatcc tta gaa agg cgt ttt gaa gtg
ct;MossCASanti:EcoR Ⅰ gaattc act tgc atc ttg atg gaa gca
gt).采用TaKaRa RNA PCRKit(AMV)Ver.2.1逆转录
合成 cDNA第一链 ,操作均按 Kit说明进行.取 2 μL
逆转录产物进行 PCR扩增 ,优化的 PCR反应条件为
94 ℃预变性 1 min ,随后94 ℃30 s ,56 ℃30 s ,72 ℃
1 min ,30个循环 ,最后 72 ℃5 min.PCR产物直接克
隆到 T 载体上 ,筛选阳性克隆测序.
1.4　序列比较与内含子分析
序列利用 ClustalW进行对齐.小立碗藓 CAS 基
因的基因组序列通过 Blastn程序检索刚公布尚未注
释以及组装的鸟枪法测序结果获得.内含子利用在
线内含子分析软件 sim4进行分析.
2　结　果
2.1　基因序列分析
RT-PCR扩增了小立碗藓 CAS 全长 cDNA , PCR
产物约为 1.6 kb(Fig.1).小立碗藓 CAS cDNA 全序
列共1 574 bp , 5′-UTR 80 个核苷酸 , 开放阅读框
(ORF)1 257 bp ,中止密码子为 TAA ,编码419个氨基
酸的蛋白.在起始密码子上游的 5′-UTR中含有同框
终止密码子(图 2), 说明我们克隆的 CAS 基因为
cDNA全长.
2.2　基因结构比较
由 cDNA序列推导的小立碗藓 CAS蛋白由 419
个氨基酸组成.与拟南芥 CAS 蛋白序列对齐比较结
果显示 ,二者相似性为 38.4%.CAS 蛋白 N 端为胞
外序列[ 8] (Han et al.,2003),与拟南芥 CAS相比较序
列相似性较低 ,可能不同植物对胞外钙离子的敏感
度及结合方式存在差异.CAS羧基端位于膜内侧 ,具
有明显的保守区 ,主要介导蛋白与蛋白质间的相互
作用.
小立碗藓与拟南芥的 CAS 基因结构非常保守
(图 3 ,表 1).除了小立碗藓多出第 6个内含子外 ,其
余 5个内含子的插入位置完全相同(图3).第1 、2内
含子插入位点的相位都为 0 ,也就是说内含子刚好
插入到相邻的 2个三联体密码子之间.CAS 基因第
三个内含子的相位为 1 ,刚好插在氨基酸 G 的密码
子第 1位与第 2位之间.内含子 4与 5的相位为 2 ,
插入到相应氨基酸密码子的第 2位与第 3位之间.
与拟南芥相比 ,小立碗藓 CAS 多一个内含子 6 ,其相
位为 1 ,插在第 390个氨基酸A 的密码子第 1位 G 、
第 2位 C之间(Fig2 , 3).内含子 1到 5共存于小立碗
藓与被子植物拟南芥中 ,说明这 5 个内含子在小立
碗藓进化产生前已经出现 ,或者伴随藓类的进化而
产生 ,在随后蕨类 、裸子植物以及被子植物的进化过
程中一直被保留.序列对齐比较显示 ,这5个内含子
均插入在较保守的区域 ,暗示这些保守区域对于
CAS发挥正常功能具有重要作用.第六个内含子只
在小立碗藓中出现 ,拟南芥没有该内含子.有可能该
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首都师范大学学报(自然科学版) 2008年
图 2　小立碗藓 CAS 基因及其递推氨基酸序列.
下划线所示为起始密码子ATG 5′上游同框终止密码子.
图 3　CAS蛋白序列比较
黑色箭头表示拟南芥与小立碗藓中相同内含子的插入位置.相同的氨基酸残基用黑背景表示 ,保守性替换用阴
影表示.短横线表示序列对齐时所产生的空格.白色箭头表示仅在小立碗藓中存在的内含子.序列上方的数字表
示内含子的编号 ,括号内的数字表示内含子的相位 ,小立碗藓与拟南芥相同内含子的插入位置完全相同 ,其相位
也相同 ,说明这些内含子具有共同的祖先.
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第 6期 胡　勇等:小立碗藓 CAS 基因的克隆及与拟南芥CAS 基因的比较
内含子在藓类中普遍存在 ,而在蕨类或者种子植物
的进化过程中被丢失.也有可能属于小立碗藓近期
的进化事件.由于目前基因数据较少 ,我们无法对该
内含子的进化做出判断.将它们共同的内含子序列
进行序列分析比较 ,无论长度还是序列都出现较大
变化 ,无明显相似性(表 1).
表 1　拟南芥与小立碗藓 CAS 基因内含子比较
A.thaliana CAS P.patens CAS
Insert site Length Phase Insert site Length Phase
Int ron 1 216 82 0 273 375 0
Int ron 2 462 99 0 519 237 0
Int ron 3 655 150 1 724 244 1
Int ron 4 797 79 2 866 182 2
Int ron 5 929 79 2 998 186 2
Int ron 6 1 168 416 1
3　讨　论
动物与植物中都存在胞外钙离子受体 ,它对于
维持胞内钙离子的相对稳定必不可少 ,是钙信号通
路的第一个部分.动物中胞外钙受体基因的克隆说
明胞外Ca2+是钙信号转导机制的第一信使[ 10] .
迄今为止 ,在植物中没有找到任何动物胞外钙
受体的同源基因.目前已经明确 ,脊椎动物与植物在
维持胞内钙库与胞外钙之间的 Ca2+动态平衡机制
不同.2003年美国杜克大学的 Han and Pei根据功能
基因筛选法(functional screening approach)成功克隆
了拟南芥 Ca2+胞外受体(calcium-sensing receptor)基
因 ,命名为 CAS [ 8] .该基因在拟南芥为单拷贝 ,编码
含有 387个氨基酸残基的蛋白质.该蛋白与所有动
物胞外钙受体没有任何序列上的相似性 ,说明动物
钙离子受体与植物钙离子受体的起源与进化过程均
不相同.目前我们对动物以及植物中钙离子信号感
受传递机制从何起源知之甚少.
本文成功地克隆了小立碗藓的 CAS 基因.小立
碗藓与拟南芥虽然分别为藓类和被子植物 ,在进化
程度上具有较大差异 ,但它们 CAS 基因的结构及编
码的蛋白序列非常保守.内含子分析表明 ,小立碗藓
与拟南芥的 CAS具有共同的进化祖先 ,二者为直系
同源物.植物 CAS 为跨膜蛋白 ,N 端为胞外 Ca2+结
合区[ 8] .氨基酸序列比较结果显示小立碗藓与拟南
芥 CAS N端差异较大 ,有可能藓类植物细胞与拟南
芥细胞的胞外环境以及胞外信号的内涵不同 ,或者
小立碗藓 CAS 与拟南芥 CAS 对钙信号的敏感阈值
存在差异.小立碗藓发育过程分为原丝体与茎叶体
阶段 ,原丝体由单列细胞组成 ,没有假根 、假茎以及
假叶的分化 ,因此其胞外环境实际上就是体外环境.
由于小立碗藓体外环境与拟南芥胞外环境中的钙离
子浓度可能存在差异 ,所以在长期的进化过程中 ,小
立碗藓CAS与拟南芥 CAS 可能产生了钙浓度感受
阈值上的差异.CAS蛋白C 端为胞内区域 ,主要介导
蛋白与蛋白间的相互作用 ,其高度的保守性暗示藓
类植物与被子植物在钙离子信号传导过程中 CAS
蛋白利用相同的或者相似的方式传递信号.
拟南芥与小立碗藓 CAS 蛋白一级结构的保守
性 、内含子插入位置及其相位的一致性暗示被子植
物与藓类植物 CAS蛋白的功能类似.也就是说 ,小
立碗藓与拟南芥可能具有相似的 、保守的钙信号感
受与传导机制.拟南芥中 ,CAS直接调控保卫细胞气
孔的关闭 ,防止水分的过多蒸发[ 8 , 11] .但是在小立碗
藓中 ,根本就没有气孔与保卫细胞 ,那 CAS 在小立
碗藓中具有什么功能? 我们猜测 ,在整个钙信号传
导途径中 ,上游的信号传递机制相同或者相似 ,只是
下游的功能基因或者效应基因有所区别.小立碗藓
虽然没有气孔与保卫细胞 ,但是小立碗藓中也存在
ABA 、细胞分裂素 、生长素介导的生长发育以及抗干
早 、极端低温等胁迫应答机制[ 12] ,我们推测小立碗
藓 CAS可能与植物干旱拮抗机制相关.目前我们正
在研究小立碗藓 CAS 基因的具体功能.
参 考 文 献
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Cloning and Phylogenetic Analysis of Physcometrella Patants
Extracellular Calcium-sensing Receptor(CAS)Gene
Hu Yong
1＊　Jiang Guanglong1　Zhao Xiaogang2　Zhou Weiwei
1.College of Life Science , Capital Normal University , Beijing　100048;
2.Beijing the 4th Middle School , Beijing　100034
Abstract
Extracellular Ca
2+
is required for various physiological and developmental processes in animals and plants.Calcium-
sensing receptor is a Ca
2+
permeableable channel of cytoplasm membrane , which is essential to maintain relatively
constant internal Ca
2+
content.In plants , calcium-sensing receptor(CAS)can sense the level of extra-cellular Ca2+ and
lead closure of stomata.Up to date , however , only one CAS gene was cloned from Arabidopsis by function-cloned
method.Whether the CAS genes exist in the other plants remain unclear.In this study , a homologue of Arabidopsis CAS
gene was identified from Physcomitrella patens.With a 1 257 bp ORF(opening reading frame), the full-length 1 574 bp
PpCAS cDNA had a 80 bp 5′UTR(untranslation region)and a 234 bp 3′UTR , and encoded a precursor of 419 amino
acid residues with 38.4% identity with Arabidopsis CAS.Genomic structure comparison between PpCAS Arabidopsis and
PpCAS shows that exon length and intron position are conserved except that PpCAS has one more intron , which indicates
that the Ca
2+
signal transduction might be an ancient conserved mechanism in land plant.
Key words:physcomitrella patens , calcium-sensing receptor CAS , intron , intron phase , RT-PCR.
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第 6期 胡　勇等:小立碗藓 CAS 基因的克隆及与拟南芥CAS 基因的比较