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第 32 卷第 3 期 分析试验室 Vol. 32． No． 3
2013 年 3 月 Chinese Journal of Analysis Laboratory 2013 － 3
收稿日期:2012-10-27
基金项目:国家自然科学资金(20961012)资助
E-mail:YXZ1149@ 126． com
HPLC法研究肾叶山蚂蝗清除 DPPH自由基能力
杨新周* 1，郝志云1，杨子仙1，胡秋芬2
(1．德宏师范高等专科学校理工系;德宏 678400;2．云南民族大学化学与生物技术学院;昆明 650031)
摘 要:建立了以 HPLC法对傣药 －肾叶山蚂蝗甲醇提取物清除二苯基苦基肼
自由基( DPPH·) 能力的方法，通过实验得出最佳的色谱条件:色谱柱为 Agilent
Eclipse XDB-C18 ( 4. 6 × 150 mm，5 μm) ，流速为 1. 0 mL /min，检测波长 517 nm，
柱温箱温度为 20 ℃，进样体积 20. 0 μL，流动相为不同比例的甲醇和水的混合
液。在此条件下测定了 DPPH·的清除率为 50% 时抗氧化剂的质量浓度( IC50 )
值，肾叶山蚂蝗甲醇提取物的 IC50为 1. 51 mg /mL。
关键词:抗氧化活性; HPLC;肾叶山蚂蝗; DPPH·
中图分类号:O657. 7 文献标识码:A 文章编号:1000-0720(2013)03-030-03
肾叶山蚂蝗(Desmodium renifolium Schindl)为
豆科植物是西双版纳傣医习用药材。肾叶山蚂蝗有
解热，利尿，和血，解毒，止咳之效。治感冒发热，肝
炎，肾脏 类，尿毒症，尿道炎，小便不利，淋疾、等
病症。
DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基自由基)在有机溶
剂中是一种稳定的自由基，其醇溶液呈深紫色，具有
单一电子，故能够接受一个电子或是氢离子，在波长
为 517 nm下具有最大光吸收。有自由基清除剂存
在时，DPPH的单电子被捕捉而使其颜色变浅，在最
大光吸收波长处的吸光值下降，褪色程度与清除剂
的清除能力及数量呈定量关系，从而以评价试验样
品的抗氧化能力。DPPH法是用以评价天然抗氧化
剂抗氧化活性的一种快速、简便、灵敏可行的方法。
目前测定植物抗氧化的方法主要有分光光度
法［1 ～ 3］及高效液相色谱法［4 ～ 9］。分光光度法已经
广泛应用于评估 DPPH自由基的清除能力，但是对
于在 517 nm附近有颜色的植物提取液，分光光度
法就会受到极大的干扰，导致结果出现偏差。与分
光光度法相比，HPLC 法能有效地分离样品的干扰
物质具有更高的精确度和可靠性。文章中采用高
效液相法(HPLC)进行定量分析，从而评价抗氧化
物质的抗氧化能力。
1 实验部分
1. 1 材料和仪器
DPPH(1，1 －二苯基 － 2 －三硝基苯肼，纯度
＞99. 0%;超纯水;肾叶山蚂蝗(烘干，粉碎，过筛) ;
甲醇(分析纯，色谱纯)。Agilent 1200高效液相色谱
仪(包括四元泵，自动进样器，二极管阵列检测器
DAD，柱温箱，Che-mstation 色谱工作站) ;色谱柱
Agilent Eclipse XDB-C18(4. 6 ×150 mm，5 μm) (美国
安捷伦公司) ;旋转蒸发仪;电子天平;电热真空干燥
箱;超纯水器。
1. 2 实验内容及方法
1. 2. 1 DPPH储备液的制备 称取 DPPH 标准品
50. 0 mg，用甲醇定容至 50 mL 容量瓶，浓度为
0. 50 mg /mL。此溶液现配现用，配制好后，用黑色
的材料将其盛放溶液的容器包裹，放于黑暗处，可
放置 5 h。
1. 2. 2 肾叶山蚂蝗提取物的制备 称取 6. 0000g
样品于 500 mL的聚四氟乙烯烧杯中，加入 60 mL
的甲醇溶液，烧杯封口，用超声提取 45 min，超声
提取后提取液冷却至室温，提取液过滤，如此重复
三次。合并 3 次滤液于旋转蒸发仪中浓缩，转移到
25 mL的容量瓶中，甲醇定容，备用。
1. 2. 3 色谱条件 色谱柱为 Agilent Eclipse XDB-
—03—
DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2013.0068
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第 32 卷第 3 期 分析试验室 Vol. 32． No． 3
2013 年 3 月 Chinese Journal of Analysis Laboratory 2013 － 3
C18 (4. 6 × 150 mm，5 μm) ，流速为 1. 0 mL /min，
检测波长 517 nm，柱温箱温度为 20 ℃，进样体积
20. 0 μL，流动相见表 1。
表 1 流动相梯度
Tab． 1 Gradient elution program
时间 /min 纯净水 /% 甲醇 /%
0 50 50
10 10 90
20 50 50
1. 2. 4 清除 DPPH自由基能力的测定
取一定量的 DPPH储备液，依次加入一定体积
的提取物稀释液于进样瓶中混匀，置于暗处 30
min，按照 1. 2. 3 色谱条件分别测定空白 DPPH 的
峰面积记为 PA空白和加入提取物后 DPPH 的峰面
积记为 PA样品，按下式计算自由基清除率。
清 除 能 力 (%) = ［PA空白 － PA样品］/
PA空白 × 100%。
2 结果与分析
2. 1 色谱条件的选择
在实验中，用甲醇溶解 DPPH，但如果用单一
的甲醇作为流动相分离效果不好，提取液中的其他
成分会造成干扰。所以试验中采用甲醇和水作为
流动相，在最大波长为 517 nm，柱温箱温度为 20
℃，考察了不同的进样量和液相的流速及不同浓度
的甲醇对 DPPH的保留与分离效果，实验结果发现
流速为 1. 0 mL /min、进样体积 20. 0 μL 时，甲醇与
水的梯度洗脱效果最佳，最终本实验确定的流动相
梯度为表 1。
2. 2 线性范围的考察
配制一系列浓度分别为 0. 1，0. 2，0. 25，0. 4，
0. 5 mg /mL的 DPPH溶液，将配制好的标准溶液按
照 1. 2. 3 色谱条件测定其峰面积，绘制标准曲线，
标准曲线方程为 Y = 15403X － 190. 51，r = 0. 9992。
2. 3 稳定性试验
将 DPPH配制成0. 30 mg /mL的待测溶液，每隔
1 h进样一次，记录色谱峰的峰面积，结果见图 1，从
图 1中可以看出，在5 h内DPPH的峰面积基本没什
么变化，而且 5 h内 DPPH的峰面积 RSD为0. 49%，
当进样时间达 6h时，DPPH的峰面积减小，大于 5 h
DPPH的峰面积 RSD，为 3. 3%，说明用 HPLC 法测
定 DPPH溶液，在 5 h内很稳定。
2. 4 重现性试验
配制浓度为 0. 2 mg /mL 的 DPPH 溶液，每次
进样前都重新配制同样浓度的 DPPH溶液，记录色
谱峰的峰面积，实验结果如图 2。从图 2 中可以看
出，连续 6 次测定同样浓度的 DPPH 溶液，色谱峰
峰面积的 RSD为 1. 4 %。结果证明用 HPLC 法测
定 DPPH，具有良好的重现性。
图 1 DPPH峰面积随时间变化曲线
Fig. 1 Variation curve of DPPH peak area with time
图 2 DPPH峰面积随进样次数变化曲线
Fig． 2 Variation curve of DPPH peak area with number
of injection
2. 5 肾叶山蚂蝗提取物清除 DPPH能力的测定
选择 IC50为肾叶山蚂蝗提取物清除 DPPH能力
的测定指标。将样品提取液稀释 10 倍，此时固形物
浓度为 0. 024 mg /L，移取浓度为 0. 5 mg /mL 的
DPPH溶液 500μL，依次加入样品提取液 10，15，20，
40，60，80，100μL，用甲醇溶液定容到 600μL，按照
1. 2. 3测定其峰面积，计算清除率。图 3为未加入肾
叶山蚂蝗提取物时，DPPH的峰面积，图 4 为加入肾
叶山蚂蝗提取物时，DPPH 的峰面积，从图 3 及图 4
中看出，当加入肾叶山蚂蝗提取物时，DPPH的峰面
积明显减小，说明肾叶山蚂蝗甲醇提取液，具有一定
的抗氧化能力。其中图 5是以清除率对总固形物浓
度作图，从图 5中可以看出，清除率随着样品浓度的
增加而增大，当样品浓度达到一定量时，清除率增加
缓慢且呈平稳趋势。肾叶山蚂蝗总固形物浓度较低
时，DPPH清除率与浓度呈线性关系，线性方程为 Y
—13—
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=24. 7X +12. 779，R2 = 0. 9851，线性范围:总固形物
浓度为 0. 4 ～ 3. 2 mg /mL，由方程计算出总固形物
IC50 =1. 51 mg /mL。由此可看出肾叶山蚂蝗甲醇提
取物对 DPPH·具有一定的清除能力，是一种具有
开发潜力的天然植物氧化剂。
图 3 DPPH空白溶液色谱图
Fig． 3 Chromatogram of a DPPH blank sample with
addition of 40 μL of extract
图 4 加入 40 μL提取物时 DPPH·溶液的色谱图
Fig. 4 Chromatogram of a DPPH blank sample
图 5 肾叶山蚂蝗甲醇提取物对 DPPH·的清除率曲线
Fig． 5 Curve of scavenging DPPH free radical of methanol
extracts from Desmodium renifolim schinoll
参考文献
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Research on the scavenging effect of methanol extracts from desmodium renifolium schindl on DPPH
radical by HPLC
YANG Xin-zhou* 1，HAO Zhi-yun1，YANG Zi-xian1 and HU Qiu-fen2(1． Dehong Teachers college，Science and
Engineering Department，Dehong 678400;2． Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry (Yunnan
University of Nationalities) ，State Ethnic Affairs Commission ＆ Ministry of Education，Kunming 650031) ，Fenxi
Shiyanshi，2013，32(03) :30 ～ 32
Abstract:A HPLC method was established for determining 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free radical scavenging
activity of Desmodium renifolium Schindl methanol extracts． The best chromatographic conditions:the mobile phase was a
mixture of methanol and water pumped at a flow rate of 1 mL/min，the DPPH peaks were monitored at 517 nm，the
column temperature was 20 oC，and the Sample volume was 20. 0 μL． Under the optimal conditions，IC50 of scavenging
DPPH free radical of methanol extracts from Desmodium renifolium Schindl is 1. 51 mg/mL．
Keywords:Antioxidant activity;HPLC;DPPH free radical;Desmodium renifolium schindl
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