全 文 ：有效且较低的定点突变模板浓度 ,可以确保 DpnⅠ酶的工作效
率 ,减少由于测序来筛选正确突变子所需的时间和成本。
(4)操作简化 , 成本降低。重叠延伸 PCR定点突变技术 、
寡核苷酸引物介导的定点突变技术 、大引物 PCR定点突变技
术都需要多对引物及多轮 PCR, 且突变过程需要繁琐的提纯
步骤才能得到最终的突变子。与这些传统方法相比 , 本研究
只需要一对引物 ,整个 PCR过程只需一步就可得到突变质粒 ,
简化了由于传统的多对引物带来的繁琐的提纯步骤 , 增加了
得到突变子的几率。
(5)应用范围广。与近年来广为使用的“设计限制酶辅助
突变”(Designed Restriction Enzyme Assisted Mutagenesis , DREAM)
技术相比 , 本研究介绍的方法所利用的原理与其大体相似 ,但
DREAM 技术是通过引进的限制性内切酶位点对转化子进行鉴
定 ,虽然避免了使用测序法对突变产物的筛选[ 6 ,9] , 但由于设
计和引入的限制性酶切位点必需与突变位点相匹配 , 因此存
在很大的局限性 , 而本实验介绍的定点突变方法可以将目的
基因碱基按照要求任意突变 , 因此可广泛应用于基因调控以
及蛋白质结构与功能之间的研究。
综上所述 , 本研究介绍了一种经济 、高效 、简便快捷的定
点突变方法 ,为基因表达调控以及蛋白质结构和功能的研究
提供了技术支撑。
参考文献:
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正交设计优化缩叶藓属植物的 ISSR-PCR反应体系
沙伟1＊ ,王助文1 ,曹同2(1.齐齐哈尔大学生命与科学工程学院 ,黑龙江 齐齐哈尔 161006;2.上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘要:目的:建立缩叶藓属(Ptychomitrium)植物 ISSR-PCR反应的最佳体系。方法:利用正交设计实验的方法 , 采用引物 562 ,
10 号材料 Ptychomitrium gardneri为模板对缩叶藓属植物的 ISSR-PCR反应体系中的5 种主要因素(Mg2+、dNTPs 、引物 、模板量 、Taq
酶量)在 4 个水平上进行体系优化。结果:确定了缩叶藓属(Ptychomitrium)植物 ISSR-PCR反应的最佳体系(25μl)为:Mg2+浓度为
3.2mmol L、dNTPs浓度为 0.96mmol L、引物浓度为 1.04μmol L、模板量 10ng、Taq 酶量 1.5U。利用该体系 , 采用引物 564 在 16 个材
料中能有效扩增。结论:这一优化体系的建立为以后缩叶藓属植物的 ISSR遗传多样性的分析奠定了基础。
关键词:正交设计;ISSR-PCR;缩叶藓
中图分类号:Q781;Q943.2　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2009)05-0032-03
Study on Optimization for ISSR-PCR Reaction System of
Ptychomitrum using Orthogonal Design
SHA Wei
1＊ ,WANG Zhu-wen1 ,CAO Tong2
(1.College of Life Science and Engineering , Qiqihar University , Qiqihar 161006 , China;2.Shanghai Normal University , Shanghai 200234, China)
Abstract:Objective:Develop the most suitable ISSR-PCR system for Ptychomitrum.Method:The orthogonal design was used to optimize inter
-simple sequence repeat PCR(ISSR-PCR)amplification system on Ptychomitrum in five factors(Mg2+ , dNTPs , primer , DNA template and
Taq DNA polymerase)at four levels respectively.Result:The most suitable ISSR-PCR system for Ptychomitrum was established , namely 25μl
reaction system containing 3.2mmol L Mg2+ , 0.96mmol L dNTPs , 10ng DNA template , 1.04μmol L primer , and 1.5U Taq DNA polymerase.
Using the optimized reaction , 16 Ptychomitrum materials were easy amplified with primer 564.Conclusion:The result provided a standardizing
program for the analysis of interspecies genetic diversity of Ptychomitrum.
Key words:orthogonal design;ISSR-PCR;Ptychomitrium
收稿日期:2009-05-11;修回日期:2009-06-22
基金项目:国家自然科学基金项目(“世界缩叶藓属植物的分子生物地
理学与系统发育研究” , No.30770141)资助
作者简介:沙伟(1963-),女 ,教授 ,博士生导师 ,从事植物遗传学方面
的研究 , Email:Shw1129@263.net。
　　缩叶藓属(Ptychomitrum)植物是苔藓植物中耐干旱的重要
类群[ 1] 。对于该属的研究 , 经典分类 、形态解剖学等方法的分
类修订工作已经基本完成 ,也得到一些重要成果[2-7] , 但是还
缺乏分子数据的支持。本项目其中的一部分即通过 ISSR标记
技术为缩叶藓属前期工作提供分子依据。
简单序列重复间区(inter-simple sequence repeats , ISSR)分
子标记技术是由 Ewa Zietkiewicz[8]等提出的 , 该技术检测的是
两个 SSR(imple sequence repeats , SSR)之间的一段短 DNA 序列
的多态性。 ISSR所用引物长度一般在 20 个核苷酸左右 , 且多
数是基于双核苷酸重复的序列 , 它对具有相同重复形式的许
多SSR座位进行筛选 ,使得最终扩增出的 ISSR片段不致太多 ,
ISSR标记呈孟德尔遗传 ,它具显性或共显性特点 , 其稳定性比
RAPD好[ 9] 。
但对于不同的反应体系和扩增程序 , ISSR的结果是不同
的 , 因此有必要对其各个因素和扩增程序进行摸索优化 , 以得
到最佳反应结果。影响 ISSR结果的主要因素有:Mg2+浓度 、
dNTPs浓度 、引物浓度 、DNA模板量 、Taq酶量及引物退火温度。
本试验主要是针对 ISSR反应体系的 5 个因素在 4 个水平上对
缩叶藓属植物进行 PCR体系优化 , 为进一步利用 ISSR分子标
记技术开展中国缩叶藓属植物的种间遗传变异分析奠定基
础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验材料
实验材料为 16 个缩叶藓属植物(见表 1),其中 10 号材料
(Ptychomitrium gardneri)为正交设计试验材料 , 提取其基因组
DNA 作为 PCR反应模板。
32　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(5)
表 1　16个缩叶藓属植物材料
Table 1　Sixteen Ptychomitrum plant materials
编号
(No.)
种名
(Species)
采集地
(Locus)
标本凭证
Voucher
采集日期
1 中华缩叶藓
(Ptychomitrium sinense)
浙江南浔小道庄 李泽 20080428
2 中华缩叶藓
(Ptychomitrium sinense)
上海佘山 李范梅
468
19640511
3 齿边缩叶藓
(Ptychomitrium dentatum)
四川汶川县威
世镇七盘沟村
贾渝
J06730
20020817
4 齿边缩叶藓
(Ptychomitrium dentatum)
陕西户县涝峪
八里坪附近
魏志平
443
19620910
5 扭叶缩叶藓
(Ptychomitrium tortula)
云南丽江玉龙
雪山
曹同等
506
200703
6 扭叶缩叶藓
(Ptychomitrium tortula)
西藏察隅县奇
马拉山
王楣芝
1279-a
19820927
7 狭叶缩叶藓
(Ptychomitrium linearifolium Reim.)
四川峨眉山
万年寺石笋沟
何强
1367
20050913
8 狭叶缩叶藓
(Ptychomitrium linearifolium Reim.)
甘肃文县刘家
坪关口
贾渝
09175
20070518
9 多枝缩叶藓
(Ptychomitrium gardneri)
贵州梵净山 曹同等
1442
200703
10 多枝缩叶藓
(Ptychomitrium gardneri)
甘肃文县碧口
小团渔河
贾渝
09121
20070507
11 威氏缩叶藓
(Ptychomitrium wilsonii)
浙江开化古田山
自然保护区
田春元
0688
19930510
12 威氏缩叶藓
(Ptychomitrium wilsonii)
福建将乐县陇
西山沙溪仔
王楣芝
47839
19910528
13
东亚缩叶藓
(Ptychomitrium fauriei Besch.)
湖北神农架林区
宋洛山下桐茶沟
吴鹏程
63
19760621
14 东亚缩叶藓
(Ptychomitrium fauriei Besch.)
安徽黄山
平天石上
周宝琴
24
1963
15 台湾缩叶藓
(Ptychomitrium formosicum Broth.&Yas.)
台湾钟县小更山
土坡土生
曹同等
970987
19981023
16 台湾缩叶藓
(Ptychomitrium formosicum Broth.&Yas.)
台湾钟县小更
山树干生
曹同等
980950
19981023
1.1.2　试剂
dNTPs、Marker DL2000 购自北京鼎国生物技术有限责任公
司 ,Mg2+ 、Buffer、Taq 酶 、引物均购于上海生工生物工程技术有
限公司。通过几次试验 ,初步筛选出引物 562 作为此次正交实
验的固定引物。
1.2　方法
1.2.1　基因组 DNA 的提取
参照孙华钦[ 10]等 CTAB方法 ,稍微有些改进 , 提取了 16个
缩叶藓属植物基因组的 DNA 。采用 Gene SpecI(日本产)核酸
测定仪测定了它们的浓度和纯度 ,并用 0.8%的琼脂糖凝胶电
泳检测基因组 DNA 的完整性。
1.2.2　ISSR-PCR正交设计试验
参照李传香[ 11] 的 ISSR-PCR 反应体系 , 采用 ISSR引物
562 ,10 号材料作为模板 DNA。 针对 5 个主要因素(Mg2+ 、
dNTPs、引物 、模板量 、Taq 酶量)在 4 个水平上进行正交设计 ,
采用 L6(45)正交表进行试验。设计方案见表 2 ,共 16 组 , 每一
组进行 2次重复实验 , 共 32管。在美国 PE-9600 型PCR仪上
进行扩增 ,反应体系 25μl , 除表中的因素外 , 还有 1×buffer(不
含Mg2+), 加双蒸水至 25μl。
ISSR-PCR反应程序为:94℃预变性 5min;94℃变性 45s ,
54℃退火 45s , 72℃延伸 , 35 循环;72℃延伸 7min;4℃保存。
1.2.3　ISSR优化所得体系的验证
用正交结果得到的最优体系 , 用 16 个材料 , 采用筛选的
引物进行验证。PCR扩增程序中退火温度采用筛选的各个引
物的退火温度 ,其他程序不变。
1.2.4　ISSR-PCR产物的电泳检测
ISSR-PCR反应产物采用 1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙
锭)电泳检测 , 电泳缓冲液为 0.5×TBE , 采用恒电压 140V(电
泳槽长约 30cm), 电泳时间约 40min。电泳完成之后 ,直接在在
紫外凝胶成像系统(UVP GDS-8000)下拍照记录。
表 2　PCR扩增体系的正交设计表
Table 2　Orthogonal array for PCR amplified system
编号
No.
因素 Factors
Mg2+
(mmol L)
dNTPs
(mmol L)
引物
(μmol L)
模板DNA
(ng 25μl)
Taq酶
(U 25μl)
1 1.6 0.48 0.88 10 0.5
2 1.6 0.64 1.04 20 1.0
3 1.6 0.80 1.20 30 1.5
4 1.6 0.96 1.36 40 2.0
5 2.4 0.48 1.04 30 2.0
6 2.4 0.64 0.88 40 1.5
7 2.4 0.80 1.36 10 1.0
8 2.4 0.96 1.20 20 0.5
9 3.2 0.48 1.20 40 1.0
10 3.2 0.64 1.36 30 0.5
11 3.2 0.80 0.88 20 2.0
12 3.2 0.96 1.04 10 1.5
13 3.8 0.48 1.36 20 1.5
14 3.8 0.64 1.20 10 2.0
15 3.8 0.80 1.04 40 0.5
16 3.8 0.96 0.88 30 1.0
2　结果与分析
2.1　ISSR-PCR正交设计结果及分析
正交结果的电泳图见图 1 , 各个体系都出带 , 一般都为 4
条带 ,但体系 12 出了 7 条带 , 多态性与清晰度最好 , 重复试验
的结果与此基本一致 , 因此确定缩叶藓属植物的 ISSR-PCR
最佳反应体系为:反应体系为 25μl , Mg2+为 3.2mmol L、dNTPs
为 0.96mmol L、引物为 1.04μmol L、模板量约为 10ng、Taq 酶量
为 1.5U ,其它成份为双蒸水。
图 1　ISSR-PCR 正交试验结果(1-16 为处理编号 , 见表 2;M 为
DL2000)
Figure 1　Elect rophoresis of ISSR-PCR Orthogonal design(1-16 , Treatment
number , showed in the Table 2;M , DL2000 marker)
2.2　退火温度的确定
根据上面选择的最佳反应体系 , 对各个引物进行退火温
度的筛选 , 温度设置从 48℃～ 57℃。从试验数据得知:在退火
温度较低时 , 产生 DNA 条带数不一定多 ,有的低退火温度很可
能无条带或条带很弱 , 推测其可能在低退火温度下 , 引物与模
板结合的作用力被减弱;退火温度低 , 很多时候扩增出来的
DNA 条带很多 ,但条带很粗但亮度不高。随着退火温度的升
高 ,扩增的 DNA 条带有变化 , 但最重要的是条带清晰度在增
加。因此根据条带的清晰度和条带的多态性选择了各个引物
的退火温度 , 如最后选定引物 564 的退火温度为 55℃。
2.3　模板 DNA 的影响
本试验所用的材料很多是很早采集的材料 , 如 2 号材料
Ptychomitrium sinense采自 1964 年 , 其 DNA 提取电泳检测条带
基本看不见(见图 2), 说明提取得到的 DNA 量很少 , 但 ISSR-
PCR试验中仍然能扩增 DNA 条带(见图 3), 推测有两种可能:
(1)缩叶藓属植物很耐旱 , 采集的标本在放置很多年之后 , 可
能还具有生命力[ 12] 。(2)用于分子试验的 DNA 量少不是问
332009 年 19(5)　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
题 ,但关键是所提取的 DNA 中含的杂质要少。提取材料 DNA
的方法很多 ,有些方法是很省时 ,且提取的 DNA 量多 , 但其所
含杂质多 ,因而不能很好地用于研究[ 13] 。但试验材料采集的
时间早 , DNA 降解是必然存在的 , 如 14 号材料 Ptychomitrium
fauriei Besch.,提取的 DNA 见图 2 , 在 ISSR 试验中扩增的条带
模糊不清 ,见图 3。因此模板 DNA 要求纯度高 ,且基因组 DNA
完整。
图 2　16种缩叶藓属植物的DNA提取电泳结果(1-16为材料编号 ,见
表 1;M 为DL2000)
Figure 2　Electrophoresi s of sixteen Ptychomitrum plant materials(1-16 ,
Treatment number , showed in Table 1;M , DL2000 marker)
图 3　引物 564的 ISSR扩增结果(1-16为 16个材料编号 ,与表 1中编
号相对应;M为 DL2000)
Figure 3　Amplified ISSR electrophoresis with primer 564(1-16 , Treatment
number corresponded with Table 1 s;M ,DL2000 marker)
2.4　体系中其它因素的影响
通过试验数据确定 , 对于本试验中影响最大的因素为
dNTPs浓度和引物浓度。最开始用引物 570(AG)8C 优化的体
系为 25μl:Mg2+为 2.5mmol L , dNTPs 为 0.44mmol L , 引物为 0.
28μmol L , DNA约为 20ng , Taq 酶量为 2U。对于同一个材料(表
2 中 10号),共试验 7 个引物 570-(AG)8C 、556-(CA)8ART、
555-(TC)8C、562-AGA(TC)7 、567-(AG)8CT、564-(GA)8GC 、
566-(AC)8CT ,只有 570 引物出带 ,说明这个体系是不通用的。
参阅关于苔藓 ISSR方面优化的论文 , 其 ISSR体系中 dNTPs 浓
度和引物浓度也很高 , 如李传香等[14] 建立的 ISSR 体系中
dNTPs浓度达到了 1.2mmol L , 引物浓度达到了 1.6μmol L。这
可能与材料和药品都有关 ,如王红玲等[ 15]等用荒漠刺叶墙藓
的 ISSR体系的各种药品浓度就很低。
2.5　最优体系的验证
采用优化的体系进行了其他筛选引物的 ISSR-PCR 试
验 ,都能很好地扩增出多态性条带 , 如采用引物 564 ,退火温度
55℃,试验材料为表中的 1 ～ 16 号材料 , 扩增结果如图 3。材
料 1-16号材料都能很好地扩增出多态性条带 ,说明这个体系
是适用于缩叶藓属植物的 ISSR遗传变异研究。
3　讨论
(1)影响 ISSR-PCR结果的因素很多 , PCR反应中每一种
成分都是很重要的 , 但对于本试验 , 反应体系中引物浓度和
dNTPs的浓度都很高 , 可以看成一个很大的影响因素。因此对
于 ISSR体系的筛选 , 可以先从这两个因素进行筛选 ,以确定它
们的可选范围。
(2)模板 DNA是 ISSR-PCR反应体系的一个重要的影响
因素 , 其纯度必须要求高。其他因素如退火温度也很有必要
进行筛选 , 以得到最佳的 PCR扩增效果 , 这对于后边的数据处
理也是很有帮助的。此外 , 有的缩叶藓属材料采集时间早 , 虽
然提取其 DNA 量少 , 但是采用其 DNA 仍然能很好地扩增出
ISSR条带 , 这也在一定程度上说明了它是藓类植物分类系统
中的耐干旱的重要类群。
(3)国内外对苔藓植物的研究很多是集中在形态学方面 ,
在分子上的研究也是这几年刚刚兴起[ 16] , 对于缩叶藓属植物
分子系统学的研究是一个空白。 本试验通过正交设计建立了
缩叶藓属的 ISSR-PCR反应的优化体系 , 为 25μl体系中:Mg2+
3.2mmol L、dNTPs 0.96mmol L、引物 1.04μmol L、模板量 10ng、
Taq 酶量 1.5U。这对于今后缩叶藓属植物的 ISSR分子标记研
究无疑是一个良好的开端。
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用于微生物多样性分析的棉田土壤总 DNA的提取
张静文 ,罗明＊ ,徐文修 ,肖正群
(新疆农业大学 农学院 ,新疆 乌鲁木齐 830052)
摘要:目的:探讨适用于微生物多样性研究的棉田土壤微生物总 DNA 提取方法。方法:采用 4 种方法提取不同连作和轮作
处理的棉田土壤微生物总 DNA , 比较其纯度 、产率 、片段大小 , 并应用 ARDRA 技术验证其质量。 结果:其中 3 种方法均可获得
23kb的 DNA片段 ,但不同方法提取的 DNA 的产率和纯度上有明显差异。改良 CTAB-SDS 法提取的 DNA 完整性好 , 得率为
34　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年 19(5)