全 文 ：2012 年 22(3) 生 物 技 术
16135 － 16141.
［17］Duhring U，Ossenbuhl F，Wilde A. Late assembly steps and dynamics
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［18］Albus CA，Ruf S，Schottler MA，et al. Y3IP1，a nucleus － encoded thy-
lakoid protein，cooperates with the plastid － encoded Ycf3 protein in photo-
systemⅠassembly of tobacco and Arabidopsis［J］. The Plant Cell，2010，
22 (8) :2838 － 2855.
毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因克隆及序列分析
沙伟，于冰* ，刘卓
(齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:目的:该文首次从毛尖紫萼藓中克隆到泛素延伸蛋白基因的全长，为深入研究其功能打下基础。方法:提取植物的总
RNA，经反转录得到 cDNA，根据实验室得到的毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的 EST序列设计引物，基于 3’RACE (Rapid Ampli-
fication of cDNA End )技术克隆得到全长序列，使用分子生物学软件进行序列分析。结果:获得了 cDNA 全序列，GenBank 登录
号为 JQ659260，序列全长为 673bp，开放阅读框为 471 bp，编码 156 个氨基酸残基。结论:通过 Blast P对其编码的氨基酸序列进
行比对结果显示:毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白与小立碗藓、北美云杉、葡萄、蓖麻、毛果杨、紫茎泽兰的泛素延伸蛋白的同源性均在
96%以上。
关键词:毛尖紫萼藓;泛素延伸蛋白基因;3’RACE 基因克隆;生物信息学
中图分类号:Q781;Q949 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 55
Cloning and Characterization of Ubiquitin Extension
Protein Gene in Grimmia pilifera
SHA Wei，YU Bing* ，LIU Zhuo
(College of Life Science and Agriculture Forestry，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract:Objective:Cloning the ubiquitin extension protein from Grimmia pilifera for the first time，that was the foundation for further
gene function study. Method:Total RNA was extracted from plant. Then reverse transeripted by M － MLV. According to the ubiquitin ex-
tension protein EST sequence of Grimmia pilifera to design primer. Using 3 ’RACE technology (Rapid Amplification of cDNA End)to am-
plification. Analysising sequence with the molecular biology software. Result:The full － length cDNA of ubiquitin extension protein gene is
673bp (GenBank Accession No. JQ659260) ，containing a 471bp open reading frame (ORF) ，encodes a residue of 156 amino
acids. Conclusion:The results by analysising the homology of encoded amino acid sequence show that，the deduced amino acid sequence
showed more than 96% similarity with the corresponding ubiquitin extension protein fragment of the Physcomitrella patens，Picea sitchensis，
Vitis vinifera，Ricinus communis，Populus trichocarpa，Ageratina adenophora. The sequence information of the fragment indicates that this is
the ubiquitin extension protein gene fragment.
Key words:Grimmia pilifera;ubiquitin extension protein gene;3’RACE;bioinformatics
收稿日期:2012 － 02 － 14;修回日期:2012 － 05 － 04
基金项目:国家自然科学基金项目(“紫萼藓科植物耐旱特征及分子进
化的研究”，No. 31070180)资助
作者简介:沙伟(1963 －) ，女，黑龙江省齐齐哈尔人，教授，博士生导
师，从事植物学、植物遗传学方面研究，发表论文 130 余篇、专著 4 部，
Email:shw1129@ 263. net。* 通讯作者:于冰(1985 －) ，女，黑龙江省
齐齐哈尔人，在读硕士，从事植物遗传学方面研究，Email:yubingyc@
163. com。
0 引言
泛素是由 76 个氨基酸组成的高度保守的低分子量蛋白
质，广泛的存在于真核生物中［1］。泛素蛋白在真核细胞中主
要以两种形式存在:一种是多聚泛素基因(polyubiquitin
genes) ，由多个泛素单体头尾相连组成;另一种称为泛素延伸
蛋白(Ubiquitinextension protein) ，是由泛素单体 C －末端同核
糖体多肽构成的拓展肽［2］。泛素延伸蛋白又分成两种，一种
是 ubiquitin /L40 泛素延伸蛋白由 c 末端和 52 或 53 个氨基酸
的核糖体 L40 (ribosomal L40)多肽相融合;第二种是 ubiquit-
in /S27a泛素延伸蛋白是由 C末端和 76 ～ 78 个氨基酸的核糖
体 S27a(ribosomal S27a)多肽相融合［3］。泛素在蛋白质水解途
径中起着重要的作用，它可用来标记生物体内需要降解的蛋
白，参与细胞周期调整、细胞生长与凋亡、细胞信号感受、离子
通道、免疫应答、转录催化等多种重要的生命过程［4］。
毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)是种典型的旱生藓类，它属
于紫萼藓科(Grimmiaceae)中的紫萼藓属(Grimmia) ，有着非常
强的抗旱性［5］。目前，在紫萼藓科植物中关于泛素的研究尚
未见报道。为了进一步研究苔藓泛素基因与其他生物泛素基
因的同源性，以及泛素与苔藓植物抗逆性的关系，本文以毛尖
紫萼藓为材料，利用 3 RACE方法克隆其 cDNA 全长，采用生
物信息学方法对基因序列及蛋白特性进行分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)采集于黑龙江省五大连池。
选取长势较好的材料，用水冲洗干净后，经过 7 ～ 8d 室温培
养，用镊子取顶端绿色部分，迅速置于 － 80℃冰箱保存备用。
1. 1. 2 试剂
实验所用大肠杆菌 DH5α 为作者实验室保存;pMD － 18T
9
生 物 技 术 2012 年 22(3)
载体，胶回收试剂盒，购自大连宝生物公司;DNase Ⅰ酶购自
Promage 公司;Taq 酶购自上海生工生物公司;SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit购自 Clontech。
1. 1. 3 仪器
高速冷冻离心机、核酸蛋白检测仪、PCR 仪、紫外凝胶成
像系统、摇床等。
1. 1. 4 培养基
LB液体培养基、LB固体培养基。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA的提取及和 SMART cDNA的合成
毛尖紫萼藓总 RNA 提取采用改良的 SDS 法［6］，用 1. 0%
的琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，使用 NanoDrop 2000
核酸蛋白检测仪测定其纯度和浓度。利用 DNaseⅠ酶
(Promage)去除 RNA中的 DNA 污染，以纯化的 RNA 为模板，
利用 3 CDS primer A引物与逆转录酶 SMARTScribeTM Reverse
Transcriptase 进行 cDNA的逆转录合成。
1. 2. 2 毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因 cDNA的 3’RACE
从 作者实验室已构建的毛尖紫萼藓干旱 cDNA 文库
中［7］，得到一条 5端完整的泛素延伸蛋白 EST序列，对其进行
3’RACE全长扩增，采用 Primer 5. 0 软件设计基因特异引物
GSP:CTACCCTTCATCTGGTGCTCCGTCTGCG 及巢式引物 NG-
SP:CAGTTCTACAAGGGGACGACTCTGGCA。使 用 GSP 和
UPM引物，采用逆转录得到的 cDNA作为模板，开始第一轮的
PCR扩增;之后将其产物进行稀释至 50 倍，以 UPM 与 NGSP
为引物开始第二轮的 PCR 扩增。PCR 反应条件为:94℃预变
性 5min;94℃ 30s，68℃ 30s，72℃ 3min，25 个循环。PCR 产物
1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 2. 3 生物信息学分析
通过 NCBI 的 CDD 数据库(http:/ /www. ncbi. nlm. nih.
gov /Structure /cdd /wrpsb. cgi)预测毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白的
保守区域;序列蛋白质的疏水性通过 ProtScale(http:/ /
www. expasy. org / tools /protscale. html)在线软件，利用默认算法
(Hphob. /Kyte＆Doolittle)进行预测;序列的蛋白质理化性质应
用 ProtParam tool 工 具 (http:/ /www. expasy. ch / tools /
protparam. html)来完成;蛋白质的亚细胞定位利用 PSORT Pre-
diction软件(http:/ /psort. ims. u － tokyo. ac. jp / form. html)来推
测。蛋白质二级结构预测通过 http:/ /bioinf. cs. ucl. ac. uk /
psipred / 完成。通过 GenBank 对目的基因进行 Blast 分析，
Clustal X软件进行多序列比对，使用 MEGA5 软件构建系统进
化树。
2 结果与分析
2. 1 毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的 3RACE 扩增
提取毛尖紫萼藓总 RNA，反转录得到 cDNA，通过毛尖紫
萼藓泛素延伸蛋白基因 EST序列设计特异引物，采用 3RACE
技术扩增该基因的 3 －末端，获得的 DNA片段与预期大小一
致(图 1) ，将目的基因的电泳条带进行胶回收。PCR 产物经
纯化后，将其与 pMD － 18T 载体连接、转化，挑取阳性克隆进
行测序。
2. 2 毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的序列分析
图 1 3 RACE扩增结果
M. Marker(Takara DL2000) ;1. 3RACE扩增结果。
Fig. 1 The result of 3 RACE
M. DL2000 Marker;1. 3 RACE fragment.
根据 3 RACE测序结果，去除载体序列经 Bioedit 拼接获
得基因全长序列。结果显示，cDNA全长 673bp，含有一个长度
为 471bp的完整开放阅读框，5非翻译区长度为 96bp，3非翻
译区为 106bp，该序列包含起始密码子 ATG，终止密码子 TAG，
编码 156 个氨基酸，在 3’－ UTR 区，有一个 22bp 的 polyA 尾
巴。
2. 3 目的基因的生物信息学分析
对推定的毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白氨基酸序列进行 Prot-
Param预测，可知其相对分子质量为 17. 8kD，理论等电点 pI是
9. 81，不稳定系数为 29. 12，为稳定蛋白质。负电荷 (Asp +
Glu)残基的总数是 17，正电荷 (Arg + Lys)残基的总数是 34。
亚细胞定位结果显示，毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白主要分布在
分布在细胞核和线粒体基质中。利用 CDD(Conserved Domain
database)的数据库预测基因的蛋白保守区，从图可以看出与
其匹配的蛋白保守区有 3 个，它们同属泛素超家族(UBQ su-
perfamily) (图 2)。
应用 ProtScale预测蛋白的疏水性，结果发现该蛋白质 N
端具较强的疏水区，从图 3 可看出该蛋白质的亲水性较弱，可
能增加后期蛋白质纯化工作的难度。
利用伦敦大学计算机科学系生物信息学联合研究基金委
员会创立的 PSIPRED蛋白预测程序对毛尖紫萼藓泛素延伸蛋
白进行二维结构预测［8］，结果如图 4 所示。
通过 Blast P比对分析，结果表明毛尖紫萼藓泛素蛋白的
氨基酸序列与其他物种具有较高的同源性，其中同源性最高
的是小立碗藓(Physcomitrella patens)泛素延伸蛋白(XP _
001774978. 1) ，高达 99%。其次与北美云杉泛素延伸蛋白
(Picea sitchensis，ABR16172. 1)、毛果杨(Populus trichocarpa，XP
_002297752. 1)、葡萄(Vitis vinifera，XP_002279878. 1)、紫茎泽
兰(Ageratina adenophora，ADF36485. 1)、蓖麻(Ricinus commu-
nis，XP_002525394. 1)等都具有 96%以上的同源性，暗示毛尖
紫萼藓泛素延伸蛋白与这些蛋白有着相同或者相似的功能。
多序列比对的结果如图 5 所示。
01
2012 年 22(3) 生 物 技 术
图 2 泛素延伸蛋白基因的氨基酸序列保守区推测
Fig. 2 Predict for conserved domains of Ubiquitin Extension Protein deduced amino acids equence
图 3 预测泛素延伸蛋白基因的疏水性结果
Fig. 3 Predict for hydrophobicity of Ubiquitin Extension Protein
选取其中 21 个物种的泛素延伸蛋白序列，利用 MEGA 5
构建系统发育树(图 6) ，结果显示，在比较的物种中毛尖紫萼
藓与小立碗藓的亲缘关系最近，它们与北美云杉聚为一类。
3 讨论
在作者实验室构建的毛尖紫萼藓 cDNA文库的基础上，通
过 3RACE技术获得了毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因的全长
cDNA，含 673 bp，编码 156 个氨基酸，5UTR 和 3UTR 分别为
96 bp和 106bp，表明该 cDNA 是一个完整度较好的全长 cD-
NA。对该 cDNA序列进行了序列特征、蛋白质的理化性质分
析，疏水性及蛋白质二级结构预测，亚细胞定位等较为系统的
生物信息学分析，结果表明毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白基因具
有高度的保守性，主要分布在细胞质和线粒体基质中，这与前
人的研究结果一致。
有关泛素的研究主要集中在人、酵母、昆虫及种子植物
中［9，10］，大多数处于基因克隆及表达载体构建阶段。随着分
子生物学的快速发展，在植物的代谢研究中泛素介导的蛋白
质降解途径开始发挥着重要的作用［11］。蛋白质依赖泛素的降
解途径(ubiquitin － dependent proteolytic pathway)具有高度的
选择性，称为泛素 /26S通路蛋白酶体或 Ub 途径。它通过不正
常蛋白的降解或调节功能蛋白质的周转，实现对多种代谢过
程的调节［12］。泛素延伸蛋白是泛素系统中的重要组成部分，
近来对其在激素信号传导中的作用研究成为热点［13］。其中泛
素连接酶 E3 决定底物蛋白的特异性选择。最近的研究表明，
泛素连接酶 E3 在植物干旱胁迫中发挥着重要作用［14］。
图 4 预测泛素延伸蛋白的二级结构结果
Fig. 4 Predict for Protein secondary structure of Ubiquitin Extension Pro-
tein
本研究中得到的泛素延伸蛋白很可能与桑树的泛素延伸
蛋白［15］同属于同一类型，即 ubiquitin /S27a泛素延伸蛋白。当
植物受到干旱、低温胁迫时会增加泛素蛋白的表达，在蛋白质
水解过程中泛素可以作为一个共价的受限制识别信号。Kiyo-
sue等在干旱处理 1h 的拟南芥中克隆到一个泛素延伸蛋白，
该蛋白不受 ABA的诱导，主要通过降解异常蛋白来保护植物
细胞，这说明 ubiquitin /L40 泛素延伸蛋白在植物抵御干旱胁
迫过程中是重要的组成因素［16］。宋晓毅等在本氏烟中克隆得
到一个泛素延伸蛋白基因 NbUEP，并对其进行了功能验证，结
果表明该基因在植物生长发育、细胞凋亡及各种抗逆性等重
11
生 物 技 术 2012 年 22(3)
要生物过程中起到调控作用［17］。对玉米进行高温、低温、SA、
盐、PEG、MJ、脱水等多种胁迫，发现其泛素蛋白基因 ZmERD1
表达发生显著变化，可以推测玉米在受到各种外界胁迫时
ZmERD1 基因通过多种应答机制发挥了调控的作用［3］。研究
表明小麦泛素单体基因 Ta － Ub2 表达受水分胁迫调控，中度
水分胁迫(20%PEG －6000)时表达量升高，重度水分胁迫(30%
PEG －6000)时表达量下降，Ta － Ub2 的过量表达增强了烟草幼
苗的长势，同时提高了转基因烟草的耐旱性和耐盐性［18］。
图 5 毛尖紫萼藓与几种植物的 Ubiquitin基因编码氨基酸序列比对
Fig. 5 Protein homology comparison of ubiquitin gene in several species
图 6 22 种植物泛素延伸蛋白的聚类图
Fig. 6 The schematic classification diagram of Ubiquitin Extension Protein
from 22 plants
苔藓植物在长期的历史进化过程中积累了大量的抗逆基
因。特别是一些耐旱藓类，抗旱、耐高温性极强，是优异的抗
旱基因资源。紫萼藓属植物多生于高山岩石面或岩面薄土，
它可以抵御极端干旱并在干燥几年后重新给水后瞬间恢复活
力，是研究植物体对干旱应答重要的研究材料［19］。通过对毛
尖紫萼藓泛素基因全长 cDNA的克隆，为进一步研究其在苔藓
中的抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据。
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羊传染性脓疱病毒新疆流行株 F1L基因克隆及表达
李瑞芳，乔军，张辉，陈创夫*
(石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832000)
摘要:目的:为了探讨 F1L重组蛋白作为羊传染性脓疱病毒亚单位疫苗的可行性。方法:以分离出羊传染性脓疱病毒 ORFV
－ shz分离株为模板，扩增 F1L基因片段，并将其克隆至 pMD18 － T 载体中进行测序。构建原核表达载体 pET － 32a － F1L，转化
至大肠埃希菌 BL21，用 SDS － PAGE及 Western blot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性。结果:PCR扩增出 F1L基因全长 1
023bp，共编码 340 个氨基酸;推导的氨基酸序列中第 1 ～ 70 位氨基酸构成信号肽序列，第 285 ～ 313 位氨基酸为跨膜区。SDS －
PAGE分析表明获得了约 57. 4kDa的融合蛋白，在 Western － blotting检测中，融合蛋白可与羊传染性脓疱病毒阳性血清发生特异
性反应，表明其具有良好的反应原性。结论:成功构建 F1L基因的原核表达载体，为研究新疆地区羊传染性脓疱的防治及疫苗开
发提供了科学依据。
关键词:羊传染性脓疱病毒;F1L基因;序列分析;原核表达;反应原性
中图分类号:Q789 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 56
Cloning and Expression of F1L Gene of Orf Virus in Xinjiang
LI Rui － fang，QIAO Jun，ZHANG Hui，CHEN Chuang － fu*
(College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi 832000，China)
Abstract:Objective:In order to investigate the viability of F1L recombinant proteins as contagious ecthyma virus subunit
vaccine. Method:The F1L gene fragment was amplified from the genome of ORFV － shz strain and ligatured with pMD18 － T vector for se-
quencing. The recombinant prokaryotic expression vector pET － 32a － F1L was constructed，and transformed into Escherichia coli BL21. The
expressed protein was analyzed by SDS － PAGE，and the reactinoge － nicity of the protein was detected by Western blot. Result:The F1L
gene was 1023bp，which encoded 340 amino acids. The front 70 amino acids constitute signal peptide，and 285 － 313 amino acids from
transmembrane. Target protein analyzed by SDS － PAGE was about 57. 4kDa in side. Western － blotting showed the protein could specific-
ally interact with ORFV positive serum，indicating that the protein had good reactinogenicity. Conclusion:The recombinant prokaryotic ex-
pression vector pET － 32a － F1L was successfully constructed，and our study should be viewed as a new window of opportunity in preven-
tion and vaccine development of Orf in Xinjiang area.
Key words:Contagious Ecthyma Virus;F1L gene;sequence analysis;prokaryotic expression;reactinogenicity
收稿日期:2012 － 03 － 06;修回日期:2012 － 04 － 09
基金项目:国家“973”计划项目(2010CB30203) ;国际科技合作项目
(2006DFA33740)资助
作者简介:李瑞芳(1985 －) ，女，河南新乡人，硕士研究生，从事畜禽病
原分子生物学研究，Email:376670603@ qq. com。* 通讯作者:陈创夫
(1962 －) ，男，博士，教授，博士生导师，国务院特贴专家、农业部突出
贡献专家，研究方向:畜禽病原分子生物学，Email:ccf － xb@ 163. com。
羊传染性脓疱(Contagious Ecthyma，CE)亦称羊传染性脓
疮(Ecthyma Contagiosum)、羊口疮(Orf)、接触传染性脓疱皮
炎(Contagious pustular dermatitis，CPD)等［1］，是由痘病毒科
(Poxviridae)副痘病毒属(Parapoxvirus)的羊传染性脓疱病毒
(Orf Virus，ORFV)所引起的一种绵羊和山羊的接触性传染病。
临诊以在口唇、舌、鼻、乳房等部位形成红斑、丘疹、水疱、脓疱
和痂皮为特征［2］。该病对羔羊危害非常严重，也可感染人，为
人畜共患病［3］。ORFV属于高度嗜上皮病毒，在血液中产生的
抗体水平较低，其主要以细胞免疫和局部免疫为主［4，5］，所以
一般用常规方法无法检测到。目前研究证明，F1L基因可以产
生免疫刺激。Gallina S和 Scagliarini A. 等人以表达 F1L 探索
亚单位疫苗的开发，用表达的全长 FIL 蛋白免疫兔子后，产生
了中和抗体［6］。本实验从 ORFV － shz分离株中克隆了 F1L基
因，并进行原核表达，且对其表达产物进行了 SDS － PAGE 及
Western － blotting鉴定，为新疆地区预防该病而研制基因工程
苗奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 菌毒株和质粒
E. coli DH5α、BL21 菌株、原核表达载体 pET － 32a 均由石
河子大学人畜共患病实验室保存。ORFV 新疆石河子分离株
(ORFV － shz分离株)由作者实验室分离鉴定，保存备用。
1. 2 主要试剂
限制性内切酶 XhoⅠ和 BamHⅠ、T4 DNA 连接酶、PCR 反
应试剂、pMD18 － T 载体，总 DNA 提取试剂盒、DNA Marker 和
蛋白 Marker均购自 TaKaRa 公司;质粒 DNA 小量制备试剂盒
和 DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司;辣
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