全 文 ：　第 28卷 第 4期
2010年 11月 　　　　　　　
贵州师范大学学报(自然科学版)
JournalofGuizhouNormalUniversity(NaturalSciences)　　　　　　　　
Vol.28.No.4
Nov2010
文章编号:1004— 5570(2010)04-0029-04
编码真核启动因子 4E的毛尖紫萼藓基因 GH425
电子克隆及验证分析＊
沙　伟 ,吴　力＊
(齐齐哈尔大学 生命科学与农林学院 , 黑龙江 齐齐哈尔　161006)
摘要:GH425基因(genebankEST#:GPE204)来自毛尖紫萼藓干旱胁迫 cDNA文库 。本实验在小立碗藓核酸数
据库中 , 以 GH425基因为基因探针进行电子克隆 , 最终得到全长序列 GH425NO.1。经 ORFfinder分析 , 以最长
ORF设计引物 , 对毛尖紫萼藓进行 RT-PCR验证 , 得到了与之对应的条带 , 证明了毛尖紫萼藓中含有电子克隆的
片段 , 即电子克隆结果正确。经 Blastx分析 ,确定该序列编码真核启动因子 4E。
关 键 词:毛尖紫萼藓;eIF4E;抗旱;电子克隆;ORFfinder;Blast
中图分类号:Q949　　文献标识码:A
InsiliconcloningofGH425, agrimmiapiliferaP.Beauv
geneencodingaeukaryoticinitiationfactor4E
SHAWei, WULi＊
(CollegeofLifeSciencesandagroforestry, QiqiharUniversity, Qiqihar, Heilongjiang161006, China)
Abstract:GH425 genecomesfromtheGrimmiapiliferaP.BeauvdroughtstressofcDNAlibrary.In
thisexperiment, wehavegotthefulsequenceofGH425NO.1 byE-cloningwhichusingGH425 as
geneprobe, inPhyscomitrelapatensDNADatebase.ThroughusingORFfindertofindoutthelongest
ORFanddesignprimerforit, then, validatedthePhyscomitrelapatensbyPT-PCR, andwehaveob-
tainedcorrespondingbandandprovedthattheresultofsiliconcloningiscorrectandthefragmentis
containedinGrimmiapiliferaP.Beauv.Now, weknowthesequenceencodesEukaryoticinitiationfactor
4EbyBlastxanalyzing.
Keywords:GrimmiapiliferaP.Beauv;eIF4E;droughtstress;siliconcloning;Blast
　　苔藓植物在植物界算是小矮人 ,但是其足迹遍
布世界各地乃至各种极端环境 ,其顽强的生命力与
它的抗旱与抗寒能力分不开。毛尖紫萼藓(Grim-
miapiliferaP.Beauv)属于苔藓植物门(Bryophyta),
藓纲(Musci),紫萼藓科(Grimmiaceae),紫萼藓属
(Grimmia)。植物体多深绿色或者紫黑色 ,多生于
高山岩石或岩石薄土 ,为典型的耐旱藓类[ 1] 。它
可以抵御极端干旱并在干燥几年后重新给水后瞬
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＊ 收稿日期:2010-08-20
基金项目:黑龙江科技厅农业攻关项目;黑龙江省教育厅海外学人合作项目(1151hz022);齐齐哈尔大学生命科学与农林学
院遗传工程重点实验室基金支持。
作者简介:沙　伟(1963-), 女 ,教授 , 博士生导师 ,研究方向:植物学 、植物遗传学.E-mail:Shw1129@263.net
＊通讯作者:吴　力(1985-), 男 ,在读研究生 , E-mail:w3.1415926l@163.com
DOI :10.16614/j.cnki.issn1004-5570.2010.04.004
间恢复活力 ,是研究植物体对干旱应答重要的研究
材料。
PABP、eIF4G和 eIF4E在 mRNA5端和 3端
形成蛋白质桥使其环化 , 促进翻译 [ 2] 。真核细胞
起始因子 4E(eIf4E)是蛋白合成的限速因子 ,在蛋
白翻译中起关键作用 , 是调节基因表达的重要环
节 。它主要在翻译水平调节基因的表达;但它也可
以通过调节一些转录因子的表达来控制某些基因
的转录水平 [ 3] 。
目前的研究已确立植物 eIf4E或 eIF(iso)4E
与病毒复制存在互作关系 ,并在辣椒 ,莴苣等蔬菜
作物上有调控 eIf4E改变抗病毒性的作用[ 4 ～ 6] 。
Yoshi等研究表明 eIf4E的隐形突变对黄瓜花叶病
毒具有高度抗性 [ 7] 。 Ptushkina等研究表明 eIf4E
参与了盐及温度胁迫 ,为一个新的胁迫响应因
子 [ 8] 。
1　材料与方法
以毛尖紫萼藓 GH425基因片段为基因探针 ,
在 NIBBPHYSCObase(htp://moss.nibb.ac.jp/)
中 ,利用 Blastn[ 9]工具搜索与之有重叠部分的 con-
tigs序列 ,用 DNAman软件对其进行拼接。以拼接
好的 EST重叠群作为新基因探针 ,在 PHYSCObase
中继续搜索 ,直到无新 EST序列可供拼接为止。
然后用 ORFFinder(htp://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)对最终拼接序列进行分析 ,以最长
的 ORF序列为模板设计 PCR引物 ,通过 RT-PCR
的方法对毛尖紫萼藓进行验证。最后通过 Blastx
查询该序列对应的蛋白功能。
2　步骤与结果
2.1　GH425基因的电子克隆
以 GH425EST为基因探针 ,在 NIBBPHYSCO-
base中 Blast,以 Socre在 200以上的为筛选条件 ,
初步搜索到 4条符合条件序列 ,序列编号分别为:
Contig009284、 Contig016922、 Contig008105、 Con-
tig008104(图 1)。用 DNAman将 GH425与这 4条
序列进行拼接 ,一致性参数设为 85%。得到第一
轮拼接序列 GH425NO.1。把此序列再作为基因探
针 ,在小立碗藓数据库中继续搜索 ,无法得到新的
EST序列 ,说明此序列已经无法延伸了 ,既经电子
克隆得到了 GH425全长序列 。
图 1　GH425基因 Blastn结果
Fig.1　DistributionofBlasthitswithknownnucleotide
sequenceattheGeneBankdatabase
2.2　GH425基因 RT-PCR验证
用 ORFfinder分析 GH425NO.1(图 2),显示最
长 ORF为第 121bp至第 846bp之间的一条 726bp
片段 。
图 2　GH425NO.1开放阅读框分析
Fig.2　TheanalysisofGH425NO.1 inORFFinder
以最长 ORF为模板设计引物:
上游引物:CTACTCggTCTCTTTTCTgTAgC
下游引物:ATggACAAggTAgCCgAgC
对毛尖紫萼藓 cDNA进行 RT-PCR(图 3)。结
果显示 ,条带大约位于 750bp附近 ,这与模板长度
相吻合 ,由此证明毛尖紫萼藓 DNA包含有这段序
列 ,电子克隆成功。
图 3　GH425NO.1序列 RT-PCR验证
Fig.3　TheVerificationofGH425NO.1 byRT-PCR
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2.3　GH425基因功能分析
以 GH425NO.1序列为探针在小立碗藓核酸
数据库中进行 Blastn,获得了与之同源性最高的序
列 Contig009284,如图 4所示:
图 4　GH425NO.1序列 Blastn比对结果
Fig.4　DistributionofBlasthitswithknownnucleotidesequenceattheGeneBankdatabase
　　由此结果推断 ,小立碗藓与毛尖紫萼藓中都存
在 Contig009284序列 。用 ORFFinder分析 Con-
tig009284(图 5), 结果表明 GH425NO.1与 Con-
tig009284具有相同的 ORF,最长 ORF均为 726bp。
图 5　Contig009284开放阅读框分析
Fig.5　TheORFanalysisofContig009284
进入 NCBI主 页 , 选 择 Blastx工 具 , 以
GH425NO.1序列为探针 ,选择 Non-redundantpro-
teinsequences(nr)去繁冗数据库 ,然后点击 Blast。
结果如图 6所示:
结果表明 GH425NO.1最佳匹配的蛋白质序
列为 xp 001784835.1, 进 一步 点 击进 入 xp
001784835.1详细内容 ,显示 xp001784835.1是一
条长 220个氨基酸的蛋白序列 ,编码 eIF4E基因 。
3　讨论
本实验通过 GH425基因片段在小立碗藓核酸
数据库中进行电子克隆 ,得到了 GH425基因序列
全长 。用 ORFFinder对 GH425NO.1分析 ,以最长
开放阅读框设计引物进行 RT-PCR验证 , 结果表
明 ,在 750bpDNAmaker附近出现亮带 ,与最长开放
阅读框架大小一致 ,说明电子克隆成功 ,此片段属
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　第 4期 沙　伟 , 吴　力:编码真核启动因子 4E的毛尖紫萼藓基因 GH425电子克隆及验证分析　　　　　　
图 6　GH425NO.1blastx比对结果
Fig.6　DistributionofBlasthitsonGH425NO.1withknownproteinaminoacidattheGeneBankdatabase
于毛尖紫萼藓 。为了确定 GH425基因的功能 ,在
NCBI的核酸数据库中使用对 GH425NO.1进行
Blastx,搜索到与 GH425NO.1匹配的蛋白质序列
xp001784835.1 ,此蛋白质序列包含 220个氨基
酸 ,编码真核启动因子 4E。
对于绝大多数生命科学的科研工作者 ,生物信
息学无疑是一种强有力的工具 ,对已有数据的研究
一直是富有挑战性的重要课题[ 10] 。目前在大多数
情况下 ,研究者只能获得 EST序列或者较长的 cD-
NA序列片段 ,全长 cDNA序列的获得一直是制约
新基因发现的瓶颈 [ 11] 。通过筛选 cDNA文库 ,或
者通过 RACE等实验去获得新基因的全长 cDNA
序列都需要投入大量的人力和物力。同时 ,随着公
共数据库中的 ESTs数量的不断丰富 ,以计算机和
互联网为工具 ,利用现有的表达序列标签(EST)和
生物信息数据库 ,采用电子克隆的方法可以加速对
人类基因组未知功能新基因的发掘 ,为人类功能基
因组学与蛋白质组学研究提供新的线索和基
础 [ 12] 。
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